第四章 結果
第三節 組織切片觀察與分析
4-3-1 術側腓腸肌切片觀察
將地龍組中的實驗動物取其術側腓腸肌中段，固定、脫水、包埋、
切片、染色後，放置於顯微鏡下觀察。正常之腓腸肌切片可見肌纖 維呈現對稱多角形的緊密排列，細胞核則位於肌細胞的周圍 ( 圖 4-9 )
。在坐骨神經在截斷並經過手術值管後，可以發現術側橫紋肌有萎縮的 現象，肌纖維不管是實驗組或對照組，直徑皆明顯變小，肌纖維間的間 隙變寬且較疏鬆，而細胞核則明顯增多 ( 圖 4-10 )。雖然在含有再生軸 突的神經束中有明顯的神經刺激與傳導，不過，經過電生理檢測後卻推 翻上述的發現。我們發現，雖然再生的神經束中含有大量的軸突，但軸 突數量的增多並不一定會造成更大的肌肉收縮，反之亦然。
圖 4-9：正常之腓腸肌切片
圖 4-10：坐骨神經在截斷並經過手術值管後之腓腸肌切片
4-3-2 再生神經組織學切片分析
4-3-2-1 切片觀察
在進行完電生理測試後，我們將大白鼠犧牲並將其矽膠管中白色 之再生物質製成切片進行觀察。圖 4-11 ~ 4-13 及圖 4-15~4-17 是給藥 組的再生神經組織橫切面之圖片。透過光學顯微鏡，我們可以觀察到，
不管是添加中藥地龍或是川芎而再生之神經組織，均呈現出與原神 經組織相似的顯微構造。其中，我們可以觀察到神經外膜 ( epineurium )
、神經束膜 ( perineurium )、神經纖維以及週邊的結締組織。此外，透 過 Toluidine blue 的染色，在神經內膜 ( endoneurium ) 內可清楚看到許 多髓鞘化的軸突 ( myelinated axons )，而許旺細胞核散見在軸突當中。
此外，血管也在神經外膜與神經內膜中出現。我們在對照組的切片中
( 圖 4-14 和圖 4-18 ) 也觀察到相同於給藥組的結構。不過，相對於對
照組，給藥組中的再生神經明顯擁有較高的軸突數量，尤其是在地龍濃 度 31.25μg/ml 與川芎濃度 1.25 mg/ml 的切片中。而川芎濃度 125mg/ml 的切片中的軸突數則明顯少於對照組。
圖 4-11：中藥地龍濃度 31.25μg/ml 再生神經組織切片
動脈
靜脈
髓鞘化軸突
圖 4-12：中藥地龍濃度 125μg/ml 再生神經組織切片
圖 4-13：中藥地龍濃度 500μg/ml 再生神經組織切片
動脈 動脈
靜脈
髓鞘化軸突
髓鞘化軸突
圖 4-14：中藥地龍組之對照組再生神經組織切片
圖 4-15：中藥川芎濃度 1.25mg/ml 再生神經組織切片
動脈 靜脈
髓鞘化軸突 動脈 靜脈
髓鞘化軸突
圖 4-16：中藥川芎濃度 12.5mg/ml 再生神經組織切片 ( 400X )
圖 4-17：中藥川芎濃度 125mg/ml 再生神經組織切片
髓鞘化軸突
髓鞘化軸突
動脈
動脈
靜脈
靜脈
圖 4-18：中藥川芎組之對照組再生神經組織切片
4-3-2-2 統計分析
觀察再生神經組織切片之後，利用接於顯微鏡的數位相機拍下數 位影像，並採用彩色影像分析軟體 ( Image-Pro Lite Version 3.0, Media
Cybernetics, USA ) 進行計算。最後利用 SPSS 12.0 版統計軟體，採單因
子變異數分析 ( one-way ANOVA ) 法分析。本實驗統計上檢定的第一誤 差設定在 < 0.05，若 P< 0.05，則被認定有統計上的明顯差異。再生神經全部面積
地龍組
髓鞘化軸突
靜脈
動脈
針對地龍組的 A、B、C、D 四小組進行了再生神經全部面積之統 計，給藥組比對照組有增加之情形，但並未達到統計上的顯著差異 ( 圖
4-19，表 4-7 )。
表 4-7：地龍 A、B、C、D 四組再生神經全部面積之統計
組別
A B C D
平均值
( mm
2)
0.34 0.43 0.36 0.39
標準差
0.06 0.31 0.16 0.06
F 值 0.425
p 值 0.737
圖 4-19：地龍 A、B、C、D 四組再生神經全部面積之統計
川芎組
針對川芎組的 A、B、C、D 四小組進行了再生神經全部面積之統 計，B 組相對於對照組有增加之情形，但並未達到統計上的顯著差異
