禽流感病毒簡介

第一章 緒論

1.1 禽流感病毒簡介

1.1.1 禽流感病毒的歷史

家禽流行性感冒(avian influenza)的文獻，最早要追溯回西元 1878 年的義大 利北部，由 Perroncito 記載雞群爆發嚴重的傳染性疾病，造成雞隻大量死亡，當 時稱為雞瘟(fowl plague)。最初雞瘟與急性敗血的家禽霍亂(fowl cholera)產生混 淆，而隨後於 1880 年由 Rivolta 與 Delprato 指出雞瘟的臨床與病理性質和家禽霍 亂有很大的差異，並將其命名為 Typhus exudatious gallinarum。在 1901 年，Centanni 與 Savunzzi 確認雞瘟是由一種濾過性病毒所引起，但直到 1955 年才由 Schäfer 證實此病毒是 A 型流行性感冒病毒(type A influenza virus)。於 1981 年在第一屆 禽流感國際研討會(International Symposium on Avian Influenza)中將雞瘟名稱正式 更名為高致病性家禽流行性感冒(highly pathogenic avian influenza, HPAI) (Lupiani and Reddy, 2009)。

最早的人類流行性感冒全球性大流行是 1918 年爆發的西班牙流感(Spanish flu)，造成全世界高達五千萬至一億人死亡，平均死亡率大於 2.5%。隨後是 1957 年的亞洲流感(Asian flu)和 1968 年的香港流感(Hong Kong flu)，同樣造成嚴重的 傷亡(Thomas and Noppenberger, 2007)。根據研究分析，1918 年西班牙流感的人 類流感病毒 H1N1，其基因可能來自於禽流感病毒。1957 年的亞洲流感 H2N2，

其 HA、NA 和 PB1 基因也來自於禽流感病毒，與人類流感病毒發生重組所致。

而 1968 年的香港流感 H3N2，亦發現是禽流感病毒的 HA 和 PB1，與人類流感 病毒 H2N2 產生重組所造成(Belshe, 2005)。因此，人類流行性感冒的全球大流行，

經由人流感病毒或禽流感病毒的抗原漂變(antigenic drift)與其之間基因重組的抗 原移變(antigenic shift)有十分密切的關係。1997 年在香港爆發高致病性禽流感 H5N1 感染人，才發現禽流感病毒可以直接跨越宿主屏障傳染給人，致死率超過 50% (Chan, 2002)。而 2013 年 3 月在中國大陸爆發人感染 H7N9 禽流感病毒之疫 情，此為全球首次低致病性 H7N9 禽流感病毒經基因重組引發高致病性人類感染 (Gao et al., 2013b)。由於流感病毒持續快速的演化與變異，對其基礎科學、公共 衛生、病毒監測、疫苗開發與治療方法的研究迫切重要。

1.1.2 流感病毒的分類

流行性感冒病毒在分類學上是屬於正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)。正黏液 病毒對紅血球表面的黏蛋白具有親和力，而使紅血球凝集(hemagglutination)的特 性，具有分段的單股負向 RNA (single-stranded antisense RNA)，作為其基因體。

流感病毒依核蛋白(nucleoprotein)或基質蛋白(matrix protein)的不同，可區分為 A、

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B、C 三型，A 型流感病毒可感染人、哺乳類動物(如豬、馬)與鳥類；B 型流感病 毒僅對人類致病；C 型流感冒病毒僅感染人和豬。A 型流感病毒依其病毒外套膜 上的血球凝集素(hemagglutinin, HA)與神經胺酸酶(neuraminidase, NA)兩種醣蛋 白(glycoprotein)可分為多種不同亞型，目前已發現 18 種 HA 亞型(H1-H18)與 11 種 NA 亞型(N1-N11) (Tong et al., 2013)。根據 1981 年世界世界衛生組織(World Health Organization, WHO)訂定的流感病毒命名規定，依照下列原則：

Type/Origin/Location/Number/Year (Subtype)；

抗原型(A、B、C 型)/宿主來源/分離地區/病毒編號/分離年代 (亞型)，

宿主若為人則省略訊息。

以本論文所使用的病毒株為例：

A/Taiwan/1/2013 (H7N9) 指的是

A 型流感病毒，宿主為人，分離自台灣，病毒株編號 1，分離於 2013 年，亞型 H7N9。

1.1.3 流感病毒的構造與型態

流感病毒在電子顯微鏡下呈現球狀或絲狀，呈現球狀的流感病毒，直徑大小 約在 80~120 nm；若呈現絲狀的病毒，長度可達 400 nm (Couch, 1996)。流感病毒 的結構由外而內可分為外套膜、基質蛋白與核心三部分(Nelson and Holmes, 2007)。

