實驗方法

3-2-1 製備矽膠管

此過程需於無菌操作台操作。首先，先準備矽膠管 72 支，每支 長 12mm。由於前後各 1mm 將做於縫合之用，故實際的間距長度為

10mm，管內空間則可提供試劑填入。將矽膠管浸泡於 75% 酒精中消毒

後，取出置於無菌培養皿中。每個培養皿置入十支，並放入烘箱中烘乾 後保存備用。

3-2-2 製備中藥萃取液

3-2-2-1 地龍

其萃取製備過程如下，第一次萃取：取地龍藥材 600 g 並加入蒸 餾水 7200 ml 在溫度 100℃下煎煮，持續一個小時後，將萃取液倒入貯 存桶。該殘渣放在室溫下揮發水分。第二次萃取：將 6000 ml 蒸餾水再 加入殘渣中煮沸，持續一個小時後，將萃取液倒入貯存桶與第一次萃取 液合併。第三次萃取：再加入 4800 ml 蒸餾水煮沸，持續一個小時後，

將萃取液倒入貯存桶，並將三次的萃取液合併。合併後的萃取液先經過 過濾，再以旋轉真空濃縮機 ( 約 65℃ ) 濃縮，即為地龍浸膏 ( 265

ml )。浸膏製成後將保存起來以備未來體內與體外試驗時使用 ( 置於

-20℃ 保存 )。

3-2-2-2 川芎

其萃取製備過程如下，取川芎藥材 650 g 磨成粉狀。然後分三次 加入去離子水 6500 ml 煎煮。每次煎煮持續一個小時。每次煎煮後均將 萃取液倒入貯存桶。最後並將三次的萃取液合併。合併後的萃取液先經 過過濾，再以旋轉真空濃縮機濃縮，即為川芎浸膏 ( 265 ml )。浸膏製 成後將保存起來以備未來體內與體外試驗時使用 ( 置於-20℃保存 )。

3-2-3 動物實驗

本實驗的目的，是要將已加入不同濃度的地龍與川芎兩種個別中 藥材之人造神經導管以手術縫合於雌性大鼠 ( Sprague Dawley, SD ) 右 側坐骨神經的 10 mm 斷面上，再飼養八週，觀察神經再生以及神經導 管降解情形。

3-2-3-1 動物分組

依神經管內不同濃度的地龍與川芎萃取液隨機分成兩大組。兩大 組下，再隨機細分成四小組。地龍組獲分配 40 隻 SD 大白鼠，其下四 小組各有十隻 SD 大白鼠。川芎組則獲分配 32 隻 SD 大白鼠，其下 四小組各有八隻 SD 大白鼠。分組如下：

地龍組：

Group A：對照組 → Normal Saline Group B：實驗組 → 地龍 31.25μg /ml Group C：實驗組 → 地龍 125μg /ml Group D：實驗組 → 地龍 500μg /ml

川芎組：

Group A：對照組 → Normal Saline Group B：實驗組 → 川芎 1.25 mg /ml Group C：實驗組 → 川芎 12.5 mg /ml Group D：實驗組 → 川芎 125 mg /ml

