結果與討論

並且，從圖中我們可以發現，無論在脂多醣刺激前後，巨噬細胞內帶有較強螢光的

噬 體 靠 近 、 補 充 有 關 。 因 為 從 文 獻 ⁵² 中 得 知 ， 巨 噬 細 胞 內 有 大 量 帶 有 細 胞 色 素 (flavocytochrom-b) 的囊泡，雖然其功能尚未確定，但是推測和細胞色素的儲存和運送 有關。在本實驗中追蹤的黃素蛋白就是該細胞色素的組成之ㄧ (參考圖 1 – 2)，我們觀 察到這些儲存黃素蛋白的囊泡向吞噬體 (酵母菌) 聚集，同時吞噬體膜上的黃素蛋白螢 光也被增強，這和文獻中推測該囊泡具有儲存和運送細胞色素的推測吻合。

為了更確定巨噬細胞內自體螢光來源，我們也量取了細胞內螢光的放射光譜。圖 3 – 5 為我們量取巨噬細胞內聚集在酵母菌旁螢光區域之螢光放射光譜，圖中紅色虛線為純 的 FAD 之螢光放射光譜，黑色實線則為巨噬細胞內之自體螢光放射光譜。從兩者之比 較可發現，其光譜特徵相似，但是聚集在酵母菌旁之螢光放射光譜較純的 FAD 寬，且 峰值有些許位移。我們推測這是因為 FAD 結合至 NADPH 氧化酶形成黃素蛋白後，

其結構受到周圍環境影響，而改變了螢光的放射特徵。並且我們量取到的巨噬細胞內自 體螢光放射光譜，其特徵也跟文獻^{17, 68}中相似。所以，我們可以確定細胞內螢光的來源 為黃素蛋白所造成。得到螢光影像上的結果，我們確定利用 NADPH 氧化酶產生活性 氧化物的方式，在白血球消滅入侵物的過程的確具有一定貢獻。

(A) Resting macrophages (B) LPS activated macrophages

0 100 200 300 400 500 600 700

Fluorescent intensity / area (cell)

(C) Statistic results

***

***: P value < 0.001 n = 17

resting LPS activated

圖 3 – 1 異物刺激後白血球自體螢光變化之影像及統計結果。(A)、(B) 上圖為自體螢光 影像，下圖為雷射穿透光影像。比例尺代表 10 μm。(C) LPS 刺激與否，巨噬細胞細胞 質之螢光強度與面積之比值。***： significantly different from control (P < 0.001)。

(A) Yeasts (B) Macrophages + LPS (C) Macrophages + LPS + yeasts

圖 3 – 2 吞噬作用後白血球自體螢光的分佈情形。(A)、(B)、(C)上圖為自體螢光影像，

下圖為雷射穿透光影像。比例尺代表 10 μm。(C) 圖中白色箭頭為酵母菌外圍具螢光之 薄層，紅色箭頭為具有自體螢光之顆粒。

(A) autofluorescence (B) bright field

圖 3 – 3 吞噬作用前後酵母菌周圍螢光之變化。白色箭頭為已受吞噬之酵母菌，紅色箭 頭為正在受吞噬之酵母菌。比例尺為 10 μm。

0 20 40 60 80 100 120 140

0 1 2 3 4

Intensity

Distance / μm

(A)

(B)

圖 3 – 4 受吞噬後酵母菌之橫截面螢光強度分析。(A) 圖左方為未受吞噬之酵母菌自體 螢光影像，右方為受吞噬之酵母菌自體螢光影像。紅色及藍色虛線為 (B) 圖中橫截面 螢光強度分析中所選擇之切面。比例尺為 1 μm。

500 550 600 650 700 750 0.0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Intensity

Wavelength / nm

圖 3 – 5 白血球細胞內自體螢光之放射光譜。右上角附圖為受白血球吞噬酵母菌之典型 自體螢光影像，圖中星號為量取螢光放射光譜的位置。紅色虛線則是純 FAD 之放射光 譜。

