第一章 前言
第一節 研究背景
第一節 研究背景
1.1.1 眼翳(pterygium)的臨床表徵及流行病學
眼翳或稱翼狀贅片是一種在結膜上往眼角膜不正常慢性增生的翼狀組織(圖 一)，盛行率(prevalence)從 0.3%到 29%都有研究報告過[1, 2]。眼翳 pterygium 源 於希臘字 pterygos，翼的意思，因為臨床外觀狀如翼(wing-shaped)，為隆起皺摺 的結膜伴有纖維血管(fibrovascular)增生的慢性發炎組織，翼狀或三角尖端朝向眼 角膜，會慢慢往眼角膜上生長，進而遮蔽視線或者造成散光影響視力[3]，眼翳 本身因為發炎與不平整的特性也使得眼睛易有乾澀不適等症狀[4]，眼翳通常長 在角膜邊輪部(limbus)的眼裂間(interpalpebral fissure)3 點及 9 點的位置，又以鼻 側居多[5]。
1.1.2 眼翳發生的危險因子
眼翳的發生目前最被廣為接受的環境因素為紫外線照射，特別是紫外線B，
[5, 6]，流行病學的調查在赤道南北緯 37°間，紫外線暴露相對較高的地區，發現 有較高的眼翳發生率，就好像有一個相對的眼翳盛行區帶”眼翳帶” (pterygium belt)一樣[7]，職業上，眼翳跟一些比較常在戶外工作與紫外線暴露的職業有關連
如畜牧工、牧場雜工、鋸木工、勞工以及電焊工等[8-10]，其他如乾燥環境、風 沙等所造成的微創傷說[5, 11]以及與人類乳突病毒(human papilloma virus, HPV) 感染相關也有人提出[12]，另外也有人提出不同的研究結果[13, 14]，但均不如紫 外線暴露的傷害學說，有較廣泛一致的共識。
1.1.3 眼翳的病理組織學
組織學上，眼翳的上皮細胞會侵犯眼角膜並表現出鱗狀上皮化生(squamous metaplasia)以及杯狀細胞的增生(goblet cell hyperplasia)，眼翳的上皮細胞會侵犯 眼角膜的 Bowman 氏層(Bowman’s layer)，造成 Bowman 氏層的破壞，並且有大 量異常彈性蛋白纖維(elastic fiber)的產生與沉積(elastodysplasia)以及退化(elastoid degeneration)[15]，另外，還有纖維母細胞(fibroblast)的增生與浸潤、淋巴球的浸 潤[16]。
1.1.4 眼翳的發生假說
Coroneo 提出二階段眼翳病理發生的假說，認為眼翳的發生第一階段先是輪 部角膜-結膜上皮屏蔽開始與持續的破壞，第二階段是角膜持續的結膜化
(conjunctivalization)[17]。關於第一階段輪部角膜-結膜上皮屏蔽的破壞，有研究 發現由於眼角膜聚光的光學特性，從眼顳側周邊來的光線因角膜弧度與前房深度 的不同有機會聚焦於眼角膜鼻側的輪部，據估計此聚焦處的光強度約為入射處的
20 倍，或者可由顳側周邊穿過前房及鼻側水晶體的路徑，越過表淺上皮細胞的 保護而直接由內照射到鼻側輪部較深的基底上皮細胞(basal epithelium) [5, 18, 19]，進而造成局部輪部角膜-結膜上皮屏蔽的破壞，先前有研究利用免疫組織染 色法 (immunohistochemical stain)，發現在眼翳尖端於眼角膜 Bowman 氏層受侵 犯處找到了變性的輪部幹細胞(limbal stem cell)[20]。第二階段是角膜持續的結膜 化(conjunctivalization)，包括廣泛的細胞增生、發炎反應以及結締組織的重塑與 血管新生等[16, 17]，這些特性以及眼翳在手術切除後經常復發[21]，治療時也常 用到癌症藥物抗細胞分裂的mitomycin c 處理[22, 23]，以及眼翳組織會局部侵犯 眼角膜的Bowman 氏層與淺層基質層等等特性，跟以往認為眼翳只是單純的退 化性疾病[15, 24]有很大的不同。
1.1.5 眼翳是一種增生性疾病
