第四章 實驗設計及方法：利用流程圖呈現本實驗主要操作流程，並提供 實驗所使用之光學元件及儀器設備，同時簡單呈述實驗步驟及樣品配置流程。
第五章 實驗結果與討論：於此章節中呈現實驗所得結果並同時探討過程 中所發現之問題，詳細介紹實驗數據分析之方式。
第六章及第七章：本研究總結並提出未來可繼續深入探討之方向。
第二章 實驗原理
2-1 分析藥物結合於 DNA 之熱力學
熱力學於藥物設計時扮演相當重要的角色，能夠了解藥物的熱力學變化 才可設計出一個有效的藥物。熱力學主要為分析熱與其他能量形式間量化之 一門學問，包括機械能、化學能、輻射能等。一物質因為整體或某部分的運 動而具有動能，如分子、原子和電子，因為其位置或方位的特性而具有位能。
要想知道一個系統能量的絕對值是不可能的，但卻可以記錄當系統進行某種 轉變時的能量變化，熱能的變化常用卡(calories)表示。能量可視為一種與數量 無關的內涵因素(intensive property)及一個與系統質量成正比的外延因素 (extensive property)之變化量乘積來表示。而熱能的內涵因素為溫度(deg)，外 延因素則為熵值的改變(entropy change，cal/deg)，能量的單位常用卡。熱力學 基於三種原理推論所得的結論，通常以數學方程式來表達，稱之為熱力學定 律。本論文中相關熱力學公式推導請參見附錄 I。
過去文獻中用於探討藥物分子與DNA結合時之熱力學分析，藥物的平衡 結合親和力常數(KA)為其中一個重要的參數，2006年Yasmina S.N.等學者於文 獻中即利用van’t Hoff方程式來求得焓值變化量[41]。熱力學第二定律中提出的 Gibbs方程式如下：
ΔG = ΔH - TΔS (2-1) 而 van’t Hoff 方程式所衍生出的關係式：
ΔG = - RT lnKA (2-2)
圖2-1 平衡常數(lnKD)-溫度(1/T)作圖
利用 van’t Hoff 衍生方程式，將溫度取倒數後(1/T)與所對應之平衡常數取自然 對數後(lnKD)作圖，所得之斜率即為(
R
ΔH ) [41]。
2-2 高解析度雷射光鉗系統
本實驗中所使用之雷射可分為兩部分：用於捕獲乳膠珠之 1064 nm 雷射 光鉗(trapping laser)，以及作為量測位移之 830 nm 偵測雷射系統(detection laser)。將系統原理分為以下三節作簡介：
2-2-1 雷射光之特性
雷射光與普通光源(如日光燈)所發出的光波相比較，雷射光通常具有高度 的單色性(窄頻帶)及指向性(小發散角)，所謂高指向性是指雷射光雖然經過長 距離的傳播，它仍然可維持細小的光束而不擴散，而普通光源則會散開，固 可將雷射光視為準平行光。通常以擴散角(divergence angle)來量度雷射光的指
向性，擴散角度大，代表指向性較差。雖然雷射所發射出的光被限制在極窄
2-8 式子中，θ稱為光束發散全角(full-angle beam divergence)，發散角的大小 影響光束的平行度以及聚焦的能力，在校準時深受影響[42]。
圖 2-2 雷射光束發散現象
波傳播垂直方向上的電磁場變化現象稱之為電磁橫向模態，或稱TEM 模 態，橫向模態通常以 TEMmn 來表示電場在空間位置的分佈，TEM 是取自 (transverse electromagnetic wave)的縮寫代表橫向電磁波的意思。而 TEM00又被 稱為單相模態(uniphase mode)，因為它是唯一能讓所有光束在任何給定的時間 內，均保持同相位的橫向模態。最低序模態為 TEM00模態，其雷射光束輻射
強度呈現高斯分佈(Gaussian)，故又稱之為高斯光束(Gaussian beam)。光束直 徑定義為：由光束中心到照度(E)減為 1/e2 = 0.135 之處，兩箭頭之間的距離。
光點大小定義為：最大照度到1/e2光點的輻射距離。光點的大小會隨著z 增加 而增加，經過一段距離後，光點大小與 z 成線性比，取其漸近線和 z 軸的夾角，
定義為擴散角(divergence angle)，如圖 2-3 所示。高斯光束的擴散角為
2 Θ ：
dz z dw
w z
) (
2
lim
→∞Θ＝ ＝
π ０
λ (2-9)
圖中假設 z 軸為光軸，則雷射光傳導方向為 z 軸方向，而 w0為雷射光經共振 腔聚集後的最小光點半徑，位於 z = 0 上，稱為光束腰部(beam waist)。
