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第三章 結果
3.1 H7N9 M1、M2、NS1 與 NS2 重組桿狀病毒表現載體之建構
新型 H7N9 流感病毒的基因片段是由國立臺灣大學醫學院張淑媛老師所提
供，其來源是從臺灣第一例境外移入並痊癒之臺商體內分離得到的 H7N9 病毒
株。從NCBI 資料庫取得 H7N9 流感病毒的 M 與 NS 核酸序列資料(M accession:
KF018048；NS accession: KF018049)，M 基因可以編碼出 M1 是 759 bp 與 M2 是 294 bp；NS 基因可以編碼出 NS1 是 654 bp 與 NS2 是 366 bp。分別對 M1、M2、
NS1 與 NS2 設計一對專一性引子，並在 Forward 端與 Reverse 端加上特定的限制 酶切位。利用聚合酶鏈鎖反應放大目標基因序列，獲得 M1 大小是 772 bp，M2 是307 bp，NS1 是 668 bp，NS2 是 380 bp (圖一 A)，各別經由其對應的一組限制 酶反應後，利用T4 DNA Ligase 與 pFastBac™ HT A 進行接合作用，將其轉型至 E. coli DH5α，並利用載體上的 Ampicollin 抗性基因進行單一菌落的篩選。將菌 落以LB 培養液培養後，抽取其菌內的 pFastBac 重組質體(圖一 B)，以聚合酶鏈 鎖反應或限制酶切反應(圖一 C)，藉由 DNA 膠體電泳確認分子量大小，以 pFB-HT-F 引子進行核酸定序比對確認目標基因有接入 pFastBac™ HT A 載體，核酸序 列比對結果發現M 基因第 10 個核苷酸由 T 變成 C，但不會改變胺基酸序列(附 錄圖一A)。
將建構完成之重組質體pFastBac HT A-M1、pFastBac HT A-M2、pFastBac HT A-NS1 與 pFastBac HT A-NS2 分別轉型至 E. coli DH10Bac™中，藉由輔助質體表 現的轉位酶將目標基因片段轉位至Bacmid 上。經由藍白篩選挑選白色的單一菌 落，將菌落以LB 培養液培養後，抽取其菌內的重組 Bacmid。由於重組 Bacmid 大於135 kb，利用限制酶分析非常困難，因此以 M13 引子進行聚合酶鏈鎖反應，
藉由DNA 膠體電泳確認分子量大小，確認目標片段有插入 Bacmid，其大小分別 約為3190 bp (M1)、2720 bp (M2)、3080 bp (NS1)與 2800 bp (NS2) (圖二)。
3.2 H7N9 M1、M2、NS1 與 NS2 重組蛋白質於 Sf21 昆蟲細胞之表現
將重組Bacmid M1、M2、NS1 與 NS2 分別利用 Cellfectin® Reagent 轉染至 Sf21 昆蟲細胞中，生產重組桿狀病毒，可獲得 P1 病毒液與細胞。將 P1 病毒液 以100 倍稀釋感染 Sf21 昆蟲細胞，可獲得 P2 病毒液與細胞，以此類推，用此方
式放大病毒液並提高其效價。利用胺基酸序列來預測蛋白質的理論分子量，H7N9
重組蛋白質M1 約 31.2 kDa，M2 約 14.6 kDa，NS1 約 28.1 kDa，NS2 約 17.7 kDa，
此四種重組蛋白質皆帶有His-tag，以便於抗體專一性確認，並利用親和層析法來 純化。藉由免疫染色法確認P1 至 P4 細胞內重組蛋白質之表現，由圖三可知，以 anti-His 抗體辨識，M1 在 P1 至 P4 細胞內皆有表現並符合預測大小；M2 在 P1 至P4 細胞內皆有表現，但分子量約為 20 kDa，與預測不符；NS1 在 P1 至 P4 細