外套膜(envelope)

外套膜為包裹於病毒顆粒表面的雙層磷脂質(phospholipid bilayer)，這層膜來 自於宿主細胞的細胞膜。病毒外套膜上鑲嵌有兩種醣蛋白，分別是血球凝集素與 神經胺酸酶，由於突出病毒體外，被稱為棘突蛋白質(spike protein) (Nelson and Holmes, 2007)。

基質蛋白(matrix protein)

基質蛋白包含兩種，第一型基質蛋白(matrix protein 1, M1)構成病毒外殼骨架，

與病毒外套膜內側緊密結合，具有保護病毒內部核心與維持病毒空間結構的功能；

第二型基質蛋白(matrix protein 2, M2)，是位在病毒外套膜上穿膜的氫離子通道蛋 白(proton channel)，將氫離子運送至病毒內部，幫助病毒脫去外殼(Nelson and Holmes, 2007)。

核心(core)

病毒的內部核心包含了攜帶病毒遺傳訊息的 8 段單股負向 RNA，分別緊密 纏繞於核蛋白(nucleoprotein, NP)上，與轉錄遺傳訊息的 RNA 聚合酶(RNA polymerase)結合，形成病毒核醣核蛋白複合體(ribonucleoprotein complex, RNP) (Nelson and Holmes, 2007)。

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1.1.4 流感病毒的基因體

A 型流感病毒的基因體是由 8 段單股負向 RNA 所組成，每段基因編譯出不 同的蛋白質：第一段基因編碼 RNA 次單元聚合酶 PB2 (polymerase basic protein 2)；第二段基因編碼 RNA 次單元聚合酶 PB1 (polymerase basic protein 1)；第三段 基因編碼 RNA 次單元聚合酶 PA (polymerase acid protein)；第四段基因編碼血球 凝集素(hemagglutinin, HA)；第五段基因編碼核蛋白(nucleoprotein, NP)；第六段 基因編碼神經胺酸酶(neuraminidase, NA)；第七段基因編碼基質蛋白(matrix protein, M1 and M2)；第八段基因編碼非結構性蛋白(nonstructural protein, NS1 and NS2) (Nelson and Holmes, 2007)。

流感病毒 8 段基因可轉譯成 11 種蛋白質，其中第七段與第八段基因，因為 具有兩個不同的開放閱讀框架(open reading frame)，各可以轉譯出兩種蛋白質。

近年來所發現的病毒蛋白質 PB1-F2，是由 PB1 基因的選擇性閱讀框架讀架 (alternative reading frame)所產生的(Nelson and Holmes, 2007)。

1.1.5 流感病毒的蛋白質體

RNA 聚合酶(RNA polymerase)

RNA 聚合酶異構三聚體是由 PA、PB1 與 PB2 三個聚合酶次單元體構成的 RNA-dependent RNA polymerase，各次單元體彼此以 N 端與 C 端相互結合，組 成具有完整功能的聚合酶複合體，負責在宿主細胞內進行病毒 RNA 的轉錄 (vRNA→vmRNA)與複製(vRNA→cRNA→vRNA)。PB2 辨識並利用宿主 mRNA 的5’ cap，作為引子；PB1 負責延長由 PB2 啟始轉錄的 RNA，且具有內切酶的 功能；PA 具有蛋白酶(protease)的活性(Obayashi et al., 2008)。

核蛋白(nucleoprotein, NP)

核蛋白是 RNA 結合蛋白質(RNA binding protein)，與病毒 RNA 和 RNA 聚合 酶形成核醣核蛋白複合體(RNP)，具有細胞核定位訊號(nuclear localization signals, NLS)，可協助病毒 RNP 進入宿主細胞核中(Eisfeld et al., 2015)。

血球凝集素(hemagglutinin, HA)

血球凝集素是在病毒外套膜上的三聚體醣蛋白，能與動物的紅血球表面的受 體結合，引起凝血反應，故命名之。原態的血球凝集素(HA0)經宿主細胞的蛋白 酶切後，分成 HA1 和 HA2，兩者以雙硫鍵連結，前者可以與宿主細胞膜上的唾 液酸受體結合，後者則協助病毒外套膜與宿主細胞膜相互融合，所以血球凝集素 在病毒進入宿主細胞的過程中扮演重要角色(Webster and Rott, 1987)。

神經胺酸酶(neuraminidase, NA)