圖 2-3 雷射光束直徑及雷射光腔圖
2-2-2 高解析度雷射光鉗原理
選用 1064 nm 雷射光作為光鉗之光源，主要因為此波長對於生物的影響 性較小，同時於水中的穿透性較好，不會累積能量於高度聚焦的雷射光束附
近產生高熱而破壞生物分子。光具有粒子性與波動性之特徵，蒲朗克假設光
據Snell's Law (nssinθs =nbsinθb)，當一光束入射打入此粒子時，會發生折射現 象。而入射的動量為Pin，折射θ角度後出來的動量為Pout，之間會產生一個動 量的變化量(ΔP)，所產生的力量F =
dt
dP ，如圖2-4所示：
圖 2-4 光子遇上會折射之物體產生的動量變化量
Mie散射主要所描述情況：假若打入粒子的光束強度不均勻，如圖2-5(a) 中，p1大於p2此瞬間折射角的變化(Δp1、Δp2)亦不相同，因此使得淨力(net force) 會往入射光較強之處移動。假若打入粒子的光束位於軸上，此時因為淨力方 向皆朝向聚焦點，故捕捉的力量會朝向光束聚焦的地方，將推動粒子往上移 動，如圖2-5 (b)及(c) [43]。而本實驗中所使用之乳膠珠為1.5~1.9 μm左右，屬 於此種類型。
圖2-5 Mie 散射原理
物質粒徑大小大於光束聚焦點時，光束打入粒徑之方向將對粒徑造成不同大 小的 trapping force。
當為 Rayleight 散射情況時，將粒子看做是一個電介質，會因電場而誘發
然而除抓取力外，光束還產生一個散射力(scattering force，Fs)，此力主要 因為入射光之反射，起因於電場隨時間週期性的變化，這個隨著電場同步感
而nb為粒子的折射率，σ為粒子對於此光波的散射截面(cross section)，c為光 速。散射力必定沿著光行進的方向，並且與該處光強度成正比。因此，粒子 將會因散射的關係而被推往光前進的方向，故對於z軸的光學力來說，散射力 無疑的是破壞其穩定性及對稱性的重要因子，故對於設計光鉗時若要求z軸方 向的穩定性，必須讓抓取力Fg大於散射力Fs。因此，要增大z軸的穩定性，最 好的方法是增大粒子的相對折射率和減小光束腰部半徑。
2-2-3 偵測雷射之原理
而在偵測位移之 detection laser 部分，所使用光源為 830 nm 之雷射光，使 用此波長之雷射主要是因為四象限光電二極體(Quadrant photodiode，QPD)對 於此波長較為靈敏。雷射光束經由物鏡通過蓋玻片後，會形成高度聚焦的高 斯光束(Gaussian beam)，而與此光束傳遞方向正交之波稱為高斯光束波緣 (wave front)。此時若微流道(chamber)內之乳膠珠於液體中進行布朗運動，當 粒子接觸到高斯光束之波緣，便會形成球形散射波，兩波緣互相干涉即會於 condenser 的 BFP (back focal plane)形成干涉條紋，再藉由 condenser 後方的透 鏡將此干涉條紋成像於 QPD 上。因此當粒子產生位移時，所形成干涉條紋之 亮暗紋將隨之改變，因此可紀錄干涉條紋的位移做為乳膠珠位移量測之方 式，如圖 2-6 所示[43]：
圖 2-6 偵測乳膠珠與捕捉中心的位移量
將成像於 BFP 的干涉條紋成像於 QPD 上，以記錄位移量。
第三章 系統介紹
3-1 系統光路元件與雷射之架設
本實驗中捕獲雷射光(trapping laser)以及偵測雷射(detection laser)之光路 設計如圖3-1所示，其中所使用之各種光學元件及雷射系統詳細規格與廠牌請 參閱第四章實驗材料與儀器設備。圖3-1主要可分為兩道雷射光路，實線所繪 製之光路為trapping laser，使用1064 nm雷射作為光源，雷射光之直徑約為2 mm，置於雷射出口前的二分之一玻片(λ/2 plate)可調整光之偏振態，以確保分 光後的兩道光束強弱一致。而光路中所使用之反射鏡皆為45度反射鏡，使光 束以45度進入，45度反射，藉由調整反射鏡以確保光為直線進行。在接近雷 射光出口進行1：1擴束(L1：L2 = 50：50)，主要目的為避免雷射光太快發散，
