飼糧中添加靈芝及北蟲草對日本鵪鶉肝臟脂質堆積的影響

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國立臺灣大學生物資源暨農學院動物科學技術學系碩士論文

Department or Animal Science and Technology College of Bioresources and Agriculture

National Taiwan University Master Thesis

飼糧中添加靈芝及北蟲草對日本鵪鶉肝臟脂質堆積的影響

The effect of dietary Ganoderma lucidum and Cordyceps militaris supplementation on hepatic lipid accumulation

in Japanese quail

熊禹涵 Yu-Han Hsiung

指導教授: 丁詩同博士 Advisor: Shih-Torng Ding, Ph.D

中華民國 108 年 7 月

July 2019

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中文摘要

肝臟為人體中重要的脂質代謝場所，當其蓄積的脂肪量大於 5%的肝臟重量時，即可定義為脂肪肝(fatty liver)，而非酒精性脂肪肝(NAFLD)在現代生活習慣的影響下，已成為不可忽視的代謝疾病。另一方面，為了符合產蛋所需，經產家禽肝臟內的脂質生成(lipogenesis)作用將受到動情素調控而增加，使其容易出現天然性脂肪肝。當家禽肝臟內所蓄積的過量脂肪造成微血管破裂時，即可被診斷為出血性脂肪肝(fatty liver hemorrhagic syndrome, FLHS)，其發生除降低家禽的產蛋性能外，也可能引發突發死亡，造成蛋雞產業的損失。因產蛋家禽與人類的內源性脂質生成(de novo lipogenesis)場所皆位於肝臟的緣故，使 FLHS 與 NAFLD 間存在相似性，並讓產蛋家禽成為良好的脂肪肝研究平台。雖然目前已 有許多研究團隊在飼糧誘導的小鼠模式上證實北蟲草(Cordyceps militaris)及靈芝 (Ganoderma lucidum)具有降血脂、抗發炎及降低肝臟脂質含量的成效，但卻少 以產蛋家禽作為模式動物進行研究。因此，本試驗希望透過日本鵪鶉在進入產蛋周期後形成的天然脂肪肝模式，探討不同濃度的北蟲草及靈芝處理，對日本鵪鶉在肝臟脂質堆積程度上的影響。此外，也期望以日本鵪鶉的初代培養肝細胞模式探討靈芝中不同機能性成分對肝臟脂質生成作用背後分子機制的影響。

本次研究共進行兩次動物實驗：第一次使用 40 週齡的日本鵪鶉進行 12 週試驗，第二次則使用 14 週齡的日本鵪鶉進行 20 週試驗。前者共分為 7 組(n=5)，

分別為控制組及 3 種濃度(0.5%、1%、2%)的北蟲草組與靈芝組。因在此次實驗中發現：北蟲草 1%組及三組靈芝組可能具有降低肝臟脂質堆積的潛力，所以，

在第二次動物實驗中，就以此 4 種處理加上 1 組控制組共分為 5 組(n=12)，並在 12 週處理後(26 週齡)及 20 週處理後(34 週齡)進行兩次犧牲採樣。此次結果顯示：

於 12 週處理下，北蟲草處理組尚未對肝臟的脂質堆積情形產生影響；而在低濃度(0.5%、1%)的靈芝處理組中則出現降低肝臟三酸甘油酯含量、肝臟組織的油紅染色區域及血漿 DPP4 含量(脂肪肝生物指標)的結果，表示低濃度的靈芝處理有降低肝臟脂質堆積的潛力。相反地，高濃度(2%)的靈芝處理則讓肝臟脂質堆積情況更加嚴重，此現象在發現動情素相關基因的表現量(APOV1)會因高濃度靈芝處

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理而上升後得到解釋。另一方面，在 20 週處理下，北蟲草 1%組及靈芝 1%組在肝臟組織的油紅染色區域以及肝臟中脂肪肝生物指標(DPP4、GST)的基因表現量上明顯低於控制組，表示其脂肪肝程度較控制組輕微。兩次的動物實驗呈現出北蟲草與靈芝具有改善肝臟脂質堆積的潛力，但背後機制尚不明確，為釐清其有效物質透過的影響途徑，後續實驗中也採用細胞模式進行探討。

於細胞實驗中，透過不同靈芝萃取物的處理，發現靈芝水萃物具有降低脂質合成相關基因 FAS 的能力，但在靈芝酒萃物的處理下，卻發現動情素相關基因如 APOV1 及 ELOVL5 的表現量會上升，表示靈芝的有效成分中存在與動情素相似的活性。因此，細胞實驗的結果說明：靈芝內含的不同有效成分對產蛋家禽的肝臟脂質生成作用造成的影響也不同。而根據動物實驗的結果，可以推測日本鵪鶉在最適濃度的靈芝處理下(1%)，有效成分間將有最佳的交互作用，出現降低肝臟脂質堆積的效果。

綜上所述，在以日本鵪鶉天然性脂肪肝模式進行評估後，發現北蟲草及靈芝具有降低肝臟內脂質堆積的潛力，因此，若能進一步的對有效成分進行探討，將有益於受到 NAFLD 及 FLHS 困擾的人類健康與家禽產業。

關鍵字：脂肪肝、動情素、北蟲草、靈芝、日本鵪鶉

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Abstract

In human, liver is not only the important place for lipid metabolism. When the hepatic lipid content exceeds 5% of the liver weight, it can be diagnosed with fatty liver. As the impact of modern way of life, non-alcoholic fatty liver syndrome

(NAFLD) has become a major metabolic disorder that cannot be ignored. On the other hand, in active-laying birds, the hepatic lipogenesis increases due to secretion of estrogen to meet the need of egg production. When excess lipids cause hepatic

capillaries damaged, it can be diagnosed as fatty liver hemorrhagic syndrome (FLHS).

The incidence of FLHS will lead to the dramatic drop on egg production and even sudden death on laying birds, which is the great loss in poultry industry. Because the major place of de novo lipogenesis are same in laying birds and human, the similarity between FLHS and NAFLD makes the laying birds become a good research model for fatty liver. However, instead of studying on laying birds, it has been well-known that Cordyceps militaris and Ganoderma lucidum has the effect on ameliorating hyperlipidemia, anti-inflammation, and decreasing hepatic lipid accumulation on diet- induced mice model so far. Thus, the aim of this study is to understand the influence of either Cordyceps militaris or Ganoderma lucidum that added in the daily diet on hepatic lipid accumulation, through the spontaneous fatty liver disease model on egg- laying Japanese quail, and furthermore, to study the role that functional ingredients from different extract plays on lipid accumulation in the liver through the primary hepatocytes of Japanese quail.

The in vivo study was repeated in two time by using age-different quails, including the 40-week-old Japanese quails in the first time and the 14-week-old Japanese quails in second time. In the first time experiment, the quails were grouped in 7 (n=5), including control group, three different concentration (0.5%, 1%, 2%) of Cordyceps militaris, and three different concentration (0.5%, 1%, 2%) of Ganoderma lucidum. It is showed that 1% C. militaris treatment and all concentration of

G.lucidum treatment have a potential on reducing hepatic lipid accumulation after 12 week treated. Therefore, in the second time experiment, the quails were grouped in 5 (n=12), including control group and four treatment group which mentioned above.

After 12-week-treated (26-week-old) and 20-week-treated (34-week-old), the quails were sacrificed and sampled. The result showed that under 12-week treatment, there is no significant effect on ameliorating hepatic lipid accumulation in C. militaris

treatment groups. The hepatic triacylglycerol content, oil red O staining area on hepatic tissue, and plasma DPP4 (fatty liver biomarker) is reduced in G. lucidum 0.5%

and 1% groups, which is implicated that the low concentration of G.lucidum treatment had potential on decrease lipid accumulation in liver. The estrogen-related gene

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expression increased under high concentration of G. lucidum treatment (2%), which lead to severe hepatic lipid accumulation. On the other hand, after 20-week treatment, the oil red O staining area and the gene expression such as DPP4 and GST decline in C. militaris 1% treatment and G. lucidum 1% treatment, which stands for slight level of fatty liver disease. Similarly, it is found that the hepatic lipid accumulation got severe in 2% G.lucidum treatment group. The results from in vivo study demonstrated the phenotype of reduced hepatic accumulation under C.militaris and G. lucidum treatment, but the pathway is not clear. Thus, the study continued on cell model in order to realize the effect of functional ingredients in those two hepatoprotective materials.

In the cell study, it is found that the expression of lipogenic gene like FAS is reduced under the treatment of G.lucidum water extract, while the expression of estrogen-related gene such as APOV1 and ELOVL5 is increased under the treatment of G.lucidum ethanol extract. It is indicated that the ingredients in G.lucidum has the estrogen-like activity. Therefore, the in vitro study showed that G.lucidum is

composed of different ingredients that play the different role on hepatic lipid accumulation in laying birds, and according to the in vivo study, it is believed that under optimal treatment (1% G. lucidum), the hepatic lipid accumulation in Japanese quail would be ameliorated because of the best interaction between functional

ingredients.

