研究架構

維。研究所選定的纖維有85 µm PA 纖維、50µm CW/TPR 纖維、60 µm PDMS/DVB 纖維以及 50µmDVB/CAR/PDMS 等四種性質不同的

纖維來進行試驗，樣本於室溫下，以直接法吸附 20 分鐘，以移動

相(65%乙腈、35%D.I.水)脫附 20 分鐘，進行萃取有效性探討，選擇 最佳者作為研究之微萃取纖維。

(2) 萃取時間探討

於唾液中配製濃度分別為 10µg/mL 的 TEGDMA，10µg/mL 的 UDMA，10µg/mL 的 Bis-GMA 之標準溶液，混合均勻後裝至 4 mL

將萃取完成之纖維以移動相靜態脫附5、10、15、20 分鐘，進行脫 附時間探討；於未經pH 值調整之唾液中配製 10µg/mL 的 TE- GDMA，10 µg/mL 的 UDMA，10µg/mL 的 Bis-GMA 之標準溶液，

混合均勻後裝至4mL vial 中，於室溫下，以 PDMS/DVB 纖維直接 吸附20 分鐘來進行探討，選擇最佳者作為研究之最適脫附時間。

(5) 萃取溫度探討

加熱分別調為室溫(約 27 ℃)、40 ℃、60 ℃、80 ℃來測試不同

樣本溫度下對萃取效率的影響；於未經 pH 值調整之唾液中配製

10µg/mL 的 TEGDMA，10µg/mL 的 UDMA，10µg/mL 的 Bis-GMA 之標準溶液，混合均勻後裝至4mL vial 中，調整不同的加熱溫度， UDMA，10µg/mL 的 Bis-GMA 標準溶液，混合均勻後裝至 4mL vial

中，樣本於40 ℃下，調整不同轉速，以 PDMS/DVB 纖維直接吸附 20 分鐘，以移動相靜態脫附 15 分鐘來進行攪拌速度對萃取的影響 探討，選擇最佳者作為研究之最適攪拌速度。

(7) 樣本 pH 值探討

用 citrate-phosphate buffer 將未經 pH 值調整之唾液調整至 pH=3、5、9 以及 pH=11，未經調整之唾液 pH 值約為 7.65；於不同 pH 值之唾液中配製 10µg/mL 的 TEGDMA，10 µg/mL 的 UDMA，

10µg/mL 的 Bis-GMA 標準溶液，混合均勻後裝至 4mL vial 中，加 入攪拌磁石。樣本於40 ℃下，轉速調整為 200rpm，以 PDMS/DVB 纖維直接吸附 20 分鐘，以移動相靜態脫附 15 分鐘來進行 pH 值對

(1) 檢量線建立 10 %。檢量線配製濃度範圍如下 TEGDMA：0.3~30 µg/mL；UDMA：

0.5~50 µg/mL；Bis-GMA：0.5~50µg/mL。

析之精密度與準確度。

析，探討 pH 值對溶出量影響。

(4) 市售商品天數探討

將市售 5 種光聚式複合式樹脂(如表 3-1)，在光聚合機照射 120 秒下分別聚合 6.5±0.5 mm × 1 mm 大小樹脂，聚合後於室溫下放置 24 時自然風乾，再分別浸入裝滿乙醇及唾液的 4 mL vial 中，於室 溫下浸泡0.5、1、3、5、7、10 天後進行分析，探討浸泡天數的關 係，且比較唾液與乙醇之間的差異及傳統分法與 SPME 的關係。

(5)浸泡液質譜定性

將配置好的標準溶液與浸泡好的溶液以LC-MS-MS 作質 譜確認，以定性釋出物。

第叁章 圖表附錄

圖3-1 唾液樣本 SPME-HPLC 分析方法建立

圖 3-2 真實樣本培養架構 複合樹脂樣本

浸泡

分別浸泡於乙醇及唾 液浸泡液中 0.5 、1、

3、5、7、10 日

溶出 因素

聚合時間: 20 40 60 80 120 s

溫度 :

