細胞培養

2.5.1 昆蟲細胞培養

Sf21 昆蟲細胞在含有 10%胎牛血清 (GeneDireX, USA) 的 Grace's Insect Medium (Gibco, USA)或無血清培養基 Sf-900^™ II SFM (Gibco, USA)中置於 27°C 恆溫培養箱內生長，可以單層貼附培養亦或懸浮培養，懸浮培養時需加入 Pluronic^® F-68 (Gibco, USA)保護細胞不受剪切力傷害，細胞的倍增時間為 24~30 小時，以1：5 的比例進行繼代培養(subculture)。

2.5.2 細胞解凍

自−80°C 取出細胞冷涷管置於冰上，快速放入 37°C 水浴中解凍 1 分鐘，將 細胞液取出加入至10 mL 培養基，以 300g 離心 10 分鐘，倒掉上清液去除 DMSO (dimethyl sulfoxide)。加入 15 mL 培養基回溶細胞團塊，取出加到 T-75 flask (GeneDireX, USA)貼附培養，隔日吸除細胞培養液，加入 15 mL 新鮮的培養基進 行培養。

2.5.3 細胞冷凍(Cryopreservation)

配置5% DMSO 的培養基細胞凍存液，將健康且生長旺盛的細胞以 300g 離 心10 分鐘，去除上清液，加入細胞凍存液回溶細胞團塊，取出 1 mL 加到細胞冷 凍管中置於冰上，最後放入−80°C 或液態氮中長期保存。

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2.6 桿狀病毒表現系統

本論文使用Bac-to-Bac^® Baculovirus Expression System (Invitrogen, USA)，可 快速且有效地生產重組桿狀病毒，其原理是利用 Tn7 轉位子(transposon)專一性 位置轉位作用(site-specific transposition)的特性產生重組 Bacmid DNA。將目標基 因選殖至 pFastBac^™載體內，基因表現會受到 Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) polyhedrin (PH) promoter 的調控，在昆蟲細 胞中大量表現。將pFastBac^™表現質體轉型入DH10Bac^™，藉由輔助質體表現的 轉位酶將目標基因片段轉位至Bacmid 中。將重組 Bacmid DNA 轉染到昆蟲細胞 中，可生產重組桿狀病毒。放大並獲得高效價的桿狀病毒液，用於感染昆蟲細胞，

進而大量表現目標重組蛋白質。

(Figure from Bac-to-Bac^® Baculovirus Expression System, Invitrogen)

2.6.1 質體轉型作用

將目標基因建構完成之 pFastBac^™ HT A 載體經由轉型作用轉入 E. coli DH10Bac^™中，藉由轉位作用至Bacmid。自−80°C 取出 50 μL E. coli DH10Bac 勝 任細胞置於冰上解凍，加入5 μL pFastBac construct 冰浴 30 分鐘後，於 42°C 的 乾浴槽內進行熱休克反應45 秒，再置於冰上 2 分鐘。加入 900 μL LB 培養液於 37°C、轉速 150 rpm 震盪培養 4 小時後，用 LB 培養液 10 稀釋後，取出 100 μL 菌液均勻塗佈在LB 培養盤(50 μg/mL kanamycin, 7 μg/mL gentamicin, 10 μg/mL

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tetracycline, 100 μg/mL X-gal, 40 μg/mL IPTG)上，於 37°C 培養 48 小時。使用藍 白篩選(blue/white selection)，挑選白色的單一菌落，再一次畫在新的 LB 培養盤 (50 μg/mL kanamycin, 7 μg/mL gentamicin, 10 μg/mL tetracycline, 100 μg/mL X-gal, 40 μg/mL IPTG)上，於 37°C 隔夜培養。

2.6.2 重組 Bacmid 之純化

挑選培養盤上的單一菌落置於4 mL LB 培養液(50 μg/mL kanamycin, 7 μg/mL gentamicin, 10 μg/mL tetracycline)進行隔夜培養，將菌液以 14000g 離心 1 分鐘，

去除上清液，加入0.3 mL Solution I (15 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 100 μg/ml RNase A; filter-sterilize and store at 4°C)回溶菌塊，加入 0.3 mL Solution II (0.2 N NaOH, 1% SDS; filter-sterilize)，混合均勻置於室溫 5 分鐘，加入 0.3 mL 3 M Potassium acetate, pH 5.5 (autoclave and store at 4°C)，混合均勻置於冰上 10 分 鐘，以14000g 離心 10 分鐘，將上清液加入含有 0.8 mL Isopropanol 的微量離心 管中，混合均勻置於−20°C 隔夜，在室溫以 14000g 離心 15 分鐘，小心移除上清 液，加入0.5 mL 70% 酒精，翻轉清洗沉澱物，在室溫以 14000g 離心 5 分鐘，盡 可能移除上清液，在室溫風乾沉澱物10 分鐘，加入 40 μL 無菌水回溶 DNA，保 存於4°C。

