背景介紹 - 利用「自體螢光成像」及「拉曼光譜」技術探討白血球噬菌動態過程

1 – 1 白血球與免疫系統之簡介

動、植物體利用所謂「免疫系統」以防衛微生物的入侵。一般的動植物皆具有兩層基本防衛體系：體表障礙和先天免疫系統 (innate immune system)。而脊椎動物又多了一道運作機制較複雜的後天免疫系統 (adaptive immune system)。

體表障礙正如其名，是由動植物體體表產生物理性、化學性或生物性的障礙來防止記憶的「先天免疫系統」，而先天免疫系統又可分成吞噬作用 (phagocytosis)、發炎反應 (inflammation) 及補體系統 (complement system)。

具備吞噬功能的細胞稱為吞噬細胞 (phagocyte)。白血球細胞中的幾種類型例如顆粒細胞 (granulocytes)、單核細胞 (monocytes)、巨噬細胞 (macrophages) 及樹突細胞 (dendritic cell) 便為吞噬細胞。當外來異物例如病菌入侵時，吞噬細胞會穿過微血管或微淋管進入組織間隙，並將病菌吞入形成所謂的吞噬體 (phagosome)。吞噬體會再與帶有酵素的溶酶體 (lysosome) 結合而形成所謂噬溶體 (phagolysosome)。最後病菌便會被溶酶體內的酵素或所謂「活性氧化物質」破壞。本研究的主題便在吞噬細胞利用「活性氧化物質」氧化外來異物之動態過程。

發炎反應是在病原體侵入後組織局部產生紅、熱、腫、痛的徵狀。造成發炎反應的原因是受傷的組織細胞釋放出組織胺，使附近的血管擴張並增大微血管之通透性。血管

擴張會增加血流量，進而帶來更多的吞噬細胞和具破壞病原體能力的免疫球蛋白。通透

並篩選出對抗原最具親和力的抗體。抗體的變異區 (variable region) 能與抗原形成專一性結合，阻止它感染正常細胞，並用另一端和巨噬細胞結合，使巨噬細胞吞噬已結合抗

1 – 1 – 1 巨噬細胞利用吞噬作用隔離入侵異物

抗體，使吞噬細胞可以更好清除致病原。

從以上的介紹可以知道，巨噬細胞不但能扮演清道夫的角色，主動清除入侵的病原體，還能變成傳令兵，吹響號角喚醒後天免疫系統，並和後天免疫系統互相配合，達到更佳的清除病原體效果，其在免疫系統的功能十分重要。

phagocyte

pathogen nucleus

lysosome

phagosome

圖 1 – 1 吞噬細胞 (phagocytes) 例如巨噬細胞 (macrophage) 對外來異物進行吞噬 之示意圖。外來入侵物受到巨噬細胞吞噬後，會存在由細胞膜摺疊組成的吞噬體內。

吞噬體會跟內有酵素和活性氧化物的溶酶體結合，形成噬溶體。入侵物就會被這些酵素和活性氧化物破壞導致死亡，最後再被巨噬細胞排出。

1 – 1 – 2 巨噬細胞製造活性氧化物質消滅入侵異物

由前面章節所提到的資訊，我們知道白血球消滅入侵物的方法，是利用溶酶體裡面的酵素和所謂的活性氧化物質 (reactive oxygen species, ROS) 來破壞入侵物，最後導致入侵物死亡^1-3。接下來我們將進一步介紹白血球內產生活性氧化物質的過程。

白血球內產生活性氧化物質的媒介是 NADPH 氧化酶 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase, NADPH oxidase) 。 NADPH 氧化酶有時又稱為 respiratory burst 氧化酶，是一個連接在細胞膜或是吞噬體膜上的酵素複合體。NADPH 氧化酶由六個單元組成⁴，包括 Rho guanosine triphosphatase (GTPase, Rac1 或 Rac2)，

以及五個 phox (phagocytic oxidase) 單元，gp91phox、p22phox、p40phox、p47phox 和 p67phox。

NADPH 氧化酶的主要功能是將細胞質中的 NADPH 氧化，並將吞噬體內的氧氣轉變成超氧化物 (O2-)。如圖 1 – 2 所示 cytochrome-b 是 NADPH 氧化酶其中的一部分。cytochrome-b 由 gp91phox 和 p22phox 在膜上組成，cytochrome-b 的其中一個還原中心接了 FAD (flavin adenine dinucleotide)⁵。NADPH 氧化酶就透過 NADPH 及 FAD 等物質間的電子交換，最後將氧氣轉變成超氧化物。在產生超氧化物後，白血球細胞會繼續將超氧化物轉換成過氧化氫 (hydrogen peroxide, H2O2)。過氧化氫可在其他酵素例如 myeloperoxidase (MPO) 作用下變成次氯酸 (HOCl) ^{6, 7}。這些和氧相關的氧化物統稱為活性氧化物質 (ROS)，是白血球用來攻擊入侵物的一項重要武器。

