研究材料與研究方法

第二節 研究材料與研究方法

2.2.1 研究材料

Sodium dodecyl sulfate(SDS)購自 UniRegion Bio-Tech, Ethylenedinitrilo, tetra-acetic, disodium salt(EDTA)及 sodium chloride (NaCl)購自台灣生工有限公司 (MDBio, Inc.), sodium hydroxide (NaOH)由默克公司代理，購自德國 Merck 公司, sodium acetate(NaOAc) 購自德國 Riedel-deHaen 公司， Phenol 購自台灣皓峰公 司, chloroform 購自 chemical 公司, ethanol absolute 購自西班牙 Panreac Quimica 公司，DNA 萃取試劑 Genomarker reagent 購自台灣真興公司。

2.2.1.2 聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)及限制酶長度基因多

型性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)

dNTP, PCR 10倍反應緩衝溶液(10× reaction buffer),及 Taq DNA polymerase 購自美國 MD Bio公司, 引子(primer)購自台北明欣生物科技有限公司(MB MISSION BIOTECH)，Msp I 限制酶購自日本 TaKaRa-Bio公司。

2.2.2 檢體收集

本研究實驗組收集了於眼科接受眼翳切除手術後，經福馬林固定及石蠟包埋 切片的檢體共205 個，包括 136 個來自男性病患的檢體及 69 個來自女性病患的 檢體，所有的眼翳檢體之前都未接受過手術治療，沒有包含手術後復發的病患在 內，年齡分布從52 歲到 85 歲，平均年齡 74.2 歲；對照組來自 206 位沒有罹患 眼翳或者眼裂斑(pinguecula)患者的周邊血液檢體，來自 126 位男性及 80 位女性，

平均年齡62.0 歲(年齡分布從 55 到 85 歲)。

2.2.3 研究方法

實驗組的 DNA由石蠟包埋的眼翳切片組織中萃取出來，將 DNA溶解緩衝 液(DNA lysis buffer)加到從石蠟萃取出來置於玻片上的眼翳上皮組織，將組織完 全水解，再將溶解後含 DNA的組織液吸取至1.5ml微量離心管(Eppendorf tube)

儲存，加入5 μl 蛋白酶K (proteinase K) (10mg/ml)於56℃作用2小時，之後以傳統 的phenol/chloroform 法除去蛋白質。首先加入500 μl的酚/氯仿混合液

(phenol:chloroform = 25:24)充分混合使蛋白變性，因 DNA不會溶於酚或氯，且 酚或氯比重比水大，以12,000 rpm離心15分鐘後，上面為水層下面為 phenol及 chloroform層，取上清水液再加入500μl chloroform / isoamyl alcohol (24:1) 洗去殘 餘之 phenol，充分混合後以12,000 rpm離心15分鐘分離 chloroform，取上清水溶 液，再加入50 μl 3M 醋酸鈉(NaOAc )(PH 5.2)中和 DNA上的負電荷及1 ml的 100%冰酒精，於-20℃冰箱作用30分鐘，藉以將 DNA沉澱出，再以12,000 rpm離 心20分鐘後小心倒掉上清液，並加入500 μl 70% alcohol洗去殘留之鹽類，因 DNA 不溶於70%酒精，鹽類會再被溶出，再以12,000 rpm離心20分鐘後倒掉上清液，

並以真空抽乾殘餘的水分，所得之白色沉澱物即為 DNA。將沉澱出來之 DNA 以無菌水(dd Water)溶解並以紫外線光譜儀測定 DNA在260 nm和280 nm的吸光 值，其A260/A280比值應在1.6到1.8之間。若比值小於1.6則表示蛋白含量過高，應 再以 proteinase K處理後重複上述萃取步驟；若比值大於1.8則表示 RNA含量過 高，則應再以 RNase 處理後重複上述萃取步驟。DNA的濃度以下列的公式計 算：DNA (μg /ml) =A260 ×50 ×稀釋倍數。DNA萃取完成後，溶成濃度為1 μg /μl 置於-80℃冰箱保存，以用於 DNA基因多型性之分析用。

2.2.3.2 聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction)

聚合酶連鎖反應所用的材料包括: 欲放大的檢體 DNA 1μl當模板, 0.5 mM dNTP, 5 μl 10× reaction buffer, 2.5 U Taq polymerase 及 0.5 mM 引子。