3 – 2 單一酵母菌被巨噬細胞吞噬後之動態拉曼光譜變化

著時間有減少的趨勢。因此，在下個章節，我們將對酵母菌拉曼光譜上的各特徵譜線作 分析，找出其代表的官能基振動模式，以解釋我們在此看到的變化情形。

1200 1500 1800 Raman shift / cm^-1

Intensity =CH -CH2

-CH2 C=C

0 h 1 h 2 h

00:04

00:00

20 μm 01:00

02:00

Time

圖 3 – 6 吞噬作用後酵母菌隨時間之拉曼散射光譜變化。右圖為酵母菌受巨噬細胞吞噬 之亮視野動態影像。紅色圓圈標示為一酵母菌細胞。左圖為此動態過程中各時間點之拉 曼光譜變化。

圖 3 – 7 吞噬作用後酵母菌 1441 cm^-1 訊號隨時間之變化。為圖 3 – 6 中拉曼動態光譜 之 1441 cm^-1 譜線強度隨時間變化情形。

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0.6

0.7 0.8 0.9 1.0 1.1

C= C ( 16 5 1 cm

-1

) / -CH

2

( 1441 cm

-1

)

Time / hours control

phagocytosed

******

圖 3 – 8 吞噬作用後酵母菌拉曼光譜中， 1651 cm^-1 和 1441 cm^-1 譜線強度比例隨時間 之變化情形。***： significantly different from control (P < 0.001)。***： significantly different from start (P < 0.001)。

3 – 3 酵母菌之拉曼光譜分析

別是 =CH bending vibration (1266 cm^-1)、–CH2 twisting vibration (1300 cm^-1)、–CH2

bending vibration (1441 cm^-1)、cis C=C stretching vibration (1651 cm^-1) 及 C=O stretching vibration (1740 cm^-1)。因此，從上個實驗所觀察到的結果，即 1266 cm^-1 和 1651 cm^-1 隨 時間會有變弱的趨勢，但 1300 cm^-1 與 1441 cm^-1 並無明顯變化，就可以解釋為酵母菌 受吞噬後，和碳鏈雙鍵相關的訊號會有下降的情形，而和碳鏈單鍵相關的訊號則無變 化。更進一步，我們推測此情形為酵母菌脂質組成上的 C=C 結構，在受到巨噬細胞吞 噬之後，遭到巨噬細胞產生之活性氧化物破壞的結果。

900 1200 1500 1800 Raman shift /cm^-1

Intensity

single yeast DLPC DOPC

C=OC=C

-CH2

-CH2=CH

圖 3 – 9 酵母菌拉曼散射光譜譜線解析。右列為 DOPC、DLPC 兩種脂質之化學結構，

以及酵母菌之亮視野影像。左列分別為上述三物之拉曼光譜。

3 – 4 利用同位素取代法證明巨噬細胞內之酵母菌為拉曼光譜變

水中培養的時間增長，2100 cm^-1 ~ 2250 cm^-1 訊號越來越強，這也更加確定此訊號的來 源的確跟同位素取代有關，並且隨著取代時間越長，其訊號表現越明顯，表示受到取代 之碳氫鍵越多。

在確定了同位素取代的效果無異之後，我們也重複了在細胞內的實驗，利用受過同 位素取代的酵母菌當作入侵物，隨著被巨噬細胞吞噬後不同時間點，量取其拉曼散射光 譜之變化。一來可以確認同位素取代是否對酵母菌受到破壞之狀況產生影響，再來即是 證明之前觀察到受吞噬之酵母菌碳鏈雙鍵受到破壞之情形，的確是反映自目標酵母菌本 身的光譜變化，而非巨噬細胞內之胞器往量測範圍靠近引起。最後，我們得到的結果的 確和先前沒有同位素取代之酵母菌相同 (圖 3 – 12) ，皆觀察到雙鍵訊號隨著時間有下 降的情形，並且從光譜中帶有的同位素訊號，我們也能確定所量測之位置的確是受到標 定之酵母菌。這樣的結果表示此種標定的方法不但有效讓我們確定光譜的來源，也不會 對酵母菌結構造成重大變化，而對觀察之過程有明顯影響。