大白鼠在進行手術後委託中國醫藥大學動物中心代為飼養。飼養 環境為中央空調房間，每一隻大鼠單獨飼養於一個籠子，溫度為 22±3

℃，相對溼度為 55±5%，自由飲水，供給標準大鼠實驗飼料 ( 福壽公 司，台灣 ) 加以餵養。

3-2-3-2 實驗步驟與方法

手術前先將大白鼠秤重，然後再將大白鼠放入透明麻醉箱，使用 氣體麻醉機進行麻醉。麻醉劑為 AErrane^®

( Isoflurane )，初始劑量是 5

litter/kg‧min。待大白鼠昏迷後，將大白鼠自麻醉箱中取出，並將麻醉

機塑膠管套於大白鼠口鼻上以持續輸送麻醉劑，此時麻醉劑量則改為 2

litter/kg‧min。在大白鼠失去意識後，將大白鼠予以左側躺，擺出右側

向上側臥姿勢，右膝彎曲，並以右側股骨頭 ( femur ) 的位置為中心，

在上下各約 3 cm 範圍內，將大白鼠臀部及大腿的毛剔除。剃毛區以

Betadine

^® 自中心開始由內向外進行消毒三次，最後再覆以無菌洞巾，

只露出欲手術的部位。

消毒完成之後，先以拇指及食指找到大鼠右側之股骨大轉子

( greater trochanter of femur ) 及外側豆狀骨 ( lateral fabella ) 予以定

位，並用 15 號手術刀沿此兩點之連線劃開皮膚。然後利用鈍性方式分

在神經與導管縫合完畢後，麻醉劑量隨之改為 1 litter/kg‧min。

此時，以 4-0 Catgut chrom 縫線縫合大鼠的肌肉及皮膚。縫合結束後，

再將醉劑量改為 0.5 litter/kg‧min，並讓大白鼠持續麻醉五分鐘，其目 的是為了讓矽膠管內的溶液有充足的凝結時間，以避免在大白鼠甦醒後 因活動而造成溶液從矽膠管中流出。手術結束後，將大鼠秤重，然後放 回籠子，並以鎢絲燈泡照光來維持體溫，避免失溫死亡，靜待大鼠甦醒。

3-2-3-3 術後 0 ~ 8 週狀態觀察與變化

術後，大白鼠被送往中國醫藥大學動物中心代為飼養照料八週。

每具籠子飼養一隻大白鼠，被飼養在具有空調的房間中，半日照環境，

溫度被控制在 22±3℃，而相對濕度為 45±5%。術後三日供應含有抗生素 之飲水，即以 Pamoxicillin^®

1 g 溶解於 100 ml 逆滲透水中，以預防傷

口感染。第四日起恢復供應正常逆滲透飲水。大白鼠每日正常供應飼 料，及更換木屑墊料。八週的期間，需觀察大鼠有無死亡、自殘、飲食、

大小便、傷口、毛色、行動等狀況，並以記錄。待八週後再加以秤重。

3-2-3-4 觀察神經再生情形

術後八週，再次將大白鼠麻醉、剃毛，及使用 Betadine^® 消毒。

然後定位出大鼠右側之股骨頭大轉子及外側豆狀骨，沿此兩點連線用手 術刀劃開皮膚，並以鈍性方式分離股二頭肌 ( biceps femoris muscle ) 與 筋膜。接下來以肉眼觀察神經導管降解情形、神經再生情形，並予以拍 照紀錄。

3-2-4 神經電生理檢測實驗 ( Electrophysiological methods )

電生理實驗的目的，主要是要測量在植入神經導管處的大鼠肌肉 對電刺激的反應，以觀察坐骨神經功能恢復的情形，並比較對照組與實 驗組是否具有統計上的顯著差異。

3-2-4-1 實驗步驟與方法

大鼠在植入導管飼養八週期滿後，進行重新麻醉並以手術解剖觀 察其神經再生情形及導管的降解狀態。接下來繼續以手術分離出附著於 脛骨之股二頭肌、腓腸肌，以及附著於坐骨神經分支周圍之脂肪層，讓 坐骨神經可以暴露於目光下。利用誘發電位儀 ( 機型 Neuropack Four

Mini，購自日本 Nihon Kohden Co. )，我們進行了神經肌肉動作電位之

誘發。首先，先將正負紀錄電極 ( recording electrode ) 其中一端分別插 入神經導管遠端之腓腸肌肌腱及肌腹處，另一端則接到電腦系統

( Biopac Systems, Inc., USA )。接下來再將一對刺激電極 ( stimulating electrode ) 置於神經導管近端 5mm 之坐骨神經幹以進行超強電刺激。當

刺激電極釋放出 2.0 mA 電流刺激神經時，經由再生神經的傳導，於誘 發電位儀上便可顯現神經肌肉複合動作電位（compound muscle action

potential, CMAP）波形。最後，將電位波形加以紀錄，並計算出潛期 ( latency )、波期（duration）

、振幅（amplitude）、波下面積、神經傳導速 率（conduction motor nerve velocity 或 nerve conduction velocity, NCV）