0 ﾟ C 室溫 40 ﾟ C﹑

PH : 3、5 、7.65、

9、11

浸泡天數

Fiber condition

將配製好濃度之標準品放至 4 mL vial 中，瓶內置入磁石

將樣本置於加熱攪拌器上，攪拌 2 小時

將 SPME 穿刺過墊片，推出纖維，進行吸附

待吸附達平衡後，收回纖維

將 SPME 置於 Interface 上，推出纖維於 Chamber 中進行脫附

數據分析

圖 3-3SPME 實驗操作流程

表3-1 市售複合式樹脂商品

商品名 ^{TEGDMA UDMA Bis-GMA}

Tetric Ceram

O O O

Palfique

Estelite

O

×

O

Compoglass flow

O O

×

Dyract

×

O

× Spectrum

O

×

O

第肆章 結果與討論 第一節 HPLC 分析

於乙醇中配製 TEGDMA、UDMA、Bis-GMA 標準溶液，乙腈 65 % D.I.水 35 % 固定比例下，流速 1 ml/min 下，分析物分別於 5.29 分、7.17 分、8.92 分時出現波峰(圖 4-1a)，完成整個分析時間約 15 分鐘。

直接注入法TEGDMA 檢量線濃度範圍為 2.5~200µg/mL；UDMA 檢量線濃度範圍為6.5~260 µg/mL；Bis-GMA 檢量線濃度範圍為 3.2~

320µg/mL 異日線性相關係數 r 皆大於 0.995，RPD 值皆在 13 %以下。

溶劑萃取唾液 TEGDMA 檢量線濃度範圍為 3.125~250µg/mL；

UDMA 檢量線濃度範圍為 3.325~270 µg/mL；Bis-GMA 檢量線濃度範圍 為7.5~300µg/mL 異日線性相關係數 r 皆大於 0.995，RPD 值皆在 12 % 以下。

第二節 固相微萃取方法建立

(一) 固相微萃取纖維的選擇

在 相 同 的 濃 度 、 相 同 的 分 析 條 件 下 分 別 以 85 μmPA 、 50 μmCW/TPR 、60 μmPDMS/DVB、50/30 μmDVB/CAR/PDMS 等四 種 纖 維 來 進 行 吸 附 測 試 ， 由 研 究 結 果 顯 示( 圖 4-2-1a) ， 60 μmPDMS/DVB 能同時吸附 4 種分析物，雖面積值小於 50/30 μmDVB/CAR/PDMS 纖維，考慮分析時之穩定性，以相對標準偏差 (Relative Standard Deviation；RSD)來判定，60 μmPDMS/DVB 較為 穩定(圖 4-2-1b)，故選定以 60 μmPDMS/DVB 為此次研究中 SPME 吸附介質。

(二) 萃取時間

以 60 μmPDMS/DVB 纖維直接浸入吸附 5、10、15、20、25 分 鐘，其餘條件參數相同下來進行萃取時間探討。 相(65% acetonitrile 35% D.I.Water)、100% acetonitrile、100% 乙醇脫

附，其餘條件參數相同下來進行脫附溶劑探討。

由結果顯示(圖 4-2-3a)面積值以 100% acetonitrile 最大，100%

乙醇次之，而65% acetonitrile 35% D.I. Water 最小。在考慮分析時 之穩定性，以相對標準偏差(Relative Standard Deviation；RSD)來判 定(圖 4-2-3b)，100%乙醇 RSD 值大於 10%以上，而 65% acetonitrile 35% D.I. Water 移動相的 RSD 值均小於 10%(圖 4-2-3b)，雙重考量 下最後選定65% acetonitrile 35% D.I. Water 移動相為較佳脫附劑。

(數據詳見表4-2-3) (四) 脫附時間探討

以60 μmPDMS/DVB 纖維直接浸入吸附 20 分鐘，以移動相(65%

acetonitrile 35% D.I.Water) 分別脫附 5、10、15、20 分鐘，其餘條 件參數相同下來進行脫附時間探討。

由研究結果顯示(圖 4-2-5a)，有加熱分析物之面積值明顯大於 不加熱，但隨著溫度上升而明顯減少(40 ℃>60 ℃>80 ℃)，且 40 ℃ 的RSD 值均小於 10 %(圖 4-2-5b)。在此兩種因素考量下，遂決定以 40 ℃為研究最適萃取溫度。(數據詳見表 4-2-5)