1000 1500 2000 2500 3000 Raman shift / cm

^-1

D₂O

In te n s ity

DI water PBS

D₂O incubated yeast normal yeast

圖 3 – 10 同位素取代過後酵母菌拉曼光譜解析。最上方兩光譜右側為紅色方框區域內 之局部放大圖。

1000 1500 2000 2500 Raman shift / cm

^-1

In te n s ity

10 hours 24 hours 48 hours

圖 3 – 11 酵母菌隨同位素取代時間之動態拉曼光譜變化。紫色區域之拉曼譜線為 C-D stretching 之振動譜線。

1000 1500 2000 2500 Raman shift / cm^-1

0 hour

Intensity 1 hour

2 hours

圖 3 – 12 同位素標定之酵母菌在吞噬作用後之動態拉曼光譜變化。綠色區域為 C-D stretching 之拉曼譜線，紅色區域為碳鏈雙鍵相關之譜線。

3 – 5 培養液、酵母菌與巨噬細胞對所觀測拉曼光譜強度之貢獻

在做了同位素取代之後，我們還必須進一步了解，巨噬細胞內的複雜組成及細胞外 大量的培養液是否如預期對酵母菌拉曼光譜訊號無干擾。因此，我們在同一個巨噬細胞 的三個不同位置 (巨噬細胞外的細胞培養液、巨噬細胞之細胞質、巨噬細胞內有酵母菌 的位置)，以同一個高度為起點，作細胞 z 軸 (從細胞貼至蓋培養皿之細胞底部往上方 之細胞膜) 的光譜掃描，以分辨三種組成在拉曼光譜強度上之貢獻。圖 3 – 13 是以此 三種位置所量到的 C=C (1651 cm^-1) 光譜譜線強度和其 z 軸高度所畫出的關係圖。可以 看到在有酵母菌的位置，此光譜譜線的訊號強度比在培養液或巨噬細胞細胞質的位置強 很多，並且在只有培養液或巨噬細胞細胞質的位置，其訊號幾乎跟背景訊號強度一樣，

無太大貢獻。而用 –CH2 (1441 cm^-1) 光譜譜線強度來做比較的話，也得到同樣的結果 (文中沒有展現)。所以，由於光譜譜線強度上有極大的差異，使我們可以從實驗中得到 之酵母菌拉曼光譜變化，排除培養液和巨噬細胞細胞質的貢獻，確認光譜訊號的變化只 跟酵母菌本身結構改變有關。

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4

Intensity

Z position (μm)

圖 3 – 13 培養液、巨噬細胞細胞質、酵母菌在拉曼散射光譜中的貢獻 (1651 cm^-1, C=C)。右圖中不同顏色星號分別為培養液 (黑色)、巨噬細胞細胞質 (藍色) 及受巨噬細 胞吞噬之酵母菌 (紅色) 三個不同的量測位置。左圖為上訴三個量測 (顏色表示同右圖) 位置隨 z 軸變化的拉曼光譜譜線強度變化。

3 – 6 NADPH 氧化酶抑制劑 - apocynin 對巨噬細胞自體螢光

降之趨勢的確消失了。此實驗的結果展現 apocynin 對 NAPDH 氧化酶抑制後，由於 NADPH 氧化酶無法產生活性氧化物來破壞入侵物，使入侵物 (酵母菌) 組成上之碳鏈 雙鍵受破壞的情形消失。符合我們一開始認為 NADPH 氧化酶產生之活性氧化物為巨 噬細胞破壞入侵物之重要成分的假設，也說明了用拉曼散射光譜技術探究巨噬細胞破壞 入侵物能力的可能性。