( 圖 4-20，表 4-8 )。
表 4-8：川芎 A、B、C、D 四組再生神經全部面積之統計
組別
A B C D
平均值
( mm
2)
0.31 0.39 0.32 0.3
標準差
0.09 0.17 0.08 0.09
F 值 0.888
p 值 0.46
圖 4-20：川芎 A、B、C、D 四組再生神經全部面積之統計
再生血管數目
地龍組
針對地龍組的 A、B、C、D 四小組進行了再生血管數目之統計，
四組數值並無明顯差異 ( 圖 4-21，表 4-9 )。
表 4-9：地龍 A、B、C、D 四組再生血管數目之統計
組別
A B C D
平均值
88 72 95 84
標準差36 35 75 31
F 值 0.355
p 值 0.786
圖 4-21：地龍 A、B、C、D 四組再生血管數目之統計
川芎組
針對川芎組的 A、B、C、D 四小組進行了再生血管數目之統計，
C、D 兩組相對於 A 組有明顯差異 ( 圖 4-22，表 4-10 )。
表 4-10：川芎 A、B、C、D 四組再生血管數目之統計
組別
A B C D
平均值
160 145 106 112
標準差59 65 39 46
F 值 1.560
p 值 0.209
圖 4-22：川芎 A、B、C、D 四組再生血管數目之統計
髓鞘化軸突數目
地龍組
針對地龍組的 A、B、C、D 四小組進行了髓鞘化軸突數目之統計，
B 組相對於其他三組有顯著的差異 ( P< 0.05 ) ( 圖 4-23，表 4-11 )。
表 4-11：地龍川芎 A、B、C、D 四組髓鞘化軸突數目之統計
組別
A B C D
平均值
4754 7673 5619 5052
標準差2411 3301 3200 1643
F 值 1.973
p 值 0.139
圖 4-23：地龍 A、B、C、D 四組髓鞘化軸突數目之統計
川芎組
針對川芎組的 A、B、C、D 四小組進行了髓鞘化軸突數目之統計，
B 組相對於 D 組有顯著的差異 ( P< 0.05 ) ( 圖 4-24，表 4-12 )。
表 4-12：川芎川芎 A、B、C、D 四組髓鞘化軸突數目之統計
組別
A B C D
平均值
5705 6548 5110 4390
標準差1652 2159 1623 1008
F 值 2.319
p 值 0.009
圖 4-24：川芎 A、B、C、D 四組髓鞘化軸突數目之統計
第 五 章 討 論
隨著科技的進步，各種器械化或高科技的電子產品越來越滲透進 入人類的生活中。雖然這樣的改變其意義在於改善人類的生活並提高各 種工作的效率，但也逐漸提高了人類遭遇意外的風險。而意外後對人體 所造成的傷害中，以神經損傷是最難處理與治療的。
神經再生的過程是相當複雜的，生物體內神經分布區域的些許差 異就會產生神經再生難易程度的不同。例如，在哺乳類動物體內的神經 系統就區分成中樞神經及周邊神經系統。由於中樞神經系統內的神經細 胞大多不含髓鞘，故相對周邊神經系統的而言，其再生能力有限且困難 許多。神經在損傷後，若沒有經過適當的處理，很容易產生神經瘤，而 這將嚴重影響受損神經恢復的狀況與功能。為了避免神經瘤的發生及解 決受損神經的再生問題，近年來透過各項研究發展出不同的神經修補技 術。
神經修復的重點在於採用何種方法及材料，可以讓神經的再生更 為完好並恢復到受損前的功能，而神經斷裂後的間隙則是影響修復結果 的最重要因素之一，故選用何種神經接合術與材料即成為了修復神經 時最重要的考慮因素。神經管接合術可視為在目前眾多神經修復技術 中，針對神經斷裂間隙較大時最好的治療方式。其使用的矽膠製神經管 具有高生物適應性及透明、高柔軟度等優點，除了可以避免體內產生的 排斥反應外，還具有導引及支持再生神經纖維成長，同時也提供一個絕
緣的環境，將會阻礙神經再生的細胞及其分泌物阻擋在管外。不過，神
們選擇了地龍與川芎作為研究之對象。我們知道，體內各細胞組織可以
祛瘀生新等多種作用，所以適應證非常廣泛，並不局限於瘀血證才可使 內酯 ( ligustilide )、川芎嗪 ( Tetramethylpyrazine ) 等，除了有抗血小板 凝集的功能【95】，還可以改善腦內的微循環，並增加腦皮質流量【96】，以 促進神經系統的恢復【90】。然而這兩種中藥對於截斷之神經細胞是否具有 促進再生之能力則尚不清楚，所以本論文之研究方向將探討地龍與川芎