(六) 攪拌速度對萃取的影響

將攪拌器轉速調整為不攪拌、200 rpm(0.18 g)、500(1.11 g) rpm、800(2.86 g) rpm 來進行攪拌速率對吸附量的探討。

未經調整之唾液 pH 值約為 7.65，以 citrate-phosphate buffer 將 未經pH 值調整之唾液調整至 pH=3、pH=5、pH=9 以及 pH=11，來

第三節分配係數

於唾液中分別配製濃度 1.5、7.5 μg/ml 的 TEGDMA；2.5、

12.5 µg/mL 的 UDMA；2.5、12.5 µg/mL 的 Bis-GMA 標準溶液，以 探討的SPME 參數， 分析得到纖維吸附量後，即可得到分配係數 由研究結果顯示，重複7 次高低濃度的分配係數皆相近且穩定，分 別為；TEGDMA: 70.17、72.12；UDMA: 85.27、84.56；Bis-GMA:

151.01、152.05。(數據詳見表 4-3)

第四節 分析品質管制

(一) 檢量線建立

TEGDMA 檢量線濃度範圍為 0.3~30µg/mL；UDMA 檢量線濃 度範圍為0.5~50 µg/mL；Bis-GMA 檢量線濃度範圍為 0.5~50µg/mL 異日線性相關係數r 皆大於 0.995，RPD 值皆在 12 %以下。(表 4-4-1)

(二)方法偵測極限(MDL)

以檢量線最低點濃度，分別為TEGDMA：0.3 µg/mL；UDMA：

0.5 µg/mL；Bis-GMA：0.5 µg/mL，重複分析 7 次，所得 7 次儀器 訊號代入迴歸方程式即得相當之濃度，取其 3 倍標準偏差(standard deviation；SD)，即為各物質之分析方法偵測極限。(表 4-4-2)

(三) 分析之精密度與準確度

分別取檢量限範圍內中低、高濃度值 2 點，分別為 TEGDMA：

1.5、7.5 µg/mL；UDMA：2.5、12.5 µg/mL；Bis-GMA : 2.5、12.5 µg/mL，於樣本分析的同時，進行標準品分析，結果顯示無論在低 濃度或高濃度的樣本，其變異係數(CV %)皆小於 10 %，且準確度 皆介於100±10 %之間，表示此分析方法之再現性良好。(表 4-4-3)

第五節 真實樣本培養

少，尤其在 60 秒前更明顯。(數據詳見表 4-5-3) (四) 溫度探討

以樹脂 Tetric Ceram 在 0 ℃、室溫(27 ﾟ C)、40 ℃下浸泡 7 天 後分析，進行溫度對溶出量影響的探討。

由結果顯示(圖 4-5-4)， UDMA、Bis-GMA 隨著溫度的上升溶 出量大量增加，而TEGDMA 較不受溫度的的影響，只有些微的增 加。(數據詳見表 4-5-4)

(五) pH 值探討

以樹脂 Tetric Ceram 於經調整 pH 值為 3、5、7.65、9、11 乙醇 溶液中浸泡7 天後分析，進行 pH 值對溶出量影響的探討。

由結果顯示(圖 4-5-5)，隨著 pH 的上升，TEGDMA、UDMA、

Bis-GMA 溶出量減少，。(數據詳見表 4-5-5)

第六節 討論

不會有太大的增加，本實驗在吸附初始階段 10 分鐘已吸附大量分

吸附，對於在水中不解離的芳香族碳氫化合物、鹵化醚類化合物，

bisphenol-A(4,4-Isopropylidenediphenol)、TEGDMA、EGDMA (Ethylene glycoldimethacrylate)、MMA(Methylacrylate)、MA

(Methacrylic)六種低分子物質開發 SPME-GC-MS 方法，而其 SPME 的參數無一完整探討，以開發 SPME 方法而言是不足的，相對本研

究將所有直接浸入SPME 參數逐一探討，找出適合參數並探討其分 Tetric ceram 溶出 Bis-GMA > UDMA > TEGDMA；Palfique Estelite 溶出 Bis-GMA > TEGDMA；Compoglass flow 溶出 UDMA；Spectrum