等值。

3-2-5 神經組織學切片分析

再生神經組織學切片評估的目的，係將再生神經採樣後製成切 片，以鏡檢觀察神經生長狀態，並比較實驗組與對照組兩者有無差異。

3-2-5-1 實驗步驟與方法

大鼠在經過電生理評估後，將其犧牲，並將神經導管連同再生的

神經組織一起取下，浸泡於 2.5% 戊二醛溶液 ( glutaraldehyde )。浸泡 三天後，取出含有神經組織之神經導管，並將其分成三等份，取中間一 等份進行採樣。將樣品保存於固定液中 ( 2.5% glutaraldehyde、4%

paraformaldehyde、0.1 M cacoadehyde 混合液 ) 1 ~ 2 日。之後，將樣品

從固定液中取出，隨即以 1% OsO₄ 固定約 2 小時，再以 50 ~ 95% 酒精 脫水，並用樹脂包埋後置入 60 ~ 70℃ 烤箱中約 16 小時。待樹脂硬化 後，將包埋之再生神經組織作橫向 5 μm 切片，再以 Toluidine blue 染 色。切片製備完成後，以光學顯微鏡 ( Olympus IX70, Olympus Optical

Co., Ltd., Japan ) 進行觀察與分析。

3-2-5-2 觀察切片

切片的觀察重點如下：

1. 再生神經組織的型態，神經幹的結構是否完整。神經外膜、內膜及圍

神經膜是否有成長。

2. 神經膜內是否有髓鞘化的軸突生成。

3. 再生神經組織中是否已有血管的形成。

3-2-6 組織學定量分析

3-2-6-1 拍攝照片

顯微鏡在 40 倍下，先以接於顯微鏡的數位相機 ( Nikon Coolpix

950, Japan ) 拍下再生神經組織切片的全樣貌圖。然後在顯微鏡 400 倍

下，可以清楚看到髓鞘化的軸突與新生的血管。在這個倍率下所拍攝的 照片適合用於彩色影像分析軟體 ( Image-Pro Lite Version 3.0, Media

Cybernetics, USA ) 進行分析與計算切片中髓鞘化的軸突。不過，由於在

顯微鏡 400 倍下的視野有可能無法涵蓋切片的全部，所以沿著再生神經 組織的直徑取三個區塊來拍攝，分別為直徑的四分之一、中點與四分之 三等三處。若在 400 倍下可拍攝到全景，則拍攝一張。

3-2-6-2 實驗步驟與方法

觀察再生神經組織切片之後，以接於顯微鏡的數位相機 ( Nikon

Coolpix 950, Japan ) 拍下數位影像。各培養格取三個定點拍攝三張，再

利用彩色影像分析軟體 ( Image-Pro Lite Version 3.0, Media Cybernetics,

USA ) 進行計算。最後利用 SPSS 12.0 版統計軟體，採單因子變異數分

析 ( one-way ANOVA ) 法分析。本實驗統計上檢定的第一誤差設定在 <

0.05，若 P < 0.05，則被認定有統計上的明顯差異。計算與分析的項目

包括有再生神經組織切面的全部面積、神經內膜面積、神經內膜面積佔 再生神經全部面積的百分比、再生血管數目、再生血管平均面積、再生 血管面積百分比、髓鞘化軸突數目、髓鞘化軸突的密度、髓鞘化軸突的 面積百分比。

第 四 章 結 果

第一節 觀察實驗大鼠外表之變化

4-1-1 一般外觀觀察結果

在坐骨神經接合術之後，將大白鼠飼養八週。這段期間，將從外 觀觀察其傷口癒合狀況，以及是否有死亡、自殘、厭食等情形。所有大 鼠在術後一週，其手術傷口皆已癒合，並無縫線脫落或腫脹化膿等情形 發生。所有大鼠於飼養期間皆存活，無死亡情形。