最近的研究指出，眼翳並不只是退化性疾病，更像增生性疾病(proliferative disorder)，p53 gene 為腫瘤抑制基因(tumor suppressor gene)，調控細胞週期與複 製並與許多腫瘤的發生有關[25]，利用免疫組織化學染色，可在眼翳上皮細胞[26, 27]以及輪部幹細胞中[28]，發現 p53 蛋白的表現，本實驗室利用 DNA 定序的方
法在眼翳組織中發現 p53 腫瘤抑制基因的突變，51 個檢體中共有 15.7%有 p53 基因的突變且大部分為點突變[29]，另外，眼翳組織也發現比正常結膜有較廣泛 的生長因子表現，包括鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,
bFGF)，血小板衍生生長因子 (platelet derived growth factor, PDGF)，轉化生長因 子-β(transforming growth factor-β,TGF-β) 以及細胞激素(cytokine): 腫瘤壞死 因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α) [30]，而 TNF-α可以促進血管新生與纖維 母細胞膠原蛋白產生[31]，這些生長因子與細胞激素的表現，或許可以解釋眼翳 形成第二階段的角膜持續的結膜化作用，也就是在疾病生成的過程中，經由這些 生長因子與細胞激素的作用，廣泛的增加細胞增生、發炎反應以及結締組織的重 塑與血管新生等作用[17]，在眼翳組織也發現有 Matrix metalloproteinases (MMPs) 及其專一性組織抑制因子(Tissue inhibitors of metalloproteinase, TIMP)的表現，
MMP 跟 TIMP 是參與胚胎發育[32]、血管新生[33]、傷口修復[34]以及腫瘤發生 [35]等結締組織重塑的重要因子，在體外培養的眼翳上皮細胞實驗中，可發現 interleukin-1 及 TNF-α會增加 MMP-1 以及 TIMP-1 mRNA 與下游蛋白的表現 [36]，而紫外線的暴露會引起眼表面前發炎細胞激素(pro-inflammatory cytokine) 的產生[37, 38]，這些研究提供了更進一步的證據支持眼翳是增生性疾病，而不 是單純的退化性疾病[26, 39]。
1.1.6 眼翳研究的重要
台灣位屬亞熱帶地區，日照充足加上近年臭氧層破壞，使紫外線暴露與紫外 線暴露相關疾病更受到重視[40]，眼翳是眼科常見與紫外線暴露相關的疾病且在 手術後容易復發[41]，目前的治療方式包括手術切除與術中或術後投予抗細胞分 裂藥物如 mitomycin-c 等來預防復發，不過 mitomycin-c 之使用曾有嚴重副作用
之報告[42]，根據世界衛生組織的 Vision 2020 計畫的精神要減少可避免的視力 喪失眼睛疾病，眼翳雖未列入其10 大目標疾病，但眼翳對視力的影響也是一種 可避免的視力喪失疾病，目前對眼翳發生的確實病理機轉並不完全了解，眼翳除 了對視力的影響外，由於眼翳與陽光相關皮膚傷害顯著關聯性的研究實証[43]，
眼翳可能是日照增加的早期證明[5]，因此眼翳的研究與處理儼然成為一項重要 的公共衛生問題[17]。
1.1.7 多環芳香烴化合物(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAH)
多環芳香烴(PAH)是芳香族碳氫化合物的一種特例，由不包含雜環或取代基 2 個或 2 個以上緊鄰的芳香環所組成，多環芳香烴化合物是有機物不完全燃燒、氧化所產生如車輛廢氣、火力發電、垃圾燃燒、工業廢物、石油污染、吸煙甚至 食物烹煮等等，並且普遍存在於環境中(國際癌症研究中心 IARC1983 年報告)。
職業環境若長期暴露於PAH，將導致肺癌或者其他癌症產生機會的提高，特別 是在接觸到焦煤、瀝青、汽油等等物的職業。其中有很多是已知或潛在的致癌物 質 [44]。
1.1.8 多環芳香烴化合物
苯并(a)芘(Benzo(a)pyrene, BaP)與 BaP 的代謝