出量隨著減少，但當 pH 值大於 9 時UDMA、Bis-GMA 溶出量幾乎 為零。

唾液樣本在所有浸泡天數下皆無偵測到 TEGDMA、UDMA、

Bis-GMA，而唾液中所含的酶已被證實與酵素 CE、PCE 有同樣的 能力能夠分解 TEGDMA、Bis-GMA 這些被溶出的單體 ¹⁸，分解後 的產物包括 Methacrylic(MA)、Triethyleneglycol methacrylate

(TEGMA)、Bishydroxyproxyphenylpropane、(BisHPPP)、Ethoxylated Bisphenol A (E-BPA)，而 TEGDMA、UDMA、Bis-GMA 研究指出 皆會造成過敏反應及細胞基因毒性，但對於這些產物的毒性研究除 了 MA 因用途較廣，有相關毒性研究指出其毒性 ³²，其他產物皆無 著墨，由結果顯示，樹脂溶出物在唾液中 12 小時之後，完全被酶 所分解,評估樹脂於唾液環境中溶出對人體健康危害，應考量到產 物是較適當的。

第肆章 圖表附錄

4-1 附圖

圖4-1 HPLC 分析圖

4-2-1 附圖

CW/TPR PDMS/DVB DVB/CAR/PDMS Polyacrylic

Fiber

RSD TEGDMA

UDMA Bis-GMA

圖 4-2-1b 不同纖維的 RSD 圖

4-2-2 附圖

4-2-3 附圖

mobile phase 100% acetonitrile 100% ethanol desorption solvent

RSD TEGDMA

UDMA Bis-GMA

圖4-2-3b 不同脫附劑下之 RSD 值

4-2-4 附圖

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

5 10 15 20

desorption time(min)

RSD TEGDMA

UDMA Bis-GMA

圖4-2-4c 不同脫附時間下之 RSD 值

4-2-5 附圖

Area 27ﾟC 40ﾟC 60ﾟC 80ﾟC

圖4-2-5a 萃取溫度探討

27ﾟC 40ﾟC 60ﾟC 80ﾟC

extraction temperature

RSD TEGDMA

UDMA Bis-GMA

圖4-2-5b 不同萃取溫度下之 RSD 值

4-2-6 附圖

Area 0 rpm 200rpm 500rpm 800rpm

圖4-2-6a 攪拌速度探討

0 rpm 200rpm 500rpm 800rpm

stirring rates

RSD TEGDMA

UDMA Bis-GMA

圖4-2-6b 不同攪拌速度下之 RSD 值

4-2-7 附圖

RSD TEGDMA UDMA Bis-GMA

圖4-2-7b 不同 pH 值下之 RSD 值

4-5-1 附圖

Dyract

TEGDMA UDMA Bis-GMA 分析物種

釋出率 Tetric Ceram

4-5-2 附圖

圖4-5-2a 標準溶液 TEGDMA LC-MS-MS 質譜圖

圖4-5-2b 樹脂浸泡液 TEGDMA LC-MS-MS 質譜圖

圖4-5-2c 標準溶液 UDMA LC-MS-MS 質譜圖

圖4-5-2d 樹脂浸泡液 UDMA LC-MS-MS 質譜圖

圖4-5-2e 標準溶液 Bis-GMA LC-MS-MS 質譜圖

圖4-5-2f 樹脂浸泡液 Bis-GMA LC-MS-MS 質譜圖

4-5-3 附圖

0.00E+00 1.00E-03 2.00E-03 3.00E-03 4.00E-03 5.00E-03

20s 40s 60s 80s 120s

polymeric time(second)

releasing cofficient TEGDMA

UDMA Bis-GMA

圖4-5-3 聚合時間影響溶出量探討

4-5-4 附圖

0.00E+00 1.00E-03 2.00E-03 3.00E-03 4.00E-03 5.00E-03

0°C 27°C 40°C

releasing cofficient TEGDMA

UDMA Bis-GMA

圖4-5-4 溫度影響溶出量探討

4-5-5 附圖

0.0000E+00 5.0000E-04 1.0000E-03 1.5000E-03 2.0000E-03 2.5000E-03 3.0000E-03

3 5 7.65 9 11 pH

releasing cofficient TEGDMA

UDMA Bis-GMA

圖4-5-5 pH 影響溶出量探討

表4-2-2 SPME 吸附時間探討

TEGDMA 5 min 10 min 15 min 20 min 25 min Mean(n=3) 99475 160078 246524 323524 303957