1. 傷口癒合情況

在術後使用三日的口服抗生素 Pamoxicillin^®，各組之大白鼠傷口癒合 狀況良好，並無發生感染之情形。大白鼠會在術後一星期左右將皮膚 縫合線咬斷，但不影響傷口之癒合。

2. 毛色變化

神經被截斷之後，大白鼠的毛色隨著時間的增加，由原本白色轉變成 淡黃色，且色澤也轉趨黯淡，並有脫落之狀況。

3. 行動

大白鼠的右坐骨神經被截斷之後，初期喜歡踡縮在籠子的角落。在一 段時間之後，右肢會呈現屈曲狀態。活動時以前肢及左後肢為主，拖 曳著右後肢而行，步態不穩。

4. 體重變化

在手術進行前及手術結束並飼養八週後犧牲前，分別記錄大白鼠的體 重變化。

5. 足趾自殘

在手術後的八週觀察期，部分大白鼠有自殘的現象發生。術側的足趾 被咬傷且有出血與傷口，而進一步造成潰瘍與變形，不過，大部分大 白鼠足趾是完整的。

4-1-2 矽膠管與神經再生之觀察

經過手術之大鼠飼養八週後，再次將其麻醉後解剖，麻醉與手術 步驟如前面所述。解剖後，可以藉由肉眼觀察到導管降解狀態以及神經 再生情形。

地龍組

1. Group A ( 生理食鹽水 )：此組為中藥地龍之對照組。十隻大白鼠均存

活，其中六隻在神經管中找到有一條白色再生的管狀物通過，四隻的 神經管內僅呈現有透明液體。

2. Group B ( 地龍 31.25μg/ml )：此組之十隻大白鼠均存活，其中九隻

在神經管中找到有一條白色再生的管狀物通過，只有一隻的神經管內 呈現透明液體。

3. Group C ( 地龍 125μg/ml )：十隻大白鼠均存活，其中九隻在神經管

中找到有一條白色再生的管狀物通過，只有一隻的神經管內呈現透明 液體。

4. Group D ( 地龍 500μg/ml )：十隻大白鼠均存活，其中九隻在神經管

中找到有一條白色再生的管狀物通過，只有一隻的神經管內呈現透明 液體。

川芎組

1. Group A ( 生理食鹽水 )：此組為中藥川芎之對照組。八隻大白鼠均存

活，其中七隻在神經管中找到有一條白色再生的管狀物通過，另一隻 的神經管內呈現有透明液體。

2. Group B ( 川芎 1.25mg/ml )：此組之八隻大白鼠均存活，全部八隻在

神經管中均找到有一條白色再生的管狀物通過。

3. Group C ( 川芎 12.5mg/ml )：全部八隻大白鼠均存活，全部大白鼠在

其神經管中均找到有一條白色再生的管狀物通過。

4. Group D ( 川芎 125mg/ml )：全部八隻大白鼠均存活，其中七隻在神

經管中找到有一條白色再生的管狀物通過，一隻的神經管內呈現有透 明液體。

4-1-3 神經再生之成功率

若將神經管內有白色再生的管狀物通過的大白鼠視為其神經組織 再生成功，則各組神經再生成功機率如下：

地龍組 ( 圖 4-1 )

1. Group A：生理食鹽水組為 6/10 = 60%

2. Group B：地龍 31.25μg/ml 為 9/10 = 90%

3. Group C：地龍 125μg/ml 為 9/10 = 90%

4. Group D：地龍 500μg/ml 為 9/10 = 90%

圖 4-1：中藥地龍組對神經再生之成功率

川芎組 ( 圖 4-2 )

1. Group A：生理食鹽水組為 7/8 = 87.5%

2. Group B：川芎 1.25 mg/ml 為 7/8 = 87.5%

3. Group C：川芎 12.5 mg/ml 為 8/8 = 100%

4. Group D：川芎 125 mg/ml 為 8/8 = 100%

圖 4-2：中藥川芎組對神經再生之成功率

第二節 神經電生理檢測結果

於手術八週後，我們針對大鼠施術端的坐骨神經進行電生理檢

於手術八週後，我們針對大鼠施術端的坐骨神經進行電生理檢

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