NADPH 氧化酶活化時，p47phox、p67phox 和 GTPase 等原本存在細胞質中的物質會開始向原本結合在膜上的 cytochrome-b (gp91phox 和 p22phox 組成) 移動並與其結合⁸，以造成電子的傳遞，最終導致氧氣被轉變成超氧化物。

cytoplasm

NADPH oxidase

Phagosomal Phagosomal Intracellular

Intracellular

NADPH

NADP

⁺

+ H

⁺

O

₂

O

₂

-H

₂

O

₂

FAD

HOCl

OH

^•

圖 1 – 3 組裝完成之 NADPH 氧化酶透過氧化細胞質內的 NADPH 在吞噬體內產生活 性氧化物的過程。

1 – 1 – 3 白血球功能異常之相關疾病

由前面對免疫系統的介紹，我們可以了解白血球對人體防衛系統的重要性，所以，

一旦白血球功能不正常，人體對外來物的抵抗能力就會減弱，容易造成疾病的產生。以下就介紹幾種因白血球功能異常的疾病。

(1) 慢性肉芽腫 (chronic granulomatous disease, CGD)：

慢性肉芽腫是一種遺傳性的疾病，遺傳模式有三分之二是性聯隱性遺傳，另外三分之一是體隱性遺傳，所以發病的患者大部分是男性，女性易為隱性帶原者，較少發病。

之前我們介紹過，白血球是藉由產生活性氧化物質來消滅病原體，而產生活性氧化物的重要關鍵為 NADPH 氧化酶，慢性肉芽腫的病因是因為 NADPH 氧化酶的部分次單元 (cytochrome-b、p47phox、p67phox 等) 有缺陷，造成其無法被正常用來產生活性氧化物。

所以在這樣的患者，其白血球雖然能正常的吞噬病原體，但是卻沒有足夠的活性氧化物來清除它，因此特別容易受到微生物感染，例如沙門氏菌、具有催化酶的金黃色葡萄球菌等。而由於其容易受到微生物的反覆感染，所以會在其肺臟、肝臟等地方發現膿傷。

(2) Chediak-Higashi 症候群

又稱為遺傳性白血球顆粒異常綜合症，這種病的病因雖然還沒有明確得知，但是一般科學家認為這跟 LYST 基因的變異有關。LYST 是用來指示 lysosomal trafficking regulator 這種蛋白質製造的基因，而此種蛋白質會控制物質運輸進入溶酶體。所以在 LYST 無法正常運作下，溶酶體無法正常和吞噬體形成噬溶體。因此，在這種疾病下，

微生物就算被吞噬進入白血球，也沒有辦法被溶酶體內的酵素和活性氧化物清除，所以造成跟慢性肉芽腫一樣，很容易受到微生物反覆感染。

(3) 免疫球蛋白 E 過多症 (hyperimmunoglobulin E syndrome)

免疫球蛋白 E 是造成大部分過敏反應的原因，過敏反應起始於過敏原與結合在白血球細胞表面的免疫球蛋白 E 接觸後，激發白血球細胞釋放出抗阻織胺、前列腺素及調節細胞的細胞素等，這些物質都能造成發炎的效應。而在免疫球蛋白 E 過多症中，

其原因尚未清楚，一般猜測有可能是細胞性免疫失調造成免疫球蛋白數量過多，而產生過多的組織胺，或 T 細胞產生趨化抑制因子，而使吞噬細胞功能不良。常見的症狀為慢性濕疹樣皮膚炎及反覆的細菌感染。

(4) myeloperoxidase (MPO) 缺乏症

由前面章節可知，在 NADPH 氧化酶利用氧氣產生超氧化物 (O2-) 之後，白血球內仍有其他酵素會利用超氧化物或過氧化氫 (H2O2) 產生其他的活性氧化物質，

myeloperoxidase 就是其中一個。myeloperoxidase 會在過氧呼吸過程利用過氧化氫和氯離子產生次氯酸 (HOCl)，而次氯酸亦是白血球用來消滅外來物的利器之一。雖然嚴重性不如 CGD，但是 MPO 缺乏症也會造成消滅微生物能力下降，而使患者易受感染。