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胞內皆有表現並符合預期大小；NS2 在 P1 至 P4 細胞內皆有表現，但分子量大 於17 kDa，與預測略大。由此結果可知，H7N9 流感病毒的 M1、M2、NS1 與 NS2
重組蛋白可以藉由桿狀病毒表現系統在 Sf21 昆蟲細胞中成功被表現出來。而在
未受重組桿狀病毒感染的 Sf21 昆蟲細胞則不會表現 H7N9 重組蛋白，作為轉染 的控制組。
3.3 H7N9 M1、M2、NS1 與 NS2 重組桿狀病毒液之病毒效價試驗
因為使用不同 MOI 的病毒液感染量會對於重組蛋白的表現量造成影響，所
以需要使用Viral plaque assay 對重組桿狀病毒液的效價進行測定，作為計算病毒 液稀釋倍率的依據。在開始此實驗前，先大量製備高效價的病毒液，以利於未來 大量生產目標重組蛋白。將1×106 Sf21 細胞分別以 10-5至10-9序列稀釋的重組桿 狀病毒液感染10 天，利用 Neutral Red 進行染色，透過紅色的背景，可以看到透 明的溶細胞斑點。從不同的病毒液稀釋倍數感染細胞，可以觀察到病毒液稀釋倍
數越大，溶細胞斑的數目會等比例減少。計算效價最適當的溶細胞斑數目是3 至
20 個，故計算 10-9稀釋倍數的溶細胞斑數目，根據公式估算病毒液效價，M1 是 5.2×1010，M2 是 2.5×1010，NS1 是 3.8×1010，NS2 是 2.3×1010；而未受重組桿狀 病毒感染的Sf21 昆蟲細胞則無溶細胞斑，作為感染的控制組(圖四)。
3.4 H7N9 M1、NS1 與 M2 重組蛋白質之表現條件測試
在大量量產由昆蟲細胞所表現的H7N9 重組蛋白質之前，必須先測試最佳表 現的培養條件，得知最佳病毒液感染量與最佳感染天數，以獲得最大量的目標蛋 白質。培養150 mL Sf21 細胞於 500 mL 錐形瓶中，以不同 MOI 的病毒液感染量 (1, 5, 10 MOI)感染一定量的昆蟲細胞後，在不同天數(第 0 至 6 天)收集其細胞進 行蛋白質表現量的分析。從結果顯示(圖五 A)，M1 在 1 MOI 感染下，第 0 天至 第2 天都不表現，從第 3 天才開始表現，到第 5 天達表現的最大量；在 5 MOI 或 10 MOI 感染下，第 0 天至第 1 天都不表現，從第 2 天才開始表現，比 1 MOI 提
早一天，到第 5 天達表現的最大量，而第 6 天表現量則略微降低，表示較高的
MOI 會使蛋白質在細胞中提早被表現與累積。比較不同 MOI 在相同天數的蛋白 質表現量(圖五 B)，在感染第 3 天或第 5 天後，5 MOI 會比 10 MOI 或 1 MOI 的 表現量多。
相似的結果也可以在NS1 的實驗中發現(圖六 A)，在 1 MOI 感染下，第 0 天 至第2 天都無 NS1 的表現，從第 3 天才開始表現；在 5 MOI 或 10 MOI 感染下，
從第2 天開始表現，三者皆到第 5 天達表現的最大量，而第 6 天表現量則約略下 降。比較不同MOI 在相同天數的蛋白質表現量(圖六 B)，不論是感染第 3 天或感 染第5 天後，5 MOI 都會比 10 MOI 或 1 MOI 的表現量多。
盧德釗碩士論文 第三章 結果 蛋白質。將每個劃分以Bradford protein assay 測定蛋白質，以 SDS-PAGE 用 CBR 染色分析蛋白質的純度，以免疫染色法確認目標蛋白質的表現與分子量大小。