而從自體螢光影像 (圖 3 – 17) 的部份，我們則是發現，不管細胞培養液內存在 apocynin 與否，巨噬細胞在吞噬作用後，吞噬體周圍的螢光皆有變強，且顆粒狀的自體 螢光物質同樣有聚集在吞噬體周圍的現象。因此，我們認為在巨噬細胞的 NADPH 氧 化酶受到抑制之後，巨噬細胞細胞質內之 FAD 組裝至吞噬體上 NADPH 氧化酶的功 能並不會受到阻礙 (參考圖 1 – 2)，而且攜帶細胞色素 (cytochrom-b) 的囊泡仍會往吞 噬體聚集，這使我們對 apocynin 抑制 NADPH 氧化酶的機制有更進一步的了解。

cytoplasm

Fe Fe

p22-phox

gp91-phox

Inactive form

p47-phox

p40-phox p67-phox Rac

GTP

apocynin

× ×

圖 3 – 14 apocynin 對 NADPH 氧化酶抑制方式示意圖。apocynin 阻擾了在細胞質中 的 NADPH 氧化酶次單元向膜上聚集，在不能完整組裝下，NADPH 氧化酶即失去其 產生活性氧化物的能力。

1200 1500 1800 Raman shift / cm

^-1

0 hour

In te n s ity

1 hour 2 hours

圖 3 – 15 施加 NADPH 氧化酶抑制劑後，受吞噬酵母菌隨時間之動態拉曼光譜變化。

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0.6

0.7 0.8 0.9 1.0 1.1

C= C ( 16 5 1 cm

-1

) / -CH

2

( 1441 cm

-1

)

Time / hours Control

LPS

LPS + apocynin

***

NS

圖 3 – 16 施加 NADPH 氧化酶抑制劑前後，受吞噬酵母菌拉曼光譜譜線 1651 cm^-1 /

1441 cm^-1 隨時間之變化。黑色方框為對照組、紅色三角形為在巨噬細胞培養液內添加

脂多醣之實驗組、綠色六邊形則為添加脂多醣及 apocynin 之實驗組。***： significantly different from control (P < 0.001)，NS： non-significantly different from control (P > 0.05)。

(A) control (B) apocynin treated

圖 3 – 17 施加 NADPH 氧化酶抑制劑對巨噬細胞在吞噬作用後自體螢光之影響。

(A)、(B) 上圖為自體螢光影像，下圖為雷射穿透光影像。比例尺為 10 μm。

3 – 7 利用化學方法產生活性氧化物模擬酵母菌氧化傷害與細胞

並持續量取其拉曼光譜之變化 (圖 3 – 18)。從動態光譜變化可以發現，這和受巨噬細胞 相同。第二，由於在利用 Fenton reaction 產生氫氧自由基時，會利用到過氧化氫，我們 想確認在進行 Fenton reaction 時，如果有過量的過氧化氫殘留，是否也會對細胞造成破 壞，以分辨氫氧自由基和過氧化氫的貢獻。圖3 – 19 展示了在 0.1 mM 過氧化氫下酵

是使拉曼光譜之 1265 cm^-1 及 1651 cm^-1 譜線隨著時間下降。而從拉曼光譜譜線強度 (1651 cm^-1 / 1441 cm^-1) 的統計結果 (圖 3 – 20 (B)) 可以看到，在 30 分鐘內 1651 cm^-1 比例下降至 64.6% (標準差 3.6%，n = 7)，第 0 分鐘和第 30 分鐘相比之下差異明顯 (P

= 2.2×10^-7)。這說明了在次氯酸環境下，酵母菌碳鏈結構上的雙鍵也同樣會受到破壞的 情形。也再一次證明拉曼光譜能夠用來量測活性氧化物對外來物破壞的情形，並且可以

= 2.2×10^-7)。這說明了在次氯酸環境下，酵母菌碳鏈結構上的雙鍵也同樣會受到破壞的 情形。也再一次證明拉曼光譜能夠用來量測活性氧化物對外來物破壞的情形，並且可以

在文檔中 利用「自體螢光成像」及「拉曼光譜」技術探討白血球噬菌動態過程 (頁 38-73)