In conclusion, it is found that not only C. militaris but also G.lucidum has a potential on reducing hepatic lipid accumulation through the natural fatty liver disease in Japanese quail. Therefore, it is benefit on finding the ameliorative way to dealing with NAFLD or FLHS, if the functional ingredients in those two hepatoprotective materials could be further studied.

Key words: fatty liver disease, estrogen, C. militaris, G.lucidum, Japanese quail

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圖目錄

圖一、非酒精性脂肪肝的世界盛行率...2

圖二、NAFLD 與肝臟傷害間的進程關係... 3

圖三、FLHS 的肝臟外觀與切片下形態... 圖四、家禽肝臟中脂質堆積的來源...5

圖五、FLHS 的季節性分布...6

圖六、內泌素影響產蛋家禽肝臟中脂質堆積的途徑...8

圖七、脂肪肝外觀評分...9

圖八、血漿中生物標記與肝臟外觀評分間的關係...10

圖九、脂質生成作用...11

圖十、靈芝在改善飼糧誘導的代謝疾病上的功效...14

圖十一、動物實驗進行流程圖...17

圖十二、飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝對 40 週齡日本鵪鶉在採食及產蛋上的影響...22

圖十三、飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝對 40 週齡日本鵪鶉在血脂濃度上的影響………...23

圖十四、飼糧中不同濃度的蟲草及靈芝對 40 週齡日本鵪鶉在肝臟三酸甘油酯含量上的影響...24

圖十五、40 週齡日本鵪鶉在不同濃度的北蟲草及靈芝處理下其肝臟切片經油紅染色的結果...26

圖十六、40 週齡日本鵪鶉肝臟切片的油紅染色區域定量結果...27

圖十七、飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝對 14 週齡日本鵪鶉在隻日採食量上的影響。...30

圖十八、飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝對 14 週齡日本鵪鶉在隻日產蛋率上的影響。...30

...4

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圖十九、飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝對 14 週齡日本鵪鶉

在血脂濃度上的影響。...32 圖二十、飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝對 14 週齡日本鵪鶉

在血漿 DPP4 濃度上的影響。...34 圖二十一、14 週齡日本鵪鶉在北蟲草及不同濃度的靈芝處理 12 週後

其肝臟切片經 H&E 染色的結果。...37 圖二十二、14 週齡日本鵪鶉在北蟲草及不同濃度的靈芝處理 12 週後

其肝臟切片經油紅染色的結果。...38 圖二十三、飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝對 14 週齡日本鵪鶉

在肝臟脂質堆積程度的影響。...40 圖二十四、14 週齡日本鵪鶉在北蟲草及不同濃度的靈芝處理 20 週後

其肝臟切片經 H&E 染色的結果。...43 圖二十五、14 週齡日本鵪鶉在北蟲草及不同濃度的靈芝處理 20 週後

其肝臟切片經油紅染色的結果...44 圖二十六、飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝於不同時間處理下對 14 週齡

日本鵪鶉肝臟內脂質生成相關基因表現量的影響。...45 圖二十七、飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝於不同時間處理下對 14 週齡

日本鵪鶉肝臟內脂肪肝指標相關基因表現量的影響。...47 圖二十八、飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝於不同時間處理下對 14 週齡

日本鵪鶉肝臟內動情素相關基因表現量的影響。...49 圖二十九、飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝於不同時間處理下對 14 週齡

日本鵪鶉肝臟內動情素相關基因表現量的影響。...51 圖三十、不同濃度的靈芝水萃物對日本鵪鶉初代培養肝細胞中 FAS 基因

表現量的影響。...53 圖三十一、不同濃度的靈芝酒萃物對日本鵪鶉初代培養肝細胞中動情素

相關基因表現量的影響。...55

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表目錄

表一、北蟲草在改善飼糧誘導的代謝疾病上的功效...12

表二、日本鵪鶉日常飼糧的近似分析結果...18

表三、基因表現量檢測所使用之引子序列...21

表四、日本鵪鶉肝臟細胞初代培養所需灌流溶液配方...22

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壹、文獻探討

一、脂肪肝疾病 (fatty liver disease)

1. 人類的脂肪肝疾病

1.1 非酒精性脂肪肝 (non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)

非酒精性脂肪肝為現代常見的慢性肝臟疾病之一，影響深遠、遍及全球，且與肥胖與代謝疾病的盛行有密切關聯，目前在世界上大約每四人中會有一人患有非酒精性脂肪肝(圖一)( Rinella and Charlton, 2016)。肝臟為人類生理上重要的脂質代謝場所，當過量脂肪蓄積於肝臟，並造成大於 5%的肝細胞能從組織切片影像上看到明顯的三酸甘油酯堆積，又或是脂肪浸潤 (steatosis)影響至少 5%的肝臟體積或重量，即可被定義為脂肪肝(Abd El- kader and El-Den Ashmawy, 2015)，如果不因酒精而引起的脂肪肝，即稱為非酒精性脂肪肝。另外，就組織切片的形態而言，NAFLD 包含簡單脂肪肝 (simple fatty liver)與非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)兩種連續性的肝臟傷害，前者為單純的脂肪浸潤現象，無法看到肝細胞形態上的變化；而後者則能觀察到伴隨脂肪浸潤發生的發炎現象與肝細胞氣球化 (hepatocellular balloning)的現象(Puri and Sanyal, 2012)。

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(Rinella and Charlton, 2016) 圖一、NAFLD 的世界盛行率

1.2 二次打擊學說

關於 NAFLD 進程的發生原因，現行最被廣為接受的說法為「二次打擊學說 (“two-hit” theory)」：首先，「第一次打擊」為肝細胞的脂肪堆積，而胰島素抗性(insulin resistance)也在其中扮演重要角色。接著，脂肪浸潤的發生會使肝臟易受到促發炎細胞激素 (pro-inflammatory cytokines)、脂肪細胞激素 (adipokines)、氧化壓力 (oxidative stress)等因素影響而產生發炎現象，此為第二次打擊(Paschos and Paletas, 2009)。最後，NAFLD 可能在未被改善的情況下繼續發展成肝纖維化(fibrosis)、肝硬化(cirrhosis)及肝癌(Hepatocellular carcinoma)等嚴重的肝臟傷害(圖二)(Younossi et. al., 2018)。

Figure 1. The worldwide prevalence of non-alcoholic fatty liver disease

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(Younossi et. al., 2018) 圖二、NAFLD 與肝臟傷害間的進程關係

1.3 動情素與非酒精性脂肪肝的關係

NAFLD 的發生除了與肥胖相關外，目前也有研究指出來自女性動情素 (estrogen)的訊號會影響 NAFLD 的患並風險，例如缺乏內源性動情素分泌的透納氏症(Turner’s syndrome)患者，為罹患脂肪肝的高風險性族群。相反地，在女性還未達到停經期(menopause)前，發生脂肪肝或其他代謝疾病的機率會小於同年齡男性(Hart-Unger, 2017)。Palmisano et. al., 2017 的文獻中也指出女性的動情素訊號可調節兩項肝臟負責的脂質運輸過程：一為減少脂肪酸被運送至肝臟；二為增加肝臟利用極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)所運輸出去的三酸甘油酯，因此在缺乏動情素的情況下，

肝臟將容易蓄積更多脂肪，造成 NAFLD 的發生。

Figure 2. The progression of NAFLD

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2. 經產家禽的脂肪肝疾病 2.1 出血性脂肪肝

出血性脂肪肝(Fatty liver hemorrhagic syndrome, FLHS) 為好發於肥胖 (97.5%)、持續產蛋(69.7%)、雌性家禽(99%)的非傳染性疾病，其影響除了造成產蛋減少外，嚴重情況下將造成禽體死亡(Trott et. al., 2014)。FLHS 因為患病禽體並沒有明確的外顯病徵，所以難以從仍存活的禽體上進行診斷，不過在病理解剖後則會觀察到以下徵狀：(1)蓄積於肝臟的脂肪讓肝臟呈現淺黃色(圖三 A)；(2)腹腔中充滿大量油脂；(3)肝臟及腹腔可見因微血管破裂的出血或血塊存在(Rozenboim, 2016)。另外，在肝臟組織切片的結果中也可以看到脂質空泡遍布於肝細胞周圍(圖三 B)(Trott et. al., 2014)。而 Shini and Bryden, 2009 對七群來自澳洲昆士蘭州中三座農場的籠養雞隻進行死因探討，經屍體解剖後發現有 36%-42%死亡雞隻符合 FLHS 的症狀，並指出 FLHS 的發生將可能造成母雞在產蛋期間達到 5%的死亡率，為商業上飼養產蛋家禽發生死亡的主要原因之一。

