酵母菌雙鍵結構的變化，在我們將巨噬細胞可能產生的活性氧化物 (氫氧自由基、次氯
可以被廣泛的應用在白血球活性的量測，更可以進一步推廣至活體細胞及免疫疾病的檢 驗。
附錄
I 光譜儀校正步驟
為了使每天量測到的光譜在訊號強度及譜線位置維持固定，所以在每次實驗開始之 前，皆會對系統做基本的檢測及校正。
首先，我們必須確定每天光譜儀在波長位置上的表現是一樣的，這樣才不會造成每 次雖然量測相同物質，但是譜線位置卻不相同的情形。所以，我們利用一個已經明確知 道所有譜線位置的 Hg – Ar 光源，來校正我們光譜儀的位置。
步驟 1： 打開光譜儀控制程式 (Andor iDus)，並等待光譜儀後方之 CCD 降溫至負六 十度。
↓
步驟 2： 打開 Hg –Ar 光源，並連接至光譜儀收光用的光纖。
↓
步驟 3： 量取一張 Hg –Ar 光源的光譜，並和標準光譜做對照。
↓
步驟 4： 如兩者之間有位移，則打開光譜儀的校正程式 (Calibrate －＞ Manual X calibration)
↓
步驟 5： 將游標指向有位移的譜線上，並按下 capture 以抓取該譜線的位置，接著輸 入正確的譜線數值，最後按下 calibrate 完成校正。
540 560 580 600 620 640 660
In te n s ity
Wavelength / nm
Hg - Ar light
圖 I – 1 Hg – Ar 光源之光譜。
II 最佳化拉曼光譜系統之步驟
為了了解當天系統是否有重大變化而造成光譜量測效率變差，我們必須使用一個標 準的樣品來檢測系統效率。而在這邊我們利用的是聚苯乙烯微粒的光譜訊號，根據其特 徵譜線 (1001 cm-1，Breathing vibration of benzene ring) 當天量測到的強度，判斷系統有 無重大問題。
接著，由之前拉曼系統架設可知，在光進入光纖之前，架設了一組共焦光圈，由於 此共焦光圈的位置非常重要，稍微有點偏差，樣品的光譜訊號受到周圍培養液及細胞影 響會相當明顯。因此，在使用系統開始當天實驗前，也會測試當天共焦光圈位置是否正 確。使用的方法是量測在水溶液中的單顆聚苯乙烯微粒，如果在共焦光圈位置不對時，
將量到水在 3100 cm-1 ~ 3600 cm-1 很寬的譜線，及 1700 cm-1 之前不太平整的訊號，表 示此時共焦光圈選擇到的位置有部分在水溶液裡；相反的，如果共焦光圈選擇的位置正 確，即使在水溶液中，水的訊號亦不會有明顯的貢獻。這樣的比較可由圖 II - 2 理解，
在裝置了共焦光圈之後，雖然因為些許光 (非來自樣品焦點裡的訊號) 被其阻擋住，造 成最後訊號強度稍微降低，但是來自樣品之外 (例如水) 的訊號將有效的被消除。
1000 1500 2000 2500 3000
In ten s ity
Raman shift / cm
-1PS
圖 II – 1 聚苯乙烯微粒之拉曼散射光譜。
1000 1500 2000 2500 3000 3500
Raman shift / cm-1Without pinhole
In ten s ity
with pinhole
圖 II – 2 共焦光圈位置檢測。
III 排除雷射對所觀測酵母菌拉曼光譜強度變化之影響
不管在細胞內抑或是細胞外之光譜實驗，光譜量取過程我們會短暫施與雷射在酵母 菌上。我們必須確定所有量測到的酵母菌光譜變化，皆不是源自於雷射對酵母菌產生的 破壞。所以我們利用和兩種實驗情況 (細胞內及細胞外模擬) 下一樣的量取方式，在細 胞外正常培養環境，觀察單一酵母菌於此雷射照射下隨時間的變化情形。圖 III – 1 為 模擬細胞內實驗之對照組，在此條件之下，單一酵母菌於兩個小時的觀察時間之內，光 譜並無明顯變化。圖 III – 1 (B) 為拉曼光譜譜線 1651 cm-1 / 1441 cm-1 比例隨時間的統 計資料，從統計結果可以看到，在 2 小時內 1651 cm-1 比例只下降至 98.0% (標準差 5.0%，n = 10)，第 0 小時和第 2 小時相比並無明顯差異 (P = 0.24)。表示在此量測條 件下，酵母菌無明顯雙鍵受到破壞情形，所以可以確認在細胞內光譜變化之可信度，並 搭配之前做過的同位素取代及光譜貢獻分析，我們可以證明酵母菌光譜上的變化的確來 自於巨噬細胞對其之影響。