SD 3955 7200 9442 18941 4222 RSD % 3.98 4.5 3.83 5.85 1.39

UDMA 5 min 10 min 15 min 20 min 25 min Mean(n=3) 48318 73571 122213 146717 133656

SD 4124 4929 10959 5602 7295 RSD % 8.54 6.70 8.97 3.82 5.46

Bis-GMA 5 min 10 min 15 min 20 min 25 min Mean(n=3) 55638 72817 114118 166653 161526

SD 1640 5277 4192 19642 9412 RSD % 2.95 7.25 3.67 11.79 5.83

表4-2-3 SPME 脫附劑探討

TEGDMA 移動相 100%乙腈 100%乙醇

Mean(n=3) 205385 318983 186930 SD 10433 8850 21890

RSD % 5.08 2.77 11.71

UDMA 移動相 100%乙腈 100%乙醇

Mean(n=3) 113804 175283 184703

SD 6977 12142 3110

RSD % 6.13 6.93 1.68

Bis-GMA 移動相 100%乙腈 100%乙醇

Mean(n=3) 101370 211575 171428 SD 5328 9070 8127

RSD % 5.26 4.29 4.74

表 4-2-4 SPME 脫附時間探討

TEGDMA 5 min 10 min 15 min 20 min Mean(n=3) 302791 309000 290745 246443

SD 37159 35494 11714 19932 RSD % 12.27 11.49 4.03 8.09

UDMA 5 min 10 min 15 min 20 min Mean(n=3) 157434 156415 142622 116176

SD 24354 22800 4818 4523

RSD % 15.47 14.58 3.38 3.89

Bis-GMA 5 min 10 min 15 min 20 min Mean(n=3) 189148 179904 164015 118118

SD 40950 38826 3839 8417

RSD % 21.65 21.58 2.34 7.13

表4-2-5 SPME 萃取溫度探討

TEGDMA 室溫 40 ℃ 60 ℃ 80 ℃

Mean(n=3) 223862 392585 354773 220148

SD 10733 21736 27187 14827

RSD % 4.79 5.54 7.66 6.74

UDMA 室溫 40 ℃ 60 ℃ 80 ℃

Mean(n=3) 96012 197917 293797 232941

SD 2051 15895 43582 12816

RSD % 2.14 8.03 14.83 5.5

Bis-GMA 室溫 40 ℃ 60 ℃ 80 ℃

Mean(n=3) 85971 212033 410898 339617

SD 3789 16704 45694 61921

RSD % 4.41 7.88 11.12 18.23

表 4-2-6 SPME 攪拌與否探討

TEGDMA 0 rpm 200 rpm 500 rpm 800 rpm Mean(n=3) 392585 405155 379214 390087

SD 21736 26262 26198 12419

RSD % 5.54 6.48 6.12 3.18

UDMA 0 rpm 200 rpm 500 rpm 800 rpm Mean(n=3) 197917 326357 347107 367083

SD 15895 21875 24785 25352

RSD % 8.03 6.70 7.14 6.91

Bis-GMA 0 rpm 200 rpm 500 rpm 800 rpm Mean(n=3) 212033 479050 683296 686788

SD 16704 17949 124762 183289

RSD % 7.88 3.75 18.26 26.69

表4-2-7 SPME pH 值探討

TEGDMA pH=3 pH=5 pH=7.65 pH=9 pH=11 Mean(n=3) 370981 380269 409351 322054 15071

SD 3741 6024 12898 22073 9748

RSD % 1.01 1.58 3.15 6.85 64.68

UDMA pH=3 pH=5 pH=7.65 pH=9 pH=11 Mean(n=3) 412066 422483 444910 311157 25108