(Trott et. al., 2014) 圖三、FLHS 的肝臟外觀與切片下形態

Figure 3. The appearance and biopsy of the liver with FLHS

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2.2 FLHS 的發生原因

2.2.1 脂質於肝臟堆積的途徑

圖四、家禽肝臟中脂質堆積的來源

關於產蛋家禽肝臟中脂質堆積的來源與途徑，早在 Butler, 1976 的文獻中就進行討論，文中指出蓄積於肝臟的脂質來源有來自飲食中的碳水化合物、脂肪等外源性因素以及內源性的脂肪組織儲存(adipose tissue depots)。

而造成脂質在肝臟堆積的主要途徑則有以下四種：(1)肝臟的脂質生成作用 (lipogenesis)增加；(2)從肝臟中運輸出去的脂質減少；(3)蓄積於脂肪組織中的脂質減少；(4)減少肝臟中進行的脂質代謝。透過以上途徑，若肝臟中積聚過量脂肪，會讓產蛋家禽形成脂肪肝，而家禽的飼養環境、飼糧配置以及內泌素的分泌等皆與 FLHS 的發生具有相關性(圖四)。

Figure 4. The source of hepatic lipids

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2.2.2 飼養環境

在家禽飼養環境方面，許多文獻皆指出籠飼或是高密度飼養下的產蛋家禽，因為活動空間受限，在能量攝取與耗損不平衡的情況下，容易造成肥胖，讓脂肪蓄積於組織器官中(Butler, 1976; Shini et. al.,2006; Mete et. al., 2013)。另外，在環境溫度開始升高的春、夏兩季，FLHS 的盛行率也會較高 (圖五)( Trott et. al., 2014)，其中原因推測可能來自熱緊迫(heat stress)的發生，在緊迫的情況下，家禽體內的內分泌系統將被啟動以應付刺激，詳細機制會在後文探討。

( Trott et. al., 2014) 圖五、FLHS 的季節性分布

Figure 5. The seasonal distribution of FLHS

Gray bar: FLHS

White bar: backyard fly (BYF)

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2.2.3 飼糧配置

就飼糧配置而言，目前在產蛋家禽上已建立許多透過飼糧誘導而成的脂肪肝模式，例如在高碳水化合物處理下，家禽體內的糖解作用(glycolysis)增加，未被消耗的多於能量將以脂質的形式在體內儲存，也讓脂肪能於肝臟積聚，造成脂肪肝(Butler, 1976)。另外，家禽飼糧中若缺乏甲硫胺酸

(methionine)、膽鹼(choline)、維生素 B12、維生素 E 等親脂因子(lipotropic factor)存在，肝臟中三酸甘油酯的堆積將增加，形成脂肪肝(Choi et. al., 2012)。最後，Rozenboim et. al., 2016 以低蛋白高脂肪飼糧(low protein high fat diet, LPHF) 餵飼 26 週齡的產蛋母雞，在 16 週處理後，發現其產蛋率下降，並且肝臟中的脂肪含量顯著高於未經任何處理的控制組，另外在組織切片的觀察結果中，也發現 LPHF 處理組的雞肝細胞周圍具有明顯的脂肪空泡存在，顯示在 LPHF 的餵飼下，處於產蛋期內的母雞可被成功誘導脂肪肝的發生。

2.2.4 內泌素(圖六)

與人類女性相同，動情素的分泌對產蛋家禽的脂肪肝形成也存在極大關連。當雌性家禽在發身(puberty)後進入產蛋週期，動情素的增加會造成以下兩種生理影響：(1)進行卵黃生成(vitellogenesis)，意即成長中的卵(growing oocyte)會堆積三酸甘油酯，而卵黃自身幾乎不進行內生性脂質合成(de novo lipogenesis)，其脂質來源來自肝臟，因此在動情素的誘導下，肝臟的脂質生成行為將大量提升以符合產蛋所需(Leveille et. al.,1975)；(2)與人類女性相似，在動情素的刺激下，將造成血漿中脂質攜帶者如 VLDL 及蛋黃生成素 (vitellogen)的大量分泌，在兩者將肝臟中的三酸甘油酯攜出至血漿運輸的情況下，也造成產蛋家禽會有高血脂(hyperlipidemia)的現象發生(Hermier et. al., 1996)。但是，VLDL 及蛋黃生成素的大量增加並不足以防止肝臟中脂質生成增加而造成的脂質堆積(Hermier et. al., 1996)。因此處於產蛋週期的雌性家

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禽，在動情素的誘導下，自然地在肝臟會有大量脂肪蓄積，而形成脂肪肝。

除了動情素之外，另一個與脂肪肝生成相關的內泌素為在緊迫狀態下會分泌的促腎上腺皮質素(ACTH)及升醣素(glucagon)，兩者的分泌除了水解脂肪組織儲存的脂質以應付緊急情況外，也會加速第二信使(second messenger) 環腺苷酸(cyclic AMP)的生成，傳遞抑制脂蛋白脂解酶(lipoprotein lipase)活性的訊號，而與肝臟脂肪浸潤的發生有所關聯(Butler, 1976)

圖六、內泌素影響產蛋家禽肝臟中脂質堆積的途徑

2.3 日本鵪鶉的天然性脂肪肝

蛋用日本鵪鶉為蛋雞外另一種常被飼養的產蛋家禽，根據中央畜產會的說明：目前臺灣的飼養數量約有 300-400 萬隻，日產蛋量約 15-20 公噸，並且在產業經濟上的效益有逐年增加的現象。進入產蛋期的鵪鶉，同樣在動情素的影響下，會因 VLDL 的增加而造成高血脂，同時也會增加肝臟中脂質生成的進行，而自然地形成脂肪肝。相較於蛋雞，日本鵪鶉在飼養上的優勢在於其個體體積較同齡蛋雞小，因此飼糧採食量較少，所需的飼養空間也較小。此外，相較於蛋雞會更早地進入產蛋週期：根據聯合國糧食及農業組織

Figure 6. The role that hormone plays on hepatic lipid accumulation

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(FAO)的資料顯示：蛋雞平均在 22 週齡才開始進入產蛋週期，32-35 週齡才進入產蛋高峰；但日本鵪鶉約在 38.9 日齡時會開始產蛋，並且在 15 週齡時就會達到產蛋高峰(Dorgan et. al., 2013)。因此，考慮實驗操作時間與投入的資源，日本鵪鶉不失為一個家禽模式中良好的模式動物選擇(Huss et al., 2016)。

2.4 判斷禽體脂肪肝程度的方法 2.4.1 肝臟外觀評分

在前文中有提到：當患有 FLHS 的禽體經解剖後，會看到肝臟表面顏色呈現淡黃，且會有微血管破裂而產生出血點或血塊的徵狀。因此，在 FLHS 相關的研究中，如欲判斷實驗禽體肝臟的脂肪堆積程度，會透過肝臟外觀評分作為判斷標準之一。如圖七所示，Rozenboim et. al., 2016 將解剖後所觀察到的肝臟外觀，依顏色變化與出血情況作為評判標準，分為五個等第：首先，顏色鮮紅、正常健康的肝臟，評為 0 分；接著，沒有出血，但肝臟顏色開始變淡、變黃，評為 1-2 分；肝臟開始有小部分出血，評為 3 分；

最後，肝臟及腹腔內可見大量出血點與血塊時，評為 4-5 分。此方法被廣泛接受，不過因執行須經病理解剖，無法預先為仍存活的禽體進行評斷

(Rozenboim et. al., 2016)

Figure 7. The scoring system of FLHS 圖七、脂肪肝外觀評分

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2.4.2 血漿中的脂肪肝生物標記(fatty liver biomarker)

根據美國食品藥物管理局（U. S. Food and Drug Administration, FDA）的定義，生物標記是指生物體內能作為對正常生理或病理過程進行客觀評估的指標。在家禽的脂肪肝模式下，Tsai et. al., 2017 證實在脂肪肝程度越嚴重 (肝臟外觀評分越高)的禽體血漿中，DPP4、GST、GLUL、AACS 等四種蛋白的濃度也將增高(圖八)。因此認為此四種蛋白在血漿中的濃度，可作為判斷禽體是否患有脂肪肝的生物標記，其中當產蛋母雞的血漿中：DPP4 濃度達到 49.0 pg/mL 以上；GST 濃度超過 7.2 IU/L；GLUL 濃度大於 97.0 ng/mL 以及 AACS 濃度為 6.0 ng/mL 以上時，有極高信心程度(95%)可被診斷為脂肪肝。

圖八、血漿中生物標記與肝臟外觀評分間的關係

Figure 8. The relation between plasma biomarker for FLHS and the level of fatty liver AACS: Acetoacetyl-CoA synthetase; DPP4: Dipeptidyl-peptidase 4;