而圖 III – 2 為模擬在細胞外添加活性氧化物時，酵母菌受 雷射影響的情形，同樣，從動態光譜我們沒有看到明顯改變。再從拉曼光譜譜線的強度 比例 (1651 cm-1 / 1441 cm-1) 變化 (圖 III – 2 (B))，可以得知在經過 30 分鐘後，1651 cm-1 只些微的下降至 97.4% (標準差 5.6%，n = 7)，第 0 分鐘和第 30 分鐘比較無明 顯變化 (P > 0.05 )。此結果顯示在添加活性氧化物的實驗條件下，雷射並無對酵母菌造 可破壞的情形，因此，同樣確認了光譜上的變化反映至活性氧化物對酵母菌的影響。
1 2 0 0 1 5 0 0 1 8 0 0 -significantly different from control, P > 0.05)。
1 2 0 0 1 5 0 0 1 8 0 0 -significantly different from control, P > 0.05)。
VI 脂質過氧化機制之簡介
由之前白血球吞噬酵母菌後，酵母菌光譜訊號隨時間變化的趨勢，我們歸納出此免 疫反應過程，促使酵母菌脂質組成中的雙鍵部份受到破壞，但是跟單鍵相關的訊號卻無 太大變化，因此，我們推論這個過程應該是屬於脂質過氧化 (lipid per-oxidation) 反應。
以下將對脂質過氧化機制做基本介紹，並探討此機制跟實驗結果的相關性。
以公式 VI – 1 ~ VI – 4 為例，這是一個多元不飽和脂肪酸 (PUFA，polyunsaturated fatty acid) 脂質過氧化反應的過程。如果多元不飽和脂肪酸受到自由基 (radical，R‧) 的 攻擊，其 C=C 旁的氫有可能會被自由基抓走，形成脂質自由基 (lipid radical，PUFA‧)。
並且原本處於 cis C=C 的脂肪酸長碳鏈，會折疊成 trans C=C 的形式，並和氧反應，
進一步形成脂質過氧化自由基 (lipid peroxyl radical，PUFAO2‧)。再來可能會有兩種主 要的反應途徑，第一種是脂質過氧化自由基從其他脂質上取得一個氫原子，形成脂質過 氧化物 (lipid peroxide，PUFAO2H)，而脂質過氧化物如果在過渡金屬 (如 Fe2+) 存在的 環境之下，會被轉變成脂質自由基，如此一來又可回到反應初期再被利用。另一個路徑 則是脂質過氧化自由基會經過一連串的環化 (cyclization)，形成內生環過氧化物(cyclic endoperoxide)，最後被水解 (hydrolysis) 生成丙二醛 (malondialdehyde，MDA)、
4-hydroxynonenal (4-HNE) 和各式各樣的烷類、醛類。其中丙二醛及 4-HNE 也是一般 生化檢測中，常被用來觀察脂質過氧反應程度的根據。
(VI – 2) (VI – 3) (VI – 4) (VI – 1)
另外，從 VI – 1 的圖解也能幫助我們更進一步從化學結構來了解脂質過氧化的過 程。並且，從圖中我們可以總結出，在一連串的脂質過氧化反應之後，原本帶有數個雙 鍵的不飽和脂肪酸，在 C=C 的位置會被氧化形成 C=O，導致 C=C 的數量減少，但是 單鍵的部分卻不會受到自由基攻擊，因此，並不會產生任何變化。這樣的結果和之前拉 曼光譜所得到的結論十分吻合，因為之前得到的光譜資訊告訴我們，在白血球吞噬酵母 菌之後，酵母菌脂質訊號中的 1265 cm-1 及 1651 cm-1 會有隨時間明顯下降的傾向，但 是 1300 cm-1 及 1441 cm-1 卻沒有明顯的變化趨勢。而經由更前面章節對酵母菌光譜訊 號的分析，1265 cm-1 和 1651 cm-1 分別代表 =CH bending vibration 及 cis C=C stretching vibration，皆和雙鍵有關。而 1300 cm-1 及 1441 cm-1 則是 –CH2 twisting vibration 和 –CH2 bending vibration，是和單鍵相關的訊號。機制和實驗結果皆表示，在 脂質過氧化傷害後，脂質雙鍵會受到破壞，而單鍵不會受到影響。
圖 VI – 1 脂質過氧化過程示意圖
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