表現載體之建構

2.2.1 真核表現系統載體

本論文中所選殖的基因為新型H7N9 流感病毒的 M1、M2、NS1 和 NS2，其 基因片段是由國立臺灣大學醫學院張淑媛老師提供，來源是從臺灣第一例境外移

入且痊癒之臺商體內分離得到的 H7N9 病毒株。將此四個基因重新選殖至

pFastBac^™ HT A 內，以利於在桿狀病毒表現系統中使用。pFastBac^™ HT A 在選 殖基因的N 端會有 6×His-tag 與 TEV 蛋白酶切位(TEV protease cleavage site)，有

盧德釗碩士論文 第二章 材料與方法 料(附錄圖一)，分別對其設計一對專一性引子(primer)，並在 Forward 端與 Reverse 端加上特定的限制酶(restriction enzymes)切位(附錄表一)。

2.2.3 聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)

聚合酶鏈鎖反應是一種快速大量增殖特定DNA 片段的分子生物學技術。本

論文使用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Scientific, USA)放大目 標基因序列，依據下表添加實驗材料於微量離心管中，混合均勻後短暫離心。 Phusion DNA Polymerase 0.5

ddH2O 32.5

Total 50

將反應原料混合之微量離心管置於核酸增殖器(PCR machine) (Biometra, Germany)中進行反應。PCR 反應程序如下表所示。反應完成後純化目標 DNA 片 段。

Cycle step Temperature Time Cycles

盧德釗碩士論文 第二章 材料與方法

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2.2.4 限制酶切反應(Restriction Enzyme Digestion)

限制酶是一種對核酸序列具有專一性的核酸內切酶，能辨識核酸序列中特定 的迴文序列(palindrome sequence)，將雙股 DNA 切斷在核醣與磷酸之間形成缺口，

可產生單股DNA 突出的黏狀末端(sticky end)與平整的平滑末端(blunt end)。將表 現載體與基因片段利用限制酶反應，再經由 DNA 連接酶(DNA ligase)將二者黏 合，常用於DNA 重組技術。本論文使用 New England Biolabs^®限制酶(New England Biolabs, USA)進行反應(附錄表二)，依據下表添加實驗材料於微量離心管中，混 合均勻後短暫離心，置於 37°C 反應 12 小時。反應完成後利用洋菜膠電泳分析 DNA，再進行切膠萃取目標 DNA 片段。

Reagent Volume (μL)

DNA (5 μg) X

10X NEBuffer 5

NEB^® Restriction Enzyme 1

ddH2O 44−X

Total 50

2.2.5 接合反應(Ligation)

DNA 連接酶會催化兩條 DNA 片段之間 5’端磷酸根(5’ phosphate)與 3’端羥 基(3’ hydroxyl)生成磷酸雙脂鍵(phosphodiester bond)而相互黏合，需要 ATP 作為 輔因子。本論文使用T4 DNA Ligase (Thermo Scientific, USA)進行反應，以 Vector：

Insert = 1：5 之莫耳數比例混合，DNA 總量為 200 ng，依據下表添加實驗材料於 微量離心管中，混合均勻後短暫離心，置於22°C 反應 1 小時。

Reagent Volume (μL)

Insert DNA Y

10X T4 DNA Ligase Buffer 2 T4 DNA Ligase 1

ddH2O 17−(X+Y)

Total 20

2.2.6 轉型作用(Transformation)

將目標基因建構完成之pFastBac^™ HT A 載體經由轉型作用轉入大腸桿菌中，

藉由宿主細胞的系統複製質體DNA，並利用質體上的 Ampicollin 抗性基因進行

盧德釗碩士論文 第二章 材料與方法

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單一菌落的篩選。自−80°C 取出 50 μL E. coli DH5α 勝任細胞(competent cell)置於 冰上解凍，加入10 μL Ligation product 冰浴 20 分鐘後，於 42°C 的乾浴槽內進行 熱休克反應(hot shock)90 秒，再置於冰上 2 分鐘。加入 200 μL LB 培養液(1%

tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl)於 37°C、轉速 150 rpm 震盪培養 1 小時後，

取出100 μL 菌液均勻塗佈在 LB 培養盤(100 μg/mL ampicollin)上，於 37°C 培養 16 小時。

2.2.7 重組載體之篩選

挑選培養盤上的單一菌落置於LB 培養液(100 μg/mL ampicollin)進行隔夜培 養，分離細胞內的質體DNA，進行 DNA 膠體電泳分析。藉由聚合酶鏈鎖反應利

用載體上設計的引子複製質體 DNA；或限制酶切反應利用對應的限制酶作用質

體DNA 後，進行 DNA 膠體電泳與核酸定序比對確認目標基因有接入 pFastBac^™ HT A 載體上。