GLUL: Glutamine synthetase; GST: Glutathione S-transferase

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2.4.3 脂質合成相關基因 mRNA 表現量

在前文中提過，處於產蛋期的雌性家禽，因為在動情素的調控下，大幅增加禽類肝臟內脂質合成的進行，使得過多的三酸甘油酯於肝臟內蓄積，因此，在判斷家禽脂肪肝程度的方法上，也可依據分子證據，透過檢測參與肝臟脂質合成進行的相關調控因子在 mRNA 或經轉譯後蛋白質表現量的多寡，其中參與脂質合成進行的酵素如 fatty acid synthase (FAS)、Acetyl-CoA carboxylase (ACC)，以及調控此反應進行的轉錄因子 SREBP1c 皆是主要的檢測目標(圖九)( Zang, 2016)。

(Zang, 2016) 圖九、脂質生成作用

Figure 9. Lipogenesis

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3. 護肝物質 (hepatoprotective ingredients) 3.1 北蟲草 (Cordyceps militaris)

蟲草屬(Cordyceps spp.)植物的藥用價值自古傳誦至今，也讓其珍貴性在 許多亞洲國家間廣為流傳，其中在代謝症候群(metabolic syndrome)的改善上，北蟲草的藥用效果已被許多實驗證實。首先，在以高脂飼糧(high fat diet)誘導第二型糖尿病(type II diabetes)的小鼠模式上，北蟲草子實體及菌絲體的處理具有降低血漿中葡萄糖、膽固醇及三酸甘油酯的效果(Yu et. al., 2015)。另外，Li et. al., 2013 同樣在小鼠模式上，發現北蟲草能透過降低胰島素抗性(insulin resistance)以調控脂質代謝的進行，因而改善以高脂飼糧誘導的肝臟脂肪浸潤現象，具有改善非酒精性脂肪肝的潛力。此外，北蟲草經萃取後的成分中也具有上述效果，實驗證實 C57BL/6 小鼠在餵飼含有 1%北蟲草萃取物的醇化飼糧(AIN-93G)的情況下，其血漿中的葡萄糖及游離脂肪酸含量皆顯著低於僅餵飼醇化飼糧的小鼠，另外，也能顯著降低肝臟中三酸甘油酯與總脂質含量，顯示北蟲草含有的有效成分中，應具有能降低血脂、

肝臟中脂肪的效果。(表十) (Choi et. al., 2014)

(Choi et. al., 2014) 表一、北蟲草在改善飼糧誘導的代謝疾病上的功效

(24)

3.2 靈芝 (Ganoderma lucidum)

靈芝是另一種珍貴中藥材，早在明朝李時珍所著的本草綱目中就提及其有補肝氣的效用，被視為仙草、百草之王。因此，許多研究也針對靈芝在護肝功效上提出證據。首先，Meneses et al., 2016 將靈芝萃取物應用在餵飼高膽固醇飼糧(high cholesterol diet)以誘導代謝疾病發生的 C57BL/6 小鼠上，發現高濃度靈芝處理組(1%靈芝萃取物+高膽固醇飼糧)在血漿中總膽固醇含量降低，並與高膽固醇飼糧組間達到差異，且達到與投入降膽固醇藥—辛伐他丁(simvastatin)相同的成效(圖十 A)。此外，在肝臟總膽固醇含量的檢測結果中，同樣在高濃度靈芝處理組中有下降的效果，且在高膽固醇組與辛伐他丁組間都達到顯著差異(圖十 B)。實驗中也檢測了 FAS、ACC、及 SREBP-1c 的 mRNA 表現量，發現在靈芝處理的情況下，其表現量皆顯著低於高膽固醇飼糧組(圖十 C)，顯示靈芝中存在的有效成分，能透過調節參與脂質生成相關因子的表現程度，改善飲食誘導造成的肝臟膽固醇累積(圖)。其他研究中也能看到靈芝處理能改善小鼠在使用四氯化碳(CCl4)、硫乙醯胺

(thioacetamide, TAA)進行腹腔注射後，所誘導發生的肝纖維化現象。(Lin and Lin, 2006; Wu et.al., 2010)。

(25)

Figure 11. The effect of G. lucidum on ameliorating dirt-induced metabolic disorder

圖十一、靈芝在改善飼糧誘導的代謝疾病上的功效

(Meneses et al., 2016)

(26)

4. 研究目的

因為在人類及禽類體內主要(90%)進行內源性脂質生成的場所皆為肝臟 (Laliotis et. al., 2010)，加上人類女性及雌性產蛋家禽蓄積脂肪於肝臟皆受到動情素的影響，使得 NAFLD 與 FLHS 間有極高相似性。因此，產蛋家禽的脂肪肝模式應能成為評估護肝物質成效的良好平台。然而，目前探討北蟲草及靈芝應用於改善肝臟傷害的相關研究中，所使用的主流動物模式仍為小鼠。因此，本試驗的目的是希望透過日本鵪鶉的天然脂肪肝模式，於日常飼糧中添加不同濃度的北蟲草及靈芝，了解兩者對肝臟脂肪堆積程度造成的影響，並在後續以細胞模式探討，來自不同萃取方式的有效物質對日本鵪鶉初代肝細胞 (primary hepatocytes)造成的生理影響。

(27)

貳、材料與方法

一、實驗動物

本研究共進行兩次動物試驗，所使用的蛋用日本鵪鶉皆來自相同的商業鵪鶉場。在第一次動物試驗中(圖十一 A)，選用 35 隻 40 週齡的母日本鵪鶉，並依據初始血脂分成 7 組(n=5)，包括控制組 (Ctrl..)、蟲草 0.5%組 (Cord. 0.5%)、蟲草 1%組 (Cord. 1%)、蟲草 2%組 (Cord. 2%)、靈芝 0.5%

組 (Gano. 0.5%)、靈芝 1%組(Gano. 1%)以及靈芝 2%組 (Gano. 2%)，在處理 12 週後犧牲採樣。在第二次動物試驗中(圖十一 B)，則使用 60 隻 5 日齡的母日本鵪鶉，自 14 週齡起依據初始血脂分成 5 組(n=12)，分別為控制組(Ctrl.)、蟲草 1%組 (Cord. 1%)、靈芝 0.5%組 (Gano. 0.5%)、靈芝 1%組 (Gano. 1%)以及靈芝 2%組 (Gano. 2%)，並在 12 週處理後(26 週齡)及 20 週處理後(34 週齡)進行兩次犧牲採樣，每次犧牲從各組中隨機選取 6 隻，共犧牲 30 隻。動物飼養在經臺灣大學實驗動物管理小組檢驗合格之動物禽舍，並將環境溫度控制在攝氏 23-25 度間、濕度維持在 60-70%。飲水及飼料任飼。於試驗期間，每日紀錄採食量及產蛋量；每四週進行一次採血，

每次犧牲會採集肝臟、腹部脂肪及胸部肌肉進行後續分析。

(28)

圖十一、動物試驗進行流程圖

A.

B.

Figure 11. The experiment design for animal model TAG: triacylglycerol

CHOL: cholesterol

(29)

二、飼糧配製

控制組所用的日常飼糧購自與實驗動物來源相同的商業鵪鶉場，飼糧經近似分析後所得的灰分、水分、粗蛋白質(crude protein, CP)及粗脂肪 (crude fat, CF)佔比如表二所示。而根據 Omidiwura et. al.,2016 的資料顯示，日本鵪鶉飼糧的最適代謝能為 3100-3200 kcal ME/k；最適粗蛋白質比例為 24-26%。試驗中所使用的日常飼糧 CP%約為 23.67%，符合鵪鶉正常生理需求。飼糧中所添加的蟲草來源來自商業公司提供的菌絲體粉末；靈芝來源則來自靈芝農場提供的乾燥子實體全株切片，靈芝切片會在配置前會將以乾磨機切碎。各實驗組飼糧每次配置的最終重量為 3 kg，並依據所需濃度分別加入 15 g (0.5%)、30 g (1%)、60 g (2%)的蟲草粉及靈芝碎片，以飼料混勻機充分攪拌後置於-20℃冰箱存放，使用前於室溫下回溫。

表二、日本鵪鶉日常飼糧的近似分析結果

(30)

三、採食量及隻日產蛋率之計算

試驗期間，每日皆會進行實驗動物的狀態觀察，並記錄各組別飼料添加量及產蛋數，再按照以下算式計算隻日採食量：

各組飼料盒重+每日飼料添加量-(剩餘飼料重+飼料盒重) 7 (日) x 各組隻數

隻日產蛋率之計算則由如以下所示：

各組每日產蛋數之總和 7 (日) x 各組隻數

四、血漿三酸甘油酯、膽固醇之測定

血液以 25 G 針頭經翅膀靜脈進行採集，每次收集約 300 μL 並置入含有 3 μL 抗凝血劑 (EDTA)的微量離心管 (1.5 mL)中，於室溫中靜置 30 分鐘等待血漿析出，再以 2000 rpm 離心 10 分鐘後取上清液。後以 Randox 套組 (CH200、TR210)按照廠商指示進行測定。