第一步先在94 °C加熱5分鐘，接著是35個循環反覆於以下步驟:

Denaturing: 94 °C 30秒，打斷鹼基對間的氫鍵使分離為單股 DNA Priming: 60 °C 45秒，降溫至60 °C 使引子能夠黏上單股 DNA，提供

3`OH端讓DNA聚合酶能開始合成 DNA

Extension: 72 °C 1分鐘，此為 Taq DNA聚合酶反應最適之溫度，加快 DNA聚合酶合成DNA的速度

最後以72 °C 6分鐘做最後一次的 extension反應時間。

2.2.3.3 CYP1A1 基因多型性之分析

CYP1A1 基因多型性之分析是利用 PCR-RFLP (restriction fragment length

polymorphism)方法，將所得之 PCR 產物取 12.5 μl，10x reaction buffer 1.5 μl 及限

制酵素1 μl 於 37℃反應 4 小時，以 1.5 % agarose 膠體進行電泳分析，引子序列 及限制酶之使用如下列所示[58]：

CYP1A1：

S 5'-CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT-3' AS 5'-TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT-3'

限制酶：Msp I

所設計的引子將放大CYP1A1第266個鹼基至第605個鹼基，為一段340bp長的 片段產物，而限制酶：Msp I 所辨識的序列為一CCGG的雙股反向重複序列(reverse palindrome)，MspI會切在CC之間，CYP1A1基因上第400個鹼基在野生型(wild type) 為T鹼基，在變異型則有C鹼基(包含同型合子C/C及異型合子T/C)(T6235C)，會使 得原本CTGG的序列變成CCGG序列，且為CYP1A1上唯一的一段CCGG序列，使

得Msp I限制酶會將變異型DNA序列切成2段，一段長206bp，另一段長134bp(圖 二)。

因此限制酶 Msp I 多型性的結果判讀如下所示：

同型合子野生型 homozygous wild type(T/T): 340 bp 長的產物 異型合子變異型heterozygous (T/C) : 340 bp, 206 bp, 134 bp 長的產物

同型合子變異型homozygous mutant type (C/C): 206 bp, 134 bp 長的產物

2.2.3.4 GST M1 基因多型性之分析

GST Mu1 gene 是一個約 11kb 長的 gene，常見的基因型變異是整段 GST M1

基因缺失的變異，形成所謂的 GST M1 不表現型基因型，一篇統合分析的研究 [73](meta-analysis)分析了 30 個各別研究，發現高加索人有高達 53%是這種 GST

M1 不表現型基因型，亞洲人的比例也相似。造成此一變異的原因是因為 GST

M1 基因的 2 側各由一段長 4.2kb 幾乎相同的序列所包圍，GST M1 基因的缺失變

異就是由此2 相似的序列同源重組(homologous recombination) 所造成[66](圖 一)。因所設計出來的專一性引子是用來放大 GST M1 序列內一段 165bp 長的片 段，所以PCR 產物有 2 種結果，一是檢體 DNA 序列沒有缺失性變異，可以放大 出標的片段165bp，此即為表現型基因型(present type)；另一種是檢體 GST M1 DNA 序缺失性變異，無引子可辨識序列，沒有 PCR 產物，此即為 GST M1 不表 現型基因型。在PCR 後，如果沒有產物片段，為了避免是因為 PCR 失敗，沒有 放大出產物片段而非真正的 GST M1 不表現型基因型，將沒有產生 PCR 產物的 檢體DNA 重複 PCR 反應，除了原本的 GST M1 引子外，再加入一組 β-actin (ACTB) 的引子，以確認β-actin 有被 PCR 放大，PCR 反應成功，GST M1 沒有產物是不 表現型基因型所產生。

GST M1 PCR反應條件如下：

100 ng DNA, 0.5 mM dNTP, 5 μl PCR10×reaction buffer, 2.5U Taq polymerase及0.5 mM 引子，可參考Groppi, A.等之文獻[74]。將所得之PCR產物以2% agarose膠體 電泳進行結果分析，引子序列如下列所示：

GST M1：

S 5’-GAAGGTGGCCTCTCCTTGG-3’

AS 5’-AATTCTGGATTGTAGCAGAT-3’

結果之判讀如下所示：

表現型 wild type: 165 bp product 長的產物 不表現型 null type: 無 PCR 產物