苯并(a)芘（BaP）是第一個被發現且最廣為研究的 PAH類化學致癌物質，台灣空氣中的懸浮微粒子被發現有較高含量的多環芳香烴，包括苯并(a)芘等[45,
46]，BaP的代謝酵素可分為第一期與第二期酵素(phase I and phase II enzyme)，為
了將人體內的藥物或者有毒物質排出體外，先要將這些物質變成親水性或使極性 增加，phase I的酵素即透過氧化(oxidation)、還原(reduction)、水解(hydrolysis)等 方法進行，但在這個代謝過程有時反而產生更不穩定與易致癌的物質，phase II 反應主要為接合反應(conjugation)，phase II酵素透過與在 phase I 反應所產生的 極性功能基(polar functional groups)，將致癌化合物轉變成親水性的代謝物而排出 體外，phase I 的酵素如：cytochrome p450 1A1, 2C9 及 3A4，phase II 的酵素如 麩胺硫轉移酵素 (glutathione-S- transferase, GST) [47, 48](附錄 圖一)。
1.1.9 BaP 可造成 p53 基因的突變
BaP 及其代謝中間產物被發現會造成 p53 突變及導致肺癌，BaP 的代謝中間 產物之一BaP 7,8-diol 9,10-epoxide (BPDE)是一種極具活性的致癌物質，BPDE 會攻擊 p53 基因中的鳥糞嘌呤鹼基(guanine base)並形成 DNA 共價鍵結物 (DNA adducts: BPDE-N2-dG adduct)，原本應與胞嘧啶(cytosine)形成鹼基對的鳥糞嘌呤 (G ≡ C)，被修飾後變成與腺嘌呤(adenosine)配對(G’ ＝A)，在下一次的 DNA 複 製中，胸腺嘧啶(thymine)再與 adenosine 配對(T ＝ A)，導致 p53 (G ≡ C) Æ(T
＝A)的點突變[49, 50]。
1.1.10 單一核甘酸多型性(single nucleotide polymorphism，SNP) 簡介
在人類基因體(genome)遺傳訊息約3x10^9個鹼基序列中，超過99.9%以 上的鹼基序列是完全相同的[51]，剩下的這些序列變異類型包含有插入(insertion) 變異、刪除(deletion)變異、重複序列次數變異、單一鹼基變異等[52, 53]。重複序 列次數變異例如短縱列重複序列(short tandem repeat，STR)及數目變異縱列重覆 序列(variable number tandem repeat，VNTR)等[54]；單一鹼基變異是基因體中存 在最多的變異形式[55, 56]，當 DNA序列上的某一基因座(loci)具有兩種或者以上 的對偶基因(allele)，且其存在族群中的比例(即對偶基因頻率(allele frequency))大 於1%時，稱此基因座具有多型性(polymorphism)，此單一核甘酸長度的多型性稱 為單一核甘酸多型性(single nucleotide polymorphism, SNP)[56]，可以發生在基因 中任何位置，包含exon、intron、啟動子(promoter)及非編碼區(non-coding region)。1.1.11 細胞色素 P450 1A1 基因(cytochrome P450 1A1, CYP1A1)多型 性和其蛋白表現
CYP1A1 基因位於人體第 15 對染色體 15q24.1 的位置，屬於 phase I 的代謝
活化酵素，是細胞代謝 BaP 的主要酵素，CYP1A1 會將 BaP 氧化成為環氧化物 exposide：BaP-7,8-diol-9,10-epoxide (BPDE)以利接下來 phase II conjugation 反 應，使其易溶於水並排出體外，但 BPDE 是一個極不穩定的中間物質，易與 DNA 鍵結形成 DNA adduct 而造成細胞的基因表現異常或甚至轉形癌化。