五、肝臟三酸甘油酯含量測定

取約 0.1 g 重的肝臟組織放入 1.5 ml 微量離心管後，加入 1 mL 的 5% NP-40 (Sigma)溶液，經均質後，以 85℃水浴 (5 min) 冰浴 (5 min) 的流程重複 3 次。後以 4000 xg, 10 min 離心取上清液，再以 Randox 套組 (CH200、TR210)按照廠商指示進行測定。

六、肝臟組織石蠟切片及 H&E 染色

犧牲時會採集日本鵪鶉的肝臟右葉組織放入卡匣(cassettes)，接著投入冰冷的 10%甲醛溶液 (10% formalin)中，存放於 4℃冰箱中固定數日。

之後以 1x PBS 洗淨，並委託台大獸醫系進行石蠟切片及 H&E 染色。

隻日採食量 =

(31)

七、肝臟組織冷凍切片及油紅染色 (oil red O staining)

將犧牲時所採集的肝臟右葉組織放入卡匣後，以冰冷的 4%聚甲醛溶液(4% paraformaldehyde)固定至少 24 小時，接著以 15%蔗糖水溶液(24hr)

 30%蔗糖水溶液(48hr)的脫水程序處理，之後再以 OCT 進行包埋後放入-80℃冰箱，待蠟塊形成後以冷凍切片機(Leica CM 1950)進行切片，每片厚度為 5μm，完成後置於 4℃冰箱內保存，並於一個月內完成油紅染色程序。

染色前，切片先於室溫下回溫(30 min)，接著泡入冰冷的 10%甲醛溶液固定 10 分鐘，完成後以二次水清洗，稍待數分風乾後，以滴管滴加 100%丙二醇(propylene glycol)於切片上，靜置 2 分鐘後去除，藉此攜帶多餘水分。之後再滴加 60℃的 0.5% oil red O (Sigma) 溶液於 60℃烘箱中靜置 30 分鐘，在染色完成後，滴加 85%的丙二醇水溶液(以二次水配置) 於切片，靜置 2 分鐘後去除，在以二次水清洗後，使用蘇木精

(hematoxylin)快染，切片會在滴加蘇木精的 10 秒後，快速置入流動的自來水 3 分鐘以洗淨蘇木精。切片洗淨後即可以水性封片膠進行封片。最後，以顯微鏡觀察及拍攝染色結果。

八、肝臟組織的 RNA 抽取與相關基因表現量之測定

肝臟組織的 RNA 抽取過程如下(皆於冰上進行)：首先，取下約 0.05g 的新鮮肝臟組織(約紅豆大小)，並置入於 1 mL 的GENEzol™

Reagent (GZR200 )中，以均質機打碎，再添加 200μL 的氯坊

(chloroform)進行萃取。接著，將萃取溶液搖晃數十秒後，以 4℃、14000 g 離心 15 分鐘，取出 500μL 上清液至新離心管。之後，再加入同體積 (500 μL)的 99%酒精溶液進行沉澱。隔日，先以 4℃、14000 g 的條件離心 10 分鐘，再去除上清液，保留沉澱物，並重複沉澱 3 次。在最後一次離心後，改添加 500μL 的 75%酒精水溶液，再以同條件離心，最後去除

(32)

上清液所留下的沉澱物，即可以滅菌後的二次蒸餾水進行回溶，完成 RNA 萃取步驟。

萃取後的 total RNA 在測定濃度之後，即可使用 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)進行反轉錄作用合成

cDNA。接著便可進行 Real-time PCR 分析，過程使用 SensiFastTM Real- Time PCR Kits 並以 Step One Plus Real-Time PCR System (Applied

Biosystems)進行基因表現量的定量分析。PCR 反應為 95℃ 2 分鐘後，即進行 40 cycles 的 denaturation 95℃ 5 秒、annealing 60℃ 10 秒以及 elongation 72℃ 20 秒的反應。目前實驗所使用的 primer sets 序列如下：

表三、基因表現量檢測所使用之引子序列

F: forward sequence; R: reverse sequence APOV1

(33)

九、日本鵪鶉肝臟細胞的初代培養

表四、日本鵪鶉肝臟細胞初代培養所需灌流溶液配方

初代培養日本鵪鶉肝臟細胞所需準備的灌流溶液如表四所示，在使用前必須確保所有溶液為無菌狀態。細胞試驗皆須在無菌的細胞操作台進行，所使用的任何器具則需先以滅菌釜進行滅菌。細胞培養過程如下：首先，在犧牲日本鵪鶉後先於酒精溶液中浸泡清洗，並在無菌操作台中以手術器具採下完整肝臟組織，置入培養盤中。接著，在依序以 50 Ml Perfusion buffer I  50 mL Perfusion buffer II  50 mL Perfusion buffer III 及 25 mL Perfusion buffer IV 進行灌流。灌流結束後，以滴管吸取肝臟組織置入 25 mL Perfusion buffer IV 中，並以 37℃水浴 15 分鐘。之後，

使用40μm 的濾網進行過濾，濾液再以 700 g 於室溫中離心 5 分鐘。最

(34)

後，在倒掉上清液後，加入 25mL Perfusion buffer V 清洗，並以同條件離心，清洗步驟重複三次後，即可以含 10% FBS、1% antibiotics 的 DMEM 培養液種植細胞於 12 孔盤。

十、靈芝萃取物製作 (一) 熱水萃取物

靈芝水萃物的取得過程如下：首先，以 1 g 靈芝子實體對 40 mL 二次蒸餾水的比例進行萃取，接著，將熱水加熱至沸騰狀態，

並持續 1 小時。在收取第一次萃取溶液後，再次以滾水加熱 1 小時。最後，收取萃取溶液並以 125 mm 的濾紙進行過濾。水萃物保存於-20℃冰箱中，使用前需先以 0.22μm 的針頭過濾器去除微生物，才可使用於細胞試驗。

(二) 酒精萃取物

製作靈芝酒萃物的方法則是將靈芝子實體置入純乙醇中，並在加熱狀態下，以蒸餾方式進行萃取溶液收集，直到萃取液呈現無色。接著，在壓力下降的過程中，萃取物會沉澱濃縮，最終取得靈芝的酒精粗萃取物(ethanol crude extract)。

十一、細胞試驗處理條件

(一) 靈芝水萃物對日本鵪鶉初代培養肝細胞的影響

試驗中所採用的三種靈芝水萃物濃度為 3 ng/mL、30 ng/mL 及 300 ng/mL，當肝細胞貼附培養盤底部且並未觀察到異狀，即可以 1x PBS 溶液清洗。接著，於 12 孔盤的每格中添加 1 mL 新培養液 (含 phenol red)及 10μL 的靈芝水萃物，並讓萃取物濃度在與培養液綜合後，達到所需濃度。最後，在培養 24 小時後，以 1 mL 的 GENEzol™ Reagent (GZR200 )收取細胞，並抽取細胞 RNA。

(35)

(二) 靈芝酒萃物對日本鵪鶉初代培養肝細胞的影響

在參考 Shimizu et. al., 2009 的文獻後，試驗中所選用的三種靈芝酒萃物濃度為 0.01 μg/mL、1 μg/mL 及 100 μg/mL，同樣在肝細胞貼附於培養盤底部且並未觀察到異狀後，即可以 1x PBS 溶液清洗。與水萃物處理不同之處在於：為了確認靈芝酒萃物的動情素相似活性，此次試驗中所使用的 DMEM 培養液並不含 phenol red。因為 phenol red 被廣泛認為是一種微弱的動情素(Berthois et.

al., 1986)。所以，此細胞試驗是在清洗後於 12 孔盤的每格中添加 1 mL 不含 phenol red 的 DMEM 培養液(內含 10% FBS、1%

antibiotics)，接著，再讓每格培養盤在添加 10μL 的靈芝酒萃物後，

達到上述所需濃度。最後，於培養 24 小時後，以 1 mL 的 GENEzol™ Reagent (GZR200 )收取細胞，並抽取細胞 RNA。

十二、統計分析

試驗數據以 one-way analysis of variance (ANOVA)及 Dunnett’s multiple comparison 方法進行計算，分析結果以 P ≤ 0.05 表示具有統計顯著性。

(36)

參、實驗結果

1. 於日常飼糧中添加不同濃度的蟲草及靈芝對 40 週齡日本鵪鶉的影響

1.1 隻日採食量與隻日產蛋率

圖十二 A 呈現實驗期間內日本鵪鶉在七組飼糧處理下的採食量變化，

結果顯示各處理組間在隻日採食量上並未出現顯著差異，表示研究中所配置的七種飼糧並沒有造成 40 週齡的日本鵪鶉在採食量上的負面影響。

另外，在圖十二 B 的結果中可見，於 12 週實驗期內，各處理處間的隻日產蛋率並無統計上的差異，顯示飼糧中不同的蟲草或靈芝添加量，並不會影響日本鵪鶉的正常產蛋生理。

圖十二、飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝對 40 週齡日本鵪鶉在採食及產蛋上的影響。

(A)隻日採食量。(B)隻日產蛋率

Figure 12. Feed intake and egg production rate of 40-week-old Japanese quails in response to different concentration of C. militaris and G.lucidum included in daily diet.