2.6.3 聚合酶鏈鎖反應檢驗

由於重組Bacmid DNA 大於 135 kb，因此利用限制酶分析非常困難，所以使 用聚合酶鏈鎖反應的方式來確認目標基因是否有接入 Bacmid，Bacmid 上含有 M13 Forward (-40)與 M13 Reverse 引子結合位，利用 M13 引子進行聚合酶鏈鎖反

應放大特定DNA 片段，藉由膠體電泳分析其大小，依據下表添加實驗材料於微

量離心管中，混合均勻後短暫離心。

Component Volume (μL) Final conc. (μM)

10 μM M13 Forward (-40) primer 1 0.5 10 μM M13 Reverse primer 1 0.5

10 mM dNTPs 0.4 200

5X Phusion HF Buffer 4 Phusion DNA Polymerase 0.2

ddH2O 12.4

Total 20

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將反應原料混合之微量離心管置於核酸增殖器中進行反應。PCR 反應程序 如下表所示。反應完成後純化目標DNA 片段。

Cycle step Temperature Time Cycles

Sample Size of PCR Product

Bacmid alone ~300 bp

Bacmid transposed with pFastBac^™ HT ~2430 bp + size of your insert

2.6.4 昆蟲細胞之轉染作用

在24-well 細胞培養盤中加入 2 mL Grace's Insect Medium (10% FBS)與 2×10⁵ 個Sf21 細胞，在 27°C 貼附至少 1 小時。取 1 μL Bacmid DNA 與 3 μL Cellfectin^® Reagent (Invitrogen, USA)混合，再加入 300 μL 無血清的 Grace's Insect Medium，

均勻混合後靜置30 分鐘。吸除細胞培養液，用無血清的 Grace's Insect Medium 清 洗細胞後並吸除，加入300 μL Bacmid:Cellfectin 複合液，以轉速 50 rpm 搖晃 1 小時，再移入27°C 培養箱避光培養 4 小時，吸除 Bacmid：Cellfectin 複合液，加 入500 μL Grace's Insect Medium (10% FBS)，27°C 避光培養 96 小時，收取細胞 上清培養液即為P1 病毒液(viral stock)，保存於 4°C。用培養基懸浮細胞，以 500g 離心5 分鐘，去除上清液，加入 1 mL PBS (130 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4, pH7.4)

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2.6.5 病毒效價檢測

本論文是參考Bac-to-Bac^® Baculovirus Expression System 實驗操作手冊利用 Viral plaque assay 測定桿狀病毒液的效價。在 6-well 細胞培養盤中加入 2 mL Grace's Insect Medium (10% FBS)的 1×10⁶個 Sf21 細胞，在 27°C 貼附至少 1 小 時。用 Grace's Insect Medium 序列稀釋桿狀病毒液(10^-1至 10^-9)。吸除細胞培養 液，各孔分別加入1 mL 病毒稀釋液(10^-5, 10^-6, 10^-7, 10^-8, 10^-9)與培養基，室溫避光 培養2 小時。將 2% Agarose Gel (Gibco, USA)於 70°C 水浴中融化後移置 40°C 水 浴備用；20% FBS Grace's Insect Medium (2X) (Gibco, USA)置於 40°C 水浴回溫，

以2% Agarose Gel：20% FBS Grace's Insect Medium (2X) = 1：1 的方式配製成病 毒效價檢測培養基，置於 40°C 水浴保溫。2 小時培養後，吸除含有病毒的細胞 培養液，加入2 mL 病毒效價檢測培養基，室溫靜置 20 分鐘待凝膠，於 27°C 避 光培養10 天後，每孔加入 0.5 mL Neutral Red (1mg/mL)溶液，室溫靜置 2 小時，

去除多餘的染劑，計算Plaques 數目，根據下列公式計算效價。

Titer (pfu mL⁄ ) = number of plaques × dilution factor × 1

mL of inoculum well⁄

2.6.6 病毒最佳感染條件測試

利用不同MOI (multiplicity of infection) 的病毒量來感染 Sf21 細胞 0~6 天，

以進行最佳感染條件的測試。MOI 表示每一個細胞感染病毒顆粒的平均個數，依

據下列公式計算不同MOI 條件所要添加病毒液的體積。

Inoculum required (mL) = MOI ( pfu cell⁄ )×number of cells titer of viral stock ( pfu mL⁄ )

2.6.7 重組蛋白之表現

培養150 mL Sf21 細胞(1×10⁶ cell/mL)於 500 mL 錐形瓶，以 5 MOI 的病毒液 感染細胞，在27°C 以轉速 125 rpm 震盪避光培養 5 天。以 500g 離心 10 分鐘，

倒除上清液，獲得有表現目標重組蛋白質之細胞，保存於−20°C 用於後續純化與 分析實驗。