由以上的疾病介紹可以發現，這些跟白血球相關的疾病，大部分均不影響白血球原有的吞噬能力，而是造成其破壞入侵物能力的下降。所以，如果單純觀察白血球吞噬能力的變化，是無法察覺這些疾病的存在。並且，這些疾病並不是讓白血球破壞病菌的能力完全消失，而是降低其效率，所以我們也需要一個可以直接定量白血球破壞能力的指標，幫助我們檢測出疾病的存在。但是，這也是現有技術比較缺乏的部份。

1 – 2 相關研究之文獻回顧

其他還有像輔酶 (NAD(P)H)、彈性蛋白 (elastin) 還有胺基酸 (tyrosine、tryptophan 等) 也都有自體螢光的現象。而這些物質的激發波長大約在 300 ~ 500 nm (單光子激發) 和

而自體螢光光譜及影像也常被用在組織、疾病上的探討，尤其是針對癌症的探討。刺激胰島素分泌的研究，而因為此行為與糖解作用 (glycolytic cycle) 及克氏循環 (Kreb’s cycle) 皆有相關，所以他們分別對細胞質及粒腺體受葡萄糖影響後做探討，並且發現在細胞質中因葡萄糖刺激而造成的 NAD(P)H 濃度增加約 7 μM，而在粒腺體中約 60 μM，且反應時間比在細胞質中慢約 20 秒。2004 年¹⁶，此團隊利用另一種自體螢光物質 LipDH 的幫助，分辨出 NADH 及 NADPH 的貢獻。並且利用此方法證明了丙酮酸並不會使粒腺體內 NADH 有明顯增加的情形。 2002 年 Huang 等人 ¹⁷，對

NAD(P)H、FAD、LipDH 等自體螢光物質做了完整的激發光譜、放射光譜及 cross-section

化，更進一步驗證他們所發現和生命現象相關的拉曼譜線。

而在組織層次上的應用，2003 年 Huang 等人³⁰，將拉曼用於肺癌的檢測。並發現在癌症組織區域的核酸及兩種脂肪酸 (tryptophan, phenylalanine) 之訊號較正常細胞豐富，但是磷脂質及 proline 和 valine 則較正常細胞少。在 2000 年 Hanlon 等人³¹的回顧文章中，也將拉曼在動脈粥狀硬化症、乳癌以及阿茲海默症上的研究做詳細回顧。而我們實驗室之前的研究裡，也將拉曼用於皮膚組成³²以及肝臟脂質³³的成分分析。

但是拉曼光譜訊號強度微弱一直是科學家們想解決的問題，因此，各種增強拉曼訊號的方法就被逐漸提出。例如共振拉曼光譜技術 ^{34, 35} (resonance Raman spectroscopy, RRS)、表面增強拉曼光譜技術^{36, 37} (surface-enhaned Rama scattering, SERS) 及同調反史托克拉曼散射技術32, 33, 38, 39 (coherent anti-Stokes Raman scattering)。共振拉曼光譜相較於非共振拉曼光譜而言，在於其將物質分子激發到電子激發能階上，而非共振拉曼光譜只激發到虛態能階上，經過此種激發過程能有效的將拉曼訊號放大。表面增強拉曼是利用金屬表面因表面電漿共振 (surface plasmon resonance) 所形成的增幅電場，提升物體表面受測分子的拉曼訊號。同調反史托克拉曼散射技術是一種非線性光學的過程，原理是

微脂體位置⁴⁷；也有人用來觀察白血球吞噬入侵物後，細胞內產生物質和入侵物間的關

cytochrome-b 會圍繞在入侵物周圍，這表示吞噬體的形成。並且處在細胞質中的次單元 p67phox、p47phox 等也會往吞噬體靠近。在經過實驗之後，他們認為產生活性氧化物過程的起始，和 p47phox 的磷酸化及向吞噬體轉移的動作有關，並且此過程的中止和 p46phox 及 p67phox 從吞噬體離開有關。在 2009 年 Casbon 等人 ⁵² 則是觀察了

在文檔中利用「自體螢光成像」及「拉曼光譜」技術探討白血球噬菌動態過程 (頁 11-30)