(A) feed intake and (B) egg production. n=5. Mean ± S.E.M.

(37)

1.2 血漿三酸甘油酯(TAG)及膽固醇(CHOL)含量

試驗期間內，每四週的血漿三酸甘油酯(圖十三 A)及膽固醇(圖十三 B) 含量在七個處理組間並未存在顯著差異，顯示飼糧中含有的北蟲草及靈芝無法有效的降低日本鵪鶉因動情素影響而產生的高血脂。另外，也因為各組內日本鵪鶉在血漿 TAG 及 CHOL 的濃度表現上會有極大的波動幅度，因而造成在實驗統計上出現較大的標準誤差。

圖十三、飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝對 40 週齡日本鵪鶉在血脂濃度的影響。

(A)血漿三酸甘油酯濃度。(B)血漿膽固醇濃度。

Figure 13. Plasma lipid levels of 40-week-old Japanese quails in response to different concentration of C. militaris and G.lucidum included in daily diet. (A) plasma

triacylglycerol and (B) plasma cholesterol. n=5. Mean ± S.E.M.

(38)

1.3 肝臟三酸甘油脂含量測定

在十二週實驗期結後進行日本鵪鶉犧牲，其肝臟組織在單位重量內的 TAG 含量結果如圖十四所示，在控制組的結果中可見：因內泌素影響而造成組內個體在肝臟的脂質堆積程度出現差異，造成統計分析上極大的標準誤差，但仍能從蟲草處理(圖十四 A)以及靈芝處理(圖十四 B)的結果中發現日本鵪鶉肝臟內三酸甘油酯含量下降的趨勢。

圖十四、飼糧中不同濃度的蟲草及靈芝對 40 週齡日本鵪鶉在肝臟三酸甘油酯含量上的影響。(A)蟲草組。(B)靈芝組

(A)血漿三酸甘油酯濃度。(B)血漿膽固醇濃度。 Figure 14. Hepatic triacyglycerol content of 40-week-old Japanese quails in response to different concentration of C. militaris and G.lucidum included in daily diet. (A) C.

militaris treatment group and (B) G.lucidum treatment group. n=5. Mean ± S.E.M.

Hepatic TAG – Cordyceps group

Hepatic TAG – Ganoderma group

(39)

1.4 肝臟組織切片經油紅染色的定量結果

圖十五呈現七個處理組在肝臟組織經冷凍切片後進行油紅染色的結果，

從結果中可見：首先，在控制組結果(圖十五 A)中可以看到大量的油紅染色區域，顯示在僅餵飼日常飼糧的情況下，也會造成大量的三酸甘油酯堆積於日本鵪鶉的肝臟，形成天然性脂肪肝。接著，在北蟲草 1%(圖十五 C)的切片結果中可見油紅染色區域明顯低於控制組；而在靈芝處理組的結果中，則能發現 40 週齡的日本鵪鶉不論在靈芝 0.5% (圖十五 E)、1% (圖十五 F)或 2% (圖十五 G)的處理下，皆能從肝臟切片上看到明顯少於控制組的油紅染色區域。此外，利用圖像軟體 (Image J) 將染色區域進行定量後的結果如圖十六所示，也證明在北蟲草 1%(圖十六 A)以及三種靈芝處理組(圖十六 B)的肝臟切片，其油紅染色區域顯著地低於控制組，也代表著 40 週齡的日本鵪鶉在此四種飼糧處理下，相較於只餵飼一般日常飼糧的鵪鶉而言，肝臟脂肪堆積的情況明顯降低。

(40)

圖十五、40週齡日本鵪鶉在不同濃度的北蟲草及靈芝處理下其肝臟切片經油紅染色的結果。(A)控制組。(B)北蟲草0.5%組。 (C)北蟲草1%組。(D)北蟲草2%。(E)靈芝0.5%組。(F)靈芝1%組。(G)靈芝2%組。 Figure 15. Oil red O staining of liver of 40-week-old Japanese quails in response to different concentration of C. militaris and G.lucidum included in daily diet. (A) control group (B) C. militaris 0.5% group (C) C. militaris 1% group (D) C. militaris 2% group (E) G.lucidum 0.5% group (F) G.lucidum 1% group and (G) G.lucidum 2% group.

(放大倍率200x)

(41)

圖十六、40 週齡日本鵪鶉肝臟切片的油紅染色區域定量結果 (A)北蟲草組。(B)靈芝組

Figure 16. Quantification of oil red O staining of liver in Japanese quails in response to different concentration of C. militaris and G.lucidum included in daily diet. (A) C.

militaris treatment group and (B) G.lucidum treatment group.

n=5. Mean ± S.E.M. *P<0.05 vs. control.

(A. U.)

(42)

1.5 小結：

綜合以上結果，不同濃度的北蟲草及靈芝添加到日本鵪鶉日常飼糧中並餵飼 12 週後，對 40 週齡的日本鵪鶉在生理上以及肝臟脂質堆積程度上的影響，可總結成以下 4 點：

(1) 40 週齡的日本鵪鶉在只餵飼日常飼糧下，會形成天然性脂肪肝。

(2) 飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝並不會影響日本鵪鶉的採食量，也不會對產蛋率產生負面影響。

(3) 飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝對動情素影響下的高血脂並有改善的效果。

(4) 北蟲草 1%以及 3 種濃度的靈芝處理(0.5%、1%、2%)有降低日本鵪鶉肝臟脂質堆積的潛力。

但因為此次實驗所使用的日本鵪鶉在實驗起始週齡為 40 週，在實驗期內，

部分鵪鶉的產蛋性能已大幅下降，也讓受到動情素影響而產生波動的血漿 TAG、肝臟 TAG 濃度等數據，存在極大的組內標準差。因此，這部分的實驗設計與結果將做為第二次動物實驗的設計參考，並在第二次動物實驗中，選用處於產蛋高峰前期的 14 週齡日本鵪鶉作為實驗動物，再次確認日常飼糧中所添加的 1%北蟲草及 0.5%、1%、2%等三種濃度的靈芝對日本鵪鶉生理產生的影響。

(43)

2. 於日常飼糧中添加不同濃度的蟲草及靈芝對 14 週齡日本鵪鶉的影響

2.1 隻日採食量

此次 20 週試驗期內，日本鵪鶉在餵飼五種不同飼糧下的隻日採食量如圖十七所示，其中可以看到在實驗開始的第 1 週至第 16 週，五種飼糧處理組之間，日本鵪鶉的隻日採食量並無差異，且各組間變化走勢相近。但在實驗的最後四週(17-20 weeks)，控制組鵪鶉的隻日採食量顯著高於其餘 4 組處理組，但因沒有後續時間點的採食量數據作為依據，所以並無法對控制組鵪鶉在最後四週隻日採食量變動走向大幅提升的結果做出定論，此變動也可能來自鵪鶉在採食動作上的改變或是人為測量上的誤差。

整體而言，對 12 週齡的日本鵪鶉而言，在日常飼糧中添加蟲草及不同濃度的靈芝進行餵飼並不會對採食量產生負面影響。

2.2 隻日產蛋率

在隻日產蛋率方面，從圖十八中可見在實驗期 20 週處理下，日本鵪鶉的隻日產蛋率在五種飼糧處理組之間並無顯著差異，表示在日常飼糧中添加蟲草及不同濃度的靈芝對 14 週齡的日本鵪鶉而言，並未影響其產蛋效能。

(44)

圖十七、飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝對 14 週齡日本鵪鶉在隻日採食量上的影響。

Figure 17. Feed intake of 14-week-old Japanese quails in response to different

concentration of C. militaris and G.lucidum included in daily diet. n=12.Mean ± S.E.M.

圖十八、飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝對 14 週齡日本鵪鶉在隻日產蛋率上的影響。

Figure 18. Egg production rate of 14-week-old Japanese quails in response to different concentration of C. militaris and G.lucidum included in daily diet. n=12. Mean ± S.E.M.