NS1 的含量越多。進一步嘗試以低濃度 Imidazole 的緩衝液去除雜蛋白，再用高 濃度Imidazole 將 NS1 流洗下來，希望可以提高樣本的純度。因此在粗萃取液通 過管柱後，改用50 mM Imidazole 清洗管柱，再以 50~250 mM Imidazole 連續性 梯度流洗結合在管柱內的NS1。代表蛋白質濃度的 A595吸光值曲線(圖十一 A)顯 示，在第 18 管與第 36 管各有一個蛋白質峰值。由 CBR 染色的結果(圖十一 B)
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得知，在第18~36 管都有 NS1，而在第 10~30 管都有許多高分子量的雜蛋白。免 疫染色的結果(圖十一 C)也顯示，NS1 在第 18~36 管都存在。所以此方法無法達 到去除雜蛋白及增加NS1 之純化效果。
將含有H7N9 M1 與 NS1 重組蛋白質的 CBR 染色條帶切出，經由質譜儀與 Mascot 軟體比對進行身分鑑定分析確認無誤(圖十二)，M1 重組蛋白質序列 coverage 是 56.7%；NS1 蛋白質序列 coverage 是 81.1%。從培養 500 mL 的昆蟲 細胞中，經純化與脫鹽濃縮後，可獲得M1 約為 1.4 mg 與 NS1 約為 1.5 mg。
3.6 H7N9 M1 與 NS1 重組蛋白質之多株抗體效價測試
為了建立新型 H7N9 流感病毒研究與檢驗用的抗體，將純化後的 H7N9 M1 或 NS1 重組蛋白質分別免疫 BALB/c 小鼠以製備多株抗體，採集免疫前、第二 次與第三次免疫後的小鼠血清，使用Sf21 昆蟲細胞表現的 H7N9 M1 或 NS1 重 組蛋白質及大腸桿菌表現的H7N9 M1 或 NS1 重組蛋白質作為正向抗原，Sf21 昆 蟲細胞的全蛋白與V5-GFP-His 蛋白質作為負向抗原，藉由免疫染色法進行效價 的測試。
利用CBR 染色確認抗原蛋白質時，發現不論是 Sf21 昆蟲細胞表現的 M1 重 組蛋白質或是大腸桿菌表現的 M1 重組蛋白質都有降解的現象發生，尤其 Sf21 昆蟲細胞表現的M1 重組蛋白質降解的最嚴重，而大腸桿菌表現的 M1 重組蛋白 質亦大部分降解成約17 kDa 的片段(圖十三 A)。以 anti-His 抗體進行免疫染色的 結果顯示，M1 已降解成多個片段，並且大腸桿菌表現的 M1 重組蛋白質所降解 的17 kDa 片段卻不含 His tag (圖十三 B)。Sf21 昆蟲細胞的全蛋白中沒有 His tag 的蛋白質。測試H7N9 M1 重組蛋白質抗血清的效價(圖十三 C)，於抗原免疫前，
小鼠無抗 H7N9 M1 蛋白質的抗體反應。免疫二次與三次後，小鼠產生抗 H7N9 M1 蛋白質的抗體，但因 M1 重組蛋白質已經降解，顯示出抗血清的效價不佳，
不過對大腸桿菌表現的M1 重組蛋白質降解的片段有很高的效價，且免疫三次後
的效價略高於免疫二次後的效價。此抗血清對 Sf21 昆蟲細胞的全蛋白僅有少部
分的結合，也不會辨認 V5-GFP-His 蛋白質，所以此抗 H7N9 M1 蛋白質多株抗 體的專一性相當好。
由 CBR 染色結果可知(圖十四 A)，NS1 重組蛋白質的穩定性相對於 M1 重 組蛋白質好。從 anti-His 的免疫染色發現，Sf21 昆蟲細胞表現的 NS1 重組蛋白 質是28.1 kDa，略大於大腸桿菌表現的 27.1 kDa (圖十四 B)。測試 H7N9 NS1 重 組蛋白質抗血清的效價(圖十四 C)，於抗原免疫前，小鼠無抗 H7N9 NS1 蛋白質 的抗體反應。免疫二次與三次後，小鼠血清對H7N9 NS1 蛋白質有極高的效價，
免疫三次又比二次好，也不會結合 Sf21 昆蟲細胞的全蛋白與 V5-GFP-His 蛋白 質，此抗H7N9 NS1 蛋白質多株抗體的專一性非常好。