因為在人類及禽類體內主要(90%)進行內源性脂質生成的場所皆為肝臟 (Laliotis et. al., 2010)，加上人類女性及雌性產蛋家禽蓄積脂肪於肝臟皆受到 動情素的影響，使得 NAFLD 與 FLHS 間有極高相似性。因此，產蛋家禽的 脂肪肝模式應能成為評估護肝物質成效的良好平台。然而，目前探討北蟲草 及靈芝應用於改善肝臟傷害的相關研究中，所使用的主流動物模式仍為小 鼠。因此，本試驗的目的是希望透過日本鵪鶉的天然脂肪肝模式，於日常飼 糧中添加不同濃度的北蟲草及靈芝，了解兩者對肝臟脂肪堆積程度造成的影 響，並在後續以細胞模式探討，來自不同萃取方式的有效物質對日本鵪鶉初 代肝細胞 (primary hepatocytes)造成的生理影響。
貳、材料與方法
一、 實驗動物
本研究共進行兩次動物試驗，所使用的蛋用日本鵪鶉皆來自相同的商 業鵪鶉場。在第一次動物試驗中(圖十一 A)，選用 35 隻 40 週齡的母日本 鵪鶉，並依據初始血脂分成 7 組(n=5)，包括控制組 (Ctrl..)、蟲草 0.5%組 (Cord. 0.5%)、蟲草 1%組 (Cord. 1%)、蟲草 2%組 (Cord. 2%)、靈芝 0.5%
組 (Gano. 0.5%)、靈芝 1%組(Gano. 1%)以及靈芝 2%組 (Gano. 2%)，在處 理 12 週後犧牲採樣。在第二次動物試驗中(圖十一 B)，則使用 60 隻 5 日 齡的母日本鵪鶉，自 14 週齡起依據初始血脂分成 5 組(n=12)，分別為控制 組(Ctrl.)、蟲草 1%組 (Cord. 1%)、靈芝 0.5%組 (Gano. 0.5%)、靈芝 1%組 (Gano. 1%)以及靈芝 2%組 (Gano. 2%)，並在 12 週處理後(26 週齡)及 20 週 處理後(34 週齡)進行兩次犧牲採樣，每次犧牲從各組中隨機選取 6 隻，共 犧牲 30 隻。動物飼養在經臺灣大學實驗動物管理小組檢驗合格之動物禽 舍，並將環境溫度控制在攝氏 23-25 度間、濕度維持在 60-70%。飲水及飼 料任飼。於試驗期間，每日紀錄採食量及產蛋量；每四週進行一次採血，
每次犧牲會採集肝臟、腹部脂肪及胸部肌肉進行後續分析。
圖十一、動物試驗進行流程圖
A.
B.
Figure 11. The experiment design for animal model TAG: triacylglycerol
CHOL: cholesterol
二、 飼糧配製
控制組所用的日常飼糧購自與實驗動物來源相同的商業鵪鶉場，飼 糧經近似分析後所得的灰分、水分、粗蛋白質(crude protein, CP)及粗脂肪 (crude fat, CF)佔比如表二所示。而根據 Omidiwura et. al.,2016 的資料顯 示，日本鵪鶉飼糧的最適代謝能為 3100-3200 kcal ME/k；最適粗蛋白質 比例為 24-26%。試驗中所使用的日常飼糧 CP%約為 23.67%，符合鵪鶉 正常生理需求。飼糧中所添加的蟲草來源來自商業公司提供的菌絲體粉 末；靈芝來源則來自靈芝農場提供的乾燥子實體全株切片，靈芝切片會 在配置前會將以乾磨機切碎。各實驗組飼糧每次配置的最終重量為 3 kg，並依據所需濃度分別加入 15 g (0.5%)、30 g (1%)、60 g (2%)的蟲 草粉及靈芝碎片，以飼料混勻機充分攪拌後置於-20℃冰箱存放，使用前 於室溫下回溫。
表二、日本鵪鶉日常飼糧的近似分析結果
三、 採食量及隻日產蛋率之計算 Randox 套組 (CH200、TR210)按照廠商指示進行測定。
五、 肝臟三酸甘油酯含量測定
七、 肝臟組織冷凍切片及油紅染色 (oil red O staining)
將犧牲時所採集的肝臟右葉組織放入卡匣後，以冰冷的 4%聚甲醛溶 液(4% paraformaldehyde)固定至少 24 小時，接著以 15%蔗糖水溶液(24hr)