(45)

2.3 血漿三酸甘油酯(TAG)及膽固醇(CHOL)含量

五種飼糧處理組在 20 週處理下，每四週所採集到的血漿 TAG 及 CHOL 濃度如圖十九所示。首先，就血漿 TAG 的測定結果(圖十九 A)而言，於最初四週處理後(4-week-treated)，靈芝 0.5%組的血漿 TAG 濃度顯著地低於控制組，但在後續實驗期內卻不見相同趨勢，所以推測此差異並不來自飼糧處理所造成的生理影響，而是在內泌素影響下造成的波動。另外，在 20 週處理後(20-week-treated)，則可見蟲草 1%組及靈芝 1%組的血漿 TAG 濃度下降，且與控制組間達到統計上的差異，但因沒有後續時間點數據，並無法解釋此下降趨勢來自生理變動又或是飼糧處理下的影響。接著，就血漿 CHOL 的測定結果(圖十九 B)討論，同樣只見在最初四週處理下(4-week-treated)，

靈芝 0.5%組的血漿 CHOL 濃度顯著低於控制組，但由於後續所收集結果中不見持續的下降效果，因此，推測此差異應同樣來自動情素所帶來的生理波動。

總結來說，因受到經產日本鵪鶉動情素分泌的影響，血脂測定結果也容易受到血液採集時間的影響，而在組內及組間皆有著無法控制的個體差異，

但整體而言，從結果中可推測：於日常飼糧中添加蟲草及不同濃度的靈芝，

對日本鵪鶉的在進入產蛋高峰後發生的天然性高血脂並無改善效果。

(46)

圖十九、飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝對 14 週齡日本鵪鶉在血脂濃度上的影響。

(A)血漿三酸甘油酯濃度。(B)血漿膽固醇濃度。

Figure 19. Plasma lipid levels of 14-week-old Japanese quails in response to different concentration of C. militaris and G.lucidum included in daily diet. (A) blood

triacylglycerol and (B) blood cholesterol. n=5. Mean ± S.E.M. *P<0.05 vs. control.

(47)

2.4 脂肪肝生物指標—血漿 DPP4 含量

DPP4 是會隨著肝臟傷害而被分泌至血漿的蛋白質，其在血漿中的濃度會與雞隻脂肪肝的嚴重程度呈正相關，因而適合作為預判脂肪肝的生物標記。圖二十呈現五個處理組在 12 週處理後及 20 週處理後兩次犧牲時間點的血漿 DPP4 濃度，其中，圖二十 A 的結果中，可以看到靈芝 0.5%組及靈芝 1%組的血漿 DPP4 濃度顯著低於控制組，表示在此兩種處理下的日本鵪鶉，肝臟中堆積脂肪的程度較控制組輕微。但拉長處理時間至 20 週，控制組及其餘 4 種處理組之間的血漿 DPP4 濃度並無統計上的差異，顯示在 20 週處理後，控制組與其餘飼糧處理組間在肝臟的脂肪蓄積量上並無明顯不同。

總結而言，從以上結果可以推測：添加 0.5%及 1%的靈芝於日常飼糧中並餵飼 14 週齡的日本鵪鶉 12 週後，脂肪肝的嚴重程度獲得改善，但處理時間繼續拉長，則改善的效益將會減弱，所以在 20 週處理後並無法看到添加蟲草或靈芝有降低日本鵪鶉脂肪肝程度的效果。

(48)

圖二十、飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝對 14 週齡日本鵪鶉在血漿 DPP4 濃度上的影響。

(A)飼糧處理 12 週後。(B) 飼糧處理 20 週後。

Figure 19. Plasma DPP4 concentration of 14-week-old Japanese quails in response to different concentration of C. militaris and G.lucidum included in daily diet. (A) after 12- week-treated and (B) after 12-week-treated . n=6. Mean ± S.E.M. *P<0.05 vs. control.

(49)

2.5 12 週處理下的肝臟組織 H&E 染色結果及油紅染色結果

在此次實驗中因有兩次犧牲時間點，所以後續與日本鵪鶉肝臟生理相關的結果，都會以兩個處理間點進行說明。首先，圖二十一呈現 14 週齡的日本鵪鶉在飼糧處理 12 週後，其肝臟組織經 H&E 染色的結果，其中可見控制組(Ctrl.)切片中存在數量多且面積大的白色空泡(黑色箭頭)，此為肝臟油滴於 H&E 染色下的形態，顯示 14 週齡的日本鵪鶉在僅餵飼一般日常飼糧的情況下，也會形成天然性脂肪肝。然而，在蟲草 1%組的切片中 (Cord.

1%)，其白色空泡所占面積與控制組間並沒有明顯可見的差異，代表在 1%

蟲草的 12 週處理下，對 14 週齡的日本鵪鶉並沒有顯著影響肝臟脂質堆積情況的效果出現。相對地，在靈芝 0.5%組(Gano. 0.5%)及靈芝 1%組(Gano. 1%) 的染色結果中可見，其白色空泡量明顯少於控制組，表示其肝臟的脂質堆積情況較輕微，此結果也可與血漿 DPP4 的檢測結果(圖二十 A)相呼應；但相反地，在靈芝 2%組(Gano. 2%)中卻看到比控制組更大量的白色空泡，甚至已有氣球化(ballooning，黃色箭頭處)的形態出現，顯示其肝臟內脂防堆積程度相當嚴重，已達到可被定義為脂肪肝炎的細胞形態。

同樣地，在油紅染色的結果中(圖二十二)也可以看到與上述 H&E 染色結果相同的趨勢：首先，控制組(Ctrl.)有著明顯可見的染色區域，表示在餵飼日常飼糧的情況下，日本鵪鶉的肝臟組織中也會有大量脂肪堆積的現象。接著，在北蟲草 1%組(Cord. 1%)的染色結果中，仍可見面積小但數量多的油紅染色區域，整體而言，其與控制組間在染色面積上並沒有顯著可見的差異。此外，靈芝 0.5%組(Gano. 0.5%)及靈芝 1%組(Gano 1%)僅有少量的油紅染色區域，顯示其肝臟的油滴堆積情況相對而言較不嚴重。最後，在靈芝 2%組中可見大量的油紅染色區域，其範圍明顯多於控制組，表示在靈芝 2%

的處理 12 週後，會讓 14 週齡的日本鵪鶉肝臟內堆積大量脂肪，形成嚴重的脂肪肝症狀。

(50)

從以上結果可以做出以下推測：於飼糧中添加 1%北蟲草並餵飼 12 週後，對 14 週齡的日本鵪鶉在肝臟脂質堆積狀況並未出現明顯影響。但在低濃度的靈芝(0.5%及 1%)處理 12 週後，可以改善 14 週齡日本鵪鶉因動情素影響而生成的天然性脂肪肝，然而，在 12 週的高濃度靈芝(2%)處理下，14 週齡的日本鵪鶉肝臟內反而有更嚴重的脂質堆積發生。

肝臟組織切片的染色結果可以最直接地呈現不同飼糧處理對肝臟生理造成的影響與變化，但後續也還需要透過統計上的定量分析，讓結果更具說服力道。因此，為了支持 H&E 染色所呈現的結果，而對肝臟中的三酸甘油酯含量(圖二十三)進行檢測。另外，油紅染色的結果也使用圖像軟體(Image J) 進行染色區域的定量，並以控制組為基準，比較相對染色區域的大小(圖二十四)。

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圖二十一、14週齡日本鵪鶉在北蟲草及不同濃度的靈芝處理12週後其肝臟切片經H&E染色的結果。 (A)控制組。(B) 北蟲草1%組。(C)靈芝0.5%組。(D)靈芝1%組。(E)靈芝2%組。 Figure 21. H&E staining of liver of 14-week-old Japanese quails in response to different concentration of C. militaris and G.lucidum added in daily diet after 12-week-treated. (A) control group (B) C. militaris 1% group (C)G.lucidum 0.5% group (D) G.lucidum 1% group and (E) G.lucidum 2% group.

(放大倍率200x)

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圖二十二、14週齡日本鵪鶉在北蟲草及不同濃度的靈芝處理12週後其肝臟切片經油紅染色的結果。 (A)控制組。(B) 北蟲草1%組。(C)靈芝0.5%組。(D)靈芝1%組。(E)靈芝2%組。 Figure 22. Oil red O staining of liver of 14-week-old Japanese quails in response to different concentration of C. militaris and G.lucidum added in daily diet after 12-week-treated. (A) control group (B) C. militaris 1% group (C)G.lucidum 0.5% group (D) G.lucidum 1% group and (E) G.lucidum 2% group.