神經胺酸酶是在病毒外套膜上的四聚體醣蛋白，當成熟的病毒以出芽

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(budding)釋出時，藉由神經胺酸酶水解唾液酸(sialic acid)，破壞血球凝集素與宿 主細胞唾液酸受體的結合，使病毒順利脫離，避免病毒顆粒聚集於宿主細胞膜上 (Gong et al., 2007)。

基質蛋白(matrix protein, M)

病毒第七段基因編碼的基質蛋白 M 具有兩個不同的開放閱讀框架，可分別 轉譯出第一型基質蛋白(matrix protein 1, M1)與第二型基質蛋白(matrix protein 2, M2)。M1 是病毒中含量最多的蛋白質，構成病毒外殼骨架，連接病毒外套膜與 RNP，保護病毒內部核心與維持病毒空間結構(Noton et al., 2007)。M2 會組成四 聚體，在病毒外套膜上形成離子通道，當病毒進入宿主細胞時，M2 會使氫離子 送入內涵體內部，導致pH 降低，使得病毒脫去外套膜，將核心內的 RNP 釋放到 細胞質中，並轉運至細胞核內進行病毒RNA 的轉譯與複製(Stouffer et al., 2008)。

非結構性蛋白(nonstructural protein, NS)

病毒第八段基因編碼的非結構性蛋白 NS 具有兩個不同的開放閱讀框架，可 分別轉譯出第一型非結構性蛋白(nonstructural protein 1, NS1)與第二型非結構性 蛋白(nonstructural protein 2, NS2)。NS1 會抑制細胞 mRNA 聚腺苷酸化與離開細

胞核，促使病毒RNA 進入細胞質中進行轉譯，也會抑制宿主細胞的干擾素反應

(Hale et al., 2008)。NS2 又稱為 NEP (nuclear export protein)，一般認為會促進病 毒新合成的RNP 離開細胞核(Shimizu et al., 2011)。

1.1.6 流感病毒的生活史

流感病毒的生活史(life cycle) (Medina and Garcia-Sastre, 2011)。

吸附(virus attachment)

流感病毒藉由血球凝集素表面分子，辨識宿主細胞膜上表面醣蛋白或醣脂的 唾液酸，與其結合並吸附宿主細胞。一般而言，禽流感病毒以α-2,3 的方式與禽 類宿主細胞表面受體形成N-acetylneuraminyl-galactose (SA-α-2,3-Gal)，而人流感 病毒以 α-2,6 的方式與人類宿主細胞表面受體形成 N-acetylneuraminyl-galactose (SA-α-2,6-Gal) (Shinya et al., 2006)。

進入(virus entry)

病毒吸附後，經由Calathrin 的受體媒介內吞作用(clathrin-dependent receptor-mediated endocytosis)進入宿主細胞，形成內涵體(endosome) (Lakadamyali et al., 2004)。

脫殼(uncoating)

當病毒進入宿主細胞內的內涵體時，病毒外套膜上的離子通道M2 會活化，

將氫離子送入內涵體內部，導致pH 降低，干擾 M1 與 RNP 間的交互作用，並使 HA 結構改變，促使內涵體與病毒外套膜進行融合，讓病毒脫去外套膜，將核心

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內的RNP 釋放到細胞質中，藉由 NLS 運送至細胞核內進行病毒 RNA 的轉譯與 複製(Medina and Garcia-Sastre, 2011)。

複製(replication)

RNP 送入細胞核後，藉由病毒的 RNA 聚合酶複合體進行轉錄合成病毒 mRNA，為轉譯病毒結構蛋白所需，並複製病毒的基因組 vRNA。首先 PB2 利用 宿主 mRNA 的 5’ cap 作為引子，接著 PB1 開始進行 RNA 的轉錄與延長(Medina and Garcia-Sastre, 2011)。

組裝(assembly)

各種病毒蛋白質轉譯完成後，HA、NA 與 M2 會送至內質網進行醣基化作用 (glycosylation)修飾，再嵌入宿主細胞膜上。PA、PB1、PB2 和 NP 會送回細胞核 內，與複製完成的病毒RNA 結合成新生的 RNP，經由 M1 協助移動到細胞膜，

組裝成病毒顆粒(Medina and Garcia-Sastre, 2011)。

釋放(release)

組裝完成的病毒顆粒，經由出芽(budding)的方式釋放到細胞外，並將嵌有 HA、

NA 與 M2 的細胞膜作為病毒的外套膜，過程中 NA 會水解唾液酸，破壞 HA 與 宿主細胞唾液酸受體的結合，使宿主細胞可以釋放病毒顆粒(Medina and Garcia-Sastre, 2011)。