據Landi, M.T 等報告，CYP1A1 基因於 MSP I 限制酶辨識位置的 TÆC 的多 型性會造成 CYP1A1 酵素活性的增加[57]，使 BaP 氧化成高毒性 BPDE 的速度增 加，如果下游phase II 酵素接合反應速度小於 phase I 酵素反應速度，可能使高毒 性中間產物BPDE 累積時間加長，讓 DNA 有較高機會接觸到 BPDE 形成共價鍵 結BPDE-like DNA adduct。CYP1A1 基因於 MSP I 限制酶辨識位置的 TÆC 的多 型性也會使口腔癌[58, 59]、大腸癌、乳癌及肺癌[60, 61]等的致癌率提高。
CYP1A1 MspI 多型性 (T6235C)位於 3’端不轉譯區(3’untranslated region,
3’UTR)，屬於單核苷酸多型性中的非編碼單核苷酸多型性(non-coding SNP)，然
而為何此多型性會影響CYP1A1 蛋白的表現，並進一步引響 BPDE-like DNA 的 含量? 3’端不轉譯區為 DNA 序列轉譯終止密碼(stop codon)到最後轉錄中止 (transcription termination)間的 DNA 序列，包括多聚腺苷酸化訊號(polyadenylation signal)，在基因構造中，5’端不轉譯區(5’UTR)經常包含基因表現的調控因子，如 motifs, boxes, response or binding elements 等，3’端不轉譯區雖然沒有這些特別的 基因表現調控因子，但是卻也參予基因表現的調控，3’端不轉譯序列可以調控細 胞核運輸 (nuclear export)、多聚腺苷酸化狀態(polyadenylation status)、subcellular targeting, 甚至 mRNA 的轉譯或者分解速度 (rates of translation and degradation of mRNA) ， 又 叫 可 稱 為 細 胞 質 多 聚 腺 苷 酸 化 元 素 (cytoplasmic polyadenylation elements) 或 腺苷酸化控制元素(adenylation control elements)[62, 63]，許多半生 期短的mRNA，常含有約 50 個核甘酸長，富含腺嘌呤及尿嘧啶的序列在 3’端不
轉譯區(AU rich element：AURE)，當改變或移除這樣的序列時，常常可使 mRNA
半生期加長。CYP1A1 MspI 即位於 3’端不轉譯區上 polyadenylation site 下游第 264 個鹼基處[64]，有些研究發現 CYP1A1 MspI 同型合子變異型(C/C)比起同型合 子野生型(T/T)的蛋白活性是增加的，但卻與 mRNA 量無關[57]，推測認為
CYP1A1 MspI 的多型性可能經由影響 3’端不轉譯區中的 adenylation control
elements 的功能，使 mRNA 半生期加長，使得 CYP1A1 酵素蛋白增加表現量，
進一步使 PAH 中間代謝活性致癌物質增加[57, 65]，或者另外有研究發現 CYP1A1 MspI 多型性(T6235C)與 CYP1A1 第 7 exon 中，第 4889 位置腺嘌呤取代 為鳥糞嘌呤(A4889G)的單核苷酸多型性有非常密切的連鎖(97%以上)，而第 4889 位置腺嘌呤取代為鳥糞嘌呤會使得CYP1A1 胺基酸序列，在 HR2 區域第 462 個 胺基酸由Ile 轉變為 Val，進而影響酵素的活性，因此 CYP1A1 MspI 多型性所相 關聯的CYP1A1 蛋白活性改變可能是間接經由與此 nonsynonymous SNP 的緊密 連鎖所造成而非本身直接導致蛋白結構的改變[57, 64]。
1.1.12 GST M1 基因多型性和其蛋白表現
麩胺硫轉移酵素(GST)為一包含許多功能主要在去細胞毒素、使細胞免於親
麩胺硫轉移酵素(GST)為一包含許多功能主要在去細胞毒素、使細胞免於親