(放大倍率200x)

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2.6 12 週處理下的肝臟三酸甘油酯(TAG)含量結果及油紅染色定量結果在肝臟 TAG 的含量檢測(圖二十三 A)中可以看到支持上述肝臟組織切片經 H&E 染色後呈現的趨勢：首先，北蟲草 1%組的肝臟 TAG 含量與控制組間並無統計上的差異。接著，靈芝 1%組的肝臟 TAG 含量明顯低於控制組；但靈芝 2%組的肝臟 TAG 含量顯著地高於控制組。最後，雖然沒有與控制組間達到統計上的差異，但仍可見靈芝 0.5%組有較低的肝臟 TAG 含量。

另一方面，在油紅染色的定量結果(圖二十三 B)中，可以看到以下趨勢：首先，北蟲草 1%組的油紅染色範圍經統計上的分析後，與控制組間並無差異。接著，靈芝 0.5%組及靈芝 1%組的染色區域雖未與控制組間達到顯著差異，但仍呈現較少的染色面積。最後，從結果中可以確定靈芝 2%組的油紅染色區域顯著多於控制組。以上結果，可為前文中對肝臟切片形態的相關分析，提供明確的統計數據。

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圖二十三、飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝在 12 週處理下對 14 週齡日本鵪鶉在肝臟脂質堆積程度的影響。(A)肝臟內三酸甘油酯含量。(B)油紅染色定量結果

Figure 23. The level of hepatic lipid accumulation of 14-week-old Japanese quails in response to different concentration of C. militaris and G.lucidum included in daily diet.

after 12-week-treated. (A) hepatic triacylglycerol content and (B) the quantification of oil red O staining area. n=12. Mean ± S.E.M. *P<0.05 vs. control.

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2.7 20 週處理下的肝臟組織 H&E 染色結果及油紅染色結果

接著，14 週齡的日本鵪鶉在餵飼五種飼糧 20 週後，其肝臟組織經 H&E 染色的結果如圖二十四所示，從結果中可以看到控制組(Ctrl.)的肝臟組織中仍有許多白色空泡存在，表示 14 週齡的日本鵪鶉在餵飼日常飼糧 20 週後，其肝臟內依然有大量脂肪堆積，天然性脂肪肝的症狀依然持續。接著，

若將此次切片形態與 12 週處理後的結果(圖二十一)進行比較，可以發現兩項相似趨勢：一、靈芝 2%組(Gano. 2%)的白色空泡在數量及面積上皆大於控制組(Ctrl.)，顯示肝臟堆積情況在靈芝 2%組中仍較控制組嚴重。二、在靈芝 1%組的結果中(Gano 1%)，雖然出現面積較大的白色空泡，但整體而言，

因其白色空泡數量少於控制組，所以仍可見較輕微的脂質堆積清況。而與 12 週處理不同的情況在於：原先在靈芝 0.5%組中可以看到少於控制組的脂肪空泡數量，但在 20 週處理下，靈芝 0.5%(Gano.0.5%)組的白色空泡表現量並不少於控制組，並且可以在切片中看到些許氣球化的形態(黃色箭頭處)，

顯示若拉長靈芝 0.5%處理至 20 週，其對 14 週齡日本鵪鶉在降低肝臟脂質堆積的效果將減弱。另外，從 H&E 染色結果中，雖無法觀察到北蟲草 1%

組(Cord 1%)的空泡數量與控制組之間具有明顯差異，但其單一空泡的面積並不大於控制組中所見。

另外就油紅染色結果進行討論，其結果如圖二十五所示，可以看到控制組(Ctrl.)仍有明顯可見的油紅染色區域，顯示其肝臟內脂肪堆積的情況仍相當嚴重。接著以控制組作為比較基準進行比較，可觀察到在靈芝 0.5%組 (Gano 0.5%)及靈芝 2%組(Gano 2%)的油紅染色區域不亞於控制組；不過在北蟲草 1%組及靈芝 1%組中可以看到其油紅染色面積少於控制組。

整體而言，14 週齡的日本鵪鶉在五種飼糧處理 20 週後，其肝臟中脂質堆積的狀態，在 H&E 染色及油紅染色的結果中，可以看到相似的趨勢，而以下則針對上述分析，以肝臟三酸甘油酯含量檢測結果及油紅染色定量結果進行輔助說明。

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2.8 20 週處理下的肝臟三酸甘油酯(TAG)含量結果及油紅染色定量結果在肝臟 TAG 含量的檢測結果(圖二十六 A)中可見，五個飼糧處理組之間在肝臟 TAG 含量上並無統計上的差異，表示在 20 週處理下，添加北蟲草及靈芝的四組實驗飼糧，對 14 週齡的日本鵪鶉在肝臟內的脂質蓄積量並無顯著的改善效果。

另一方面，油紅染色的定量結果(圖二十六 B)則顯示北蟲草 1%組及靈芝 1%組的肝臟組織中，其油紅染色區域低於控制組，說明此兩組處理讓 14 週齡的日本鵪鶉肝臟內油滴堆積的情況得到些許改善。

上述兩種檢測結果皆可用以判斷肝臟內脂質堆積的程度，而兩者間在統計上並未出現相同趨勢的原因，可能出現在樣本採集的階段，雖然在採樣時統一收取肝臟右葉組織，但根據採集區域的不同，肝臟內的脂肪蓄積量也會出現變化，因此造成圖二十六的結果中，存在不盡相同的統計結果。不過綜合組織切片(圖二十四、圖二十五)與定量結果(圖二十六)而言，可進行以下推測：首先，14 週齡的日本鵪鶉經 1%北蟲草處理 20 週後，其肝臟內脂質堆積情況較控制組輕微，並在油紅染色區域的定量上出現統計上的差異，顯示其有改善日本鵪鶉天然性脂肪肝的潛力，但因沒有後續時間點的證據，因此無法斷定此效果的作用程度。接著，靈芝 0.5%組在 20 週處理下，其肝臟內的脂肪蓄積程度與控制組相似，表示原先在 12 週處理下可見的效果消失，說明若拉長處理時間，其改善肝臟脂肪堆積的影響將減弱。而在靈芝 1%組的結果中仍可發現，其肝臟內脂質堆積程度較控制組輕微，並有最少的油紅染色面積，說明在 14 週齡的日本鵪鶉天然性脂肪肝的模式中，靈芝 1%的處理有最佳的改善效果，但同樣因沒有後續時間點的證據支持，因此無法了解此改善效果能否延續。最後，靈芝 2%的處理對 14 週齡的日本鵪鶉而言，不論處理時間長短，皆會造成日本鵪鶉肝臟組織中有更明顯的脂質堆積情況。

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圖二十四、14週齡日本鵪鶉在北蟲草及不同濃度的靈芝處理20週後其肝臟切片經H&E染色的結果。 (A)控制組。(B) 北蟲草1%組。(C)靈芝0.5%組。(D)靈芝1%組。(E)靈芝2%組。 Figure 24. H&E staining of liver of 14-week-old Japanese quails in response to different concentration of C. militaris and G.lucidum added in daily diet after 20-week-treated. (A) control group (B) C. militaris 1% group (C)G.lucidum 0.5% group (D) G.lucidum 1% group and (E) G.lucidum 2% group.

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圖二十五、14週齡日本鵪鶉在北蟲草及不同濃度的靈芝處理20週後其肝臟切片經油紅染色的結果。 (A)控制組。(B) 北蟲草1%組。(C)靈芝0.5%組。(D)靈芝1%組。(E)靈芝2%組。 Figure 25. Oil red O staining of liver of 14-week-old Japanese quails in response to different concentration of C. militaris and G.lucidum added in daily diet after 20-week-treated. (A) control group (B) C. militaris 1% group (C)G.lucidum 0.5% group (D) G.lucidum 1% group and (E) G.lucidum 2% group.

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圖二十六、飼糧中不同濃度的北蟲草及靈芝在 20 週處理下對 14 週齡日本鵪鶉在肝臟脂質堆積程度的影響。(A)肝臟內三酸甘油酯含量。

(B)油紅染色定量結果

Figure 26. The level of hepatic lipid accumuation of 14-week-old Japanese quails in response to different concentration of C. militaris and G.lucidum included in daily diet.

after 20-week-treated. (A) hepatic triacylglycerol content and (B) the quantification of oil red O staining area. n=12. Mean ± S.E.M. *P<0.05 vs. control.

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2.9 肝臟中脂質生成相關基因檢測結果

在前文中根據肝臟組織切片及 TAG 含量測定等結果，了解五種飼糧處理對 14 週齡的日本鵪鶉造成的肝臟生理影響，為了釐清相關機制，因此以下將針對各種基因表現量進行說明。首先，在五種飼糧處理下，肝臟中脂質生成相關基因 FAS 的表現量如圖二十七所示，其中在 12 週處理下(圖二十七 A)，FAS 的肝臟表現量在靈芝 0.5%組以及靈芝 1%組中顯著低於控制組，因此可以推測此兩種處理會降低日本鵪鶉肝臟內進行的脂質生成作用，而減少肝臟中的脂質堆積量，為肝臟組織切片的染色結果提出解釋。

不過，從圖二十七 B 的結果來看，在 20 週處理下，五種飼糧處理組間並未在 FAS 的肝臟表現量上出現差異，說明若拉長餵飼時間至 20 週，原先在靈芝 0.5%處理及靈芝 1%處理下發現的改善效果將減弱，也為靈芝 0.5%

組的肝臟組織切片在 20 週處理下出現明顯的脂質堆積情況提出說明。此外，也可推測若實驗期繼續拉長，靈芝 1%組處理下所看到的改善效果將趨緩。