SD 10950 29591 26294 14256 24720

RSD % 2.66 7.00 5.91 4.58 98.45

Bis-GMA pH=3 pH=5 pH=7.65 pH=9 pH=11 Mean(n=3) 545428 551334 637811 390864 42274

SD 37234 53189 10456 26930 21404

RSD % 6.83 9.65 1.64 6.89 50.63

表4-3 分配係數

4-3c UDMA 低濃度分配係數

4-3e Bis-GMA 低濃度分配係數

表4-4-1 檢量線製作

4-4-1a TEGDMA

濃度(µg/mL) 方程式 R² RPD %

0.3~30 Y=48429X+1411.8 1 -9.45~1.03 0.3~30 Y=47562X+118.1 0.999 -11.52~4.30 異日

0.3~30 Y=47671X-638.31 0.999 -10.56~4.17

4-4-1b UDMA

濃度(µg/mL) 方程式 R² RPD %

0.5~50 Y=33421X+1584.8 0.999 -9.42~2.55 0.5~50 Y=35291X+3161.8 1 -1.73~4.16 異日

0.5~50 Y=34248X+3021.9 0.999 -7.8~7.45

4-4-1c Bis-GMA

濃度(µg/mL) 方程式 R² RPD %

0.5~50 Y=68195X-429.92 0.999 -5.12~4.85 0.5~50 Y=68226X-2274.3 0.999 -5.23~10.29 異日

0.5~50 Y=68358X-1497.5 0.999 -9.35~3.42

表 4-4-2 方法偵測極限

4-4-2c Bis-GMA

編號 配製濃度 (µg/mL) 分析濃度(µg/mL)

1 0.5 0.48

2 0.5 0.50

3 0.5 0.50

4 0.5 0.50

5 0.5 0.55

6 0.5 0.51

7 0.5 0.52

SD=0.021 3*SD=0.064 MDL =0.064 µg/mL

表 4-4-3 準確度與精密度測試

4-4-3c UDMA 低濃度精密度與準確度

4-4-3e Bis-GMA 低濃度精密度與準確度

表4-5-3 聚合時間對溶出量影響 4-5-3a TEGDMA

聚合時間 20s 40s 60s 80s 120s

Mean(n=2) 118670 81272 64880 60206 43507

SD 936 1828 919 492 597

RSD % 0.79 2.25 1.42 0.82 1.37

濃度 μg/mL 14.52 9.82 7.76 7.17 5.07 聚合重量(ng) 78400 77600 79300 76300 69400

溶出量(ng) 58.07 39.27 31.03 28.68 20.29 溶出率×1000 0.74 0.50 0.39 0.37 0.29

4-5-3b UDMA

聚合時間 20s 40s 60s 80s 120s

Mean(n=2) 319135 224483.5 183412.5 165830 140829.5 SD 13.44 999.14 1093.89 4405.28 813.88 RSD % 0.00 0.45 0.60 2.66 0.58 濃度μg/mL 67.09 47.08 38.40 34.68 29.39 聚合重量(ng) 78400 77600 79300 76300 69400

溶出量(ng) 268.37 188.32 153.58 138.71 117.57 溶出率×1000 3.42 2.42 1.94 1.84 1.70

4-5-3c Bis-GMA

聚合時間 20s 40s 60s 80s 120s

Mean(n=2) 477147.5 332901.5 270895.5 249087.5 210272.5 SD 368.40 2123.44 4509.22 7374.42 1024.60 RSD % 0.08 0.64 1.66 2.96 0.49 濃度μg/mL 90.82 63.34 51.53 47.38 39.98 聚合重量(ng) 78400 77600 79300 76300 69400

溶出量(ng) 363.27 253.36 206.12 189.50 159.93 溶出率×1000 4.63 3.26 2.60 2.48 2.30

表4-5-4 溫度對溶出量影響 4-5-4a TEGDMA

溫度 0°C 室溫(27°C) 40°C

溫度 0°C 室溫(27°C) 40°C

在文檔中 複合式樹脂之唾液中釋出物固相微萃取高效液相層析儀分析方法研究 (頁 53-0)