30%蔗糖水溶液(48hr)的脫水程序處理，之後再以 OCT 進行包埋後放 100%丙二醇(propylene glycol)於切片上，靜置 2 分鐘後去除，藉此攜帶 多餘水分。之後再滴加 60℃的 0.5% oil red O (Sigma) 溶液於 60℃烘箱中
上清液所留下的沉澱物，即可以滅菌後的二次蒸餾水進行回溶，完成 RNA 萃取步驟。
萃取後的 total RNA 在測定濃度之後，即可使用 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)進行反轉錄作用合成
cDNA。接著便可進行 time PCR 分析，過程使用 SensiFastTM Real-Time PCR Kits 並以 Step One Plus Real-Real-Time PCR System (Applied
Biosystems)進行基因表現量的定量分析。PCR 反應為 95℃ 2 分鐘後，即 進行 40 cycles 的 denaturation 95℃ 5 秒、annealing 60℃ 10 秒以及 elongation 72℃ 20 秒的反應。目前實驗所使用的 primer sets 序列如下：
表三、基因表現量檢測所使用之引子序列
F: forward sequence; R: reverse sequence APOV1
九、 日本鵪鶉肝臟細胞的初代培養
表四、日本鵪鶉肝臟細胞初代培養所需灌流溶液配方
初代培養日本鵪鶉肝臟細胞所需準備的灌流溶液如表四所示，在使 用前必須確保所有溶液為無菌狀態。細胞試驗皆須在無菌的細胞操作台 進行，所使用的任何器具則需先以滅菌釜進行滅菌。細胞培養過程如 下：首先，在犧牲日本鵪鶉後先於酒精溶液中浸泡清洗，並在無菌操作 台中以手術器具採下完整肝臟組織，置入培養盤中。接著，在依序以 50 Ml Perfusion buffer I 50 mL Perfusion buffer II 50 mL Perfusion buffer III 及 25 mL Perfusion buffer IV 進行灌流。灌流結束後，以滴管吸取肝臟 組織置入 25 mL Perfusion buffer IV 中，並以 37℃水浴 15 分鐘。之後，
使用40μm 的濾網進行過濾，濾液再以 700 g 於室溫中離心 5 分鐘。最
後，在倒掉上清液後，加入 25mL Perfusion buffer V 清洗，並以同條件離 心，清洗步驟重複三次後，即可以含 10% FBS、1% antibiotics 的 DMEM 培養液種植細胞於 12 孔盤。 芝的酒精粗萃取物(ethanol crude extract)。
十一、 細胞試驗處理條件
(二) 靈芝酒萃物對日本鵪鶉初代培養肝細胞的影響
在參考 Shimizu et. al., 2009 的文獻後，試驗中所選用的三種靈 芝酒萃物濃度為 0.01 μg/mL、1 μg/mL 及 100 μg/mL，同樣在 肝細胞貼附於培養盤底部且並未觀察到異狀後，即可以 1x PBS 溶 液清洗。與水萃物處理不同之處在於：為了確認靈芝酒萃物的動情 素相似活性，此次試驗中所使用的 DMEM 培養液並不含 phenol red。因為 phenol red 被廣泛認為是一種微弱的動情素(Berthois et.
al., 1986)。所以，此細胞試驗是在清洗後於 12 孔盤的每格中添加 1 mL 不含 phenol red 的 DMEM 培養液(內含 10% FBS、1%
antibiotics)，接著，再讓每格培養盤在添加 10μL 的靈芝酒萃物後，
達到上述所需濃度。最後，於培養 24 小時後，以 1 mL 的 GENEzol™ Reagent (GZR200 )收取細胞，並抽取細胞 RNA。
十二、 統計分析
試驗數據以 one-way analysis of variance (ANOVA)及 Dunnett’s multiple comparison 方法進行計算，分析結果以 P ≤ 0.05 表示具有統計顯著性。