對於截斷之神經細胞之再生能力，並以大鼠做為動物模型，將其坐骨神
( 31.25μg/ml、125μg/ml、500μg/ml ) 均成功的促使神經軸突長過缺
口，其成功率達 90%，相對於對照組則只有 60%的成功率。在組織型態( mitogen-activated protein kinase ) 路徑來促進蛋白質的合成作用，提高
表現量，並增加蛋白磷酸化的現象，使其活性提高，進而促使許旺氏細 胞之移動【97】。此外，研究也發現地龍會藉由促進 IGF-1 ( insulin-likegrowth factor-I ) 訊息路徑及其協調 P13K/Akt 路徑蛋白之表現，來促進
許旺氏細胞的存活與增生，進而導致神經的再生【98】。既然許旺氏細胞在 神經再生的過程中可以提供一個支持的作用，而地龍萃取液對於許旺氏 細胞的增生與存活又有促進的功能，故地龍在神經再生的過程中有其一 定重要的角色。然而，很不幸的，我們在電生理檢測方面，其結果均無法達到統
我們這項發現與 Gallo 等的發現相似【100】。他們的研究發現，當小 雞的背根神經節神經元生長錐 ( chick dorsal root ganglion neuronal
growth cone ) 培養在包覆著神經成長因子 ( NGF ) 的聚苯乙烯微粒子
中，其神經的成長會隨著 NGF 的濃度增加而受到抑制。他們相信，在 神經元上的兩個接受器，分別為 trkA 和 p75NTR 將會因細胞外的促進生 長物濃度增加而達到飽和，進而阻斷了細胞的反應。Boyd 和 Gordon 等指出神經元在高劑量的腦源性促進神經生長因
子 ( BDNF ) 下可能因功能性阻斷了 p75NTR 接受器而導致軸突再生的 抑制【101】，也證實了 Gallo 的發現。Mohiuddin 和 Hirata 等學者在其研究 中也說明，過量的促進神經生長物會抑制因軸突截斷後所誘發的生長相 關蛋白 ( growth-associated protein 43, GAP-43 )，進而導致受損神經不正 常的再生重組狀況【102,103】。他們的發現可以用來解釋為什麼在高劑量銀 杏葉酯 ( bilobalide ) 下再生的神經細胞會變得如此的不成熟。在電生理檢測部分，實驗組的結果相對於對照組均無法達到統計 上的顯著差異。這可能是因為在恢復的八週期間，各組動物術側的腓腸 肌呈獻嚴重萎縮的現象，或是因發生神經誤長之情況，例如感覺神經束 接到運動神經束【104】，而這項說法也得到 Clemente 等的研究支持。在
Clemente 等的實驗中發現，當矽膠管內的再生神經進行接合時，來自兩
端的感覺與運動神經是會發生誤接的情形，進而造成再生神經功能傳導 的紊亂。所以在電生理檢測下，無法提供再生神經傳導或功能恢復的正 確結果【105】。另一方面，中藥川芎內含許多純化物，其中包括了有阿魏酸
( ferulic acid )、川芎內酯( senkyunolide )、藁本內酯 ( ligustilide )、川芎
嗪 ( tetramethylpyrazine )等，而其中藁本內酯具有抗細胞增生的效果【106,107】。而川芎嗪則具有血管輸張、抗血小版凝集，甚至還可以降低缺
血性的腦損傷及避免興奮性神經毒性 ( excitoxicity ) 的產生【106】。根據
Shih 與 Yun-Lian Lin 等人的研究結果，川芎嗪被認為是中藥川芎中，
提供神經保護作用的的一個有效成分【106,108,109】。由於實驗進行時，我們 是以川芎的濃縮萃取液來進行測試，並沒有將其有效成分分離出來進行 個別的測試，因此，在這情況之下，有可能因川芎內的純化物互相產生 交互作用而降低了再生神經的成熟度與成功率。而這也提供我們未來一 個持續探討的方向。
第 六 章 結 論
中藥結合生醫材料對於神經損傷提供了另一項治療上的選擇。雖 然整個研究還在初步階段，但其開發的潛力值得我們重視。在本實驗 中，我們利用了中藥地龍與川芎結合矽膠管來探討神經再生之情形，其 結論如下：