能夠經由1：1擴束後維持平行光，進入偏振分光器中(PBS)。光束經由偏振分 光器將分為水平偏振態之穿透光及垂直偏振態之反射光。接著經50 mm及250 mm的透鏡進行五倍擴束，希望最後進入物鏡之光鉗大小可達到10 mm，且可 充分利用物鏡N.A.值，將聚焦點聚得更小，以達到較佳的雷射捕獲效果。擴 束後的光束經過兩片150 mm透鏡，最後打在一片45度的雙色分光鏡(dichroic mirror)上，經反射垂直入射進入一數值孔徑(N.A.值)為1.4之60X Plan Apo顯微 物鏡。 為能夠調整光束進入物鏡後方數值孔徑的入射角度，又不影響雷射入 射 於 物 鏡 上 的 位 置 及 強 度 ， 因 此 於 系 統 中 加 入telescope 以 及 共 軛 平 面 (conjugate plane)之概念。
Telescope是利用兩片透鏡所組成，如本系統中L3 (f = 50 mm)及L4 (f = 250 mm)，以及等焦距L7及L8 (f = 150 mm)之透鏡等。將L8放置於L7透鏡後方的 兩倍焦距平面上，而顯微物鏡之後方數值孔徑則架設於L8透鏡後的兩倍焦距 平面上。如此，物鏡的back focal plane(BFP)與透鏡L7形成共軛平面。另外，
光路中還另外設計兩組共軛平面，第一組為1064 nm trapping laser中的掃描鏡 (scanner)，與透鏡L7；另一組為830 nm detection laser中的第二片反射鏡與透 鏡L7。雷射光束經由telescope 調整入射於顯微物鏡的BFP 的角度，使其垂直 入射顯微物鏡的BFP。
而在圖中的第二道光路以虛線表示，此光路以 830 nm 雷射光作為 detection laser，因雷射光的瓦數過強，故放入 N.D.filter 將能量減弱，接著再 以 50 mm 及 150 mm 之透鏡進行擴束 3 倍。而放置於 1064 nm 及 830 nm 兩道 光路重合處的鏡面須讓 1064 nm 光束反射，830 nm 光束穿透，最後皆可進入 物鏡中。當兩道光束皆進入物鏡後，會再進入 condenser 中，經由 condenser 中的第二片 Dichroic mirror 以 45 度角固定，會將 1064 nm 及 830 nm 雷射光以 90 度反射，而後利用 50 mm 的透鏡將影像成像於 QPD 上。然而系統中作為 detection laser 為 830 nm 的雷射光，同時因光功率過強，因此於 50 mm 透鏡後 架設一片可阻擋 1064 nm 雷射光的濾光片(filter)以及一片 N.D filter，最後僅有 830 nm 雷射光會進入 QPD 內。
圖 3-1 系統光路架設圖
黑色實線為 1064 nm 雷射光路圖，藍色虛線為 830 nm 雷射光路圖，其中透鏡 單位為釐米(mm)。
在830 nm detection laser 的部分，為能夠使影像成像於 QPD 上，會利用 成像公式計算物體到透鏡與 QPD 的距離：
f q p
1 1
1 + = (3-1)
本實驗中，condenser 的寬度(D)為 30 mm，而 QPD 偵測範圍其寬度(I)為 10 mm，故可假設 D＝3I，當透鏡為 50 mm，經由公式 3-1 計算後得物距( p)＝200
mm，像距(q)＝66.7 mm，如圖 3-2 所示。
圖3-2 利用 QPD 偵測 detection laser 訊號之光路元件架設圖
實驗中，為降低環境中高頻震動產生的雜訊(noise)影響實驗進行，故將整 套 雷 射 光 學 系 統 架 於 光 學 防 震 桌 上 ， 所 使 用 之 光 學 防 震 桌 型 號 為 M-RS2000-46-8，置於光學桌下的震動隔離桌腳(isolator)型號為 I-2000-428 LabLegsTM。I-2000 系列的震動隔離桌腳共振頻率分別為 1Hz (垂直方向)、1.5Hz (水平方向)，承載重量為 300-3636kg，可用於高解析度的實驗中。而一般單分
實驗中，為降低環境中高頻震動產生的雜訊(noise)影響實驗進行，故將整 套 雷 射 光 學 系 統 架 於 光 學 防 震 桌 上 ， 所 使 用 之 光 學 防 震 桌 型 號 為 M-RS2000-46-8，置於光學桌下的震動隔離桌腳(isolator)型號為 I-2000-428 LabLegsTM。I-2000 系列的震動隔離桌腳共振頻率分別為 1Hz (垂直方向)、1.5Hz (水平方向)，承載重量為 300-3636kg，可用於高解析度的實驗中。而一般單分