1-1 前言
過去用於治療癌症之化療方式不但會將癌細胞摧毀，同時亦會造成正常 細胞的死亡，然而隨著醫學的進步，抗癌藥物出現新突破-標靶藥物的問世。
標靶藥物之設計是針對癌細胞有別於正常細胞的部分加以破壞，因此了解藥 物對細胞內機制的作用關係也就相對重要。核酸(nucleic acid)是最常被當作抗 病毒、抗癌、抗生素等藥物的目標物(target)。一般設計結合於 DNA 之藥物，
其主要作用為調節基因的活性；結合於 RNA 之藥物則是抑制蛋白質的轉譯。
因此要設計出一種有效的新藥物，必須深入了解藥物與核酸之間的作用，包 括藥物可辨識的序列、結構之間的影響以及藥物結合的熱力學探討等亦相當 重要[1]。熱力學參數可表現當藥物因不同結構或特殊辨識序列所造成的影 響，因此探討熱力學方面的研究，微卡計(microcalorimetry)成為一個重要的工 具，可用於量測分子間結合的熱力學參數，其中又以ITC 及 DSC 兩種儀器較 為常見。然而利用微卡計是一種以巨觀方式進行量測的工具，隨著科學的進 步，生物方面的研究已從分子層級更進一步來到"單分子"的層級，因此利用單 分子技術從微觀角度來偵測分子之間相互的關係，已成為近年來熱門的研究 主題。
單分子的操作技術包含兩個主要的元素：其一為探針(probe)，主要為偵
測力量及位移的變化；另一個則是能夠呈現分子於空間中所在位置之方式。 過程中會生成可改變 DNA 結構的自由能，稱之為 melting transition free energy。又提出 DNA 所結合之藥物濃度低於臨界值(critical value)時，DNA 因 受外力作用會造成結構轉變，使 DNA 長度增長，由雙股結構變為單股 DNA，
此過程若將力量及長度作圖，會呈現一個 transition platue 的平穩區間。隨著 藥物濃度的增高，transition platuea 的區域會愈來愈短，當到達臨界值後即消
失。因此提出一個類似於水之三相圖(壓力-體積-溫度)概念，即力量-長度-藥 物濃度圖，如圖 1-1 [3]，然而與水之三相圖相異之處在於水為液態及氣態時 會隨壓力而造成體積減少，DNA 的長度卻會隨著外力上升而增加。此相圖可 以更了解單一 DNA 分子的作用機制及其熱力學變化。
圖 1-1 單一 DNA 分子的三相圖 (A)力量-藥物濃度；(B)力量-長度[3]。
1-2 研究動機
本 論 文 最 重 要 的 研 究 動 機 是 建 立 以 生 物 單 分 子 技 術 (single-molecule technigue)來檢測藥物分子與 DNA 的結合反應，希冀建構以生物單分子力學特 性為基礎的微觀分析方式，進而與傳統利用生物物理或生物化學技術所獲得 巨觀量測方法的實驗數據相互比較與對照。
2001 年 Goossens 學者等人利用螢光光譜儀(fluorometer)分析 PD153035 及其類似結構物 EBE-A22，實驗條件將藥物濃度固定為 5 μM，改變 DNA 相 對濃度範圍(0.1 μM~1 mM bp)，以波長 360 nm 分別激發兩藥物。發現當 EBE-A22 接上 DNA 後，在發光波長(emission wavelength) 436 nm 可看見一個
A B
明顯的吸收峰值(absorption peak)；然而當 DNA 未接上 EBE-A22 時，其吸收 值則非常弱。因此可以推算出 EBE-A22 其平衡結合親和力常數值(binding affinity constant)約為 1.86 × 104 M-1。但相較於PD153035 則因為螢光強度太 過微弱，無法測得吸收值，因此無法推算出平衡結合親和力常數[4]。2007 年 Grout 學者證實 PD153035 可嵌入 DNA 結構中，造成染色質結構的改變[5]。
近年來，雷射光鉗系統(optical tweezers system)已證實對於嵌入型的結合 模式極具靈敏性，即使藥物的濃度非常低，抑或者DNA 與藥物間靜電作用力 極強，依舊可以推算 DNA 與藥物之間的結合相關參數以及熱力學相關參數 [3,6]。2007 年 Mark C. Williams 團隊利用光鉗系統測量四種小分子(ethidium、
Ru(phen)2dppz2+、Ru(phen)32+、Ru(bpy)32+)與 DNA 的結合模式。實驗中改變藥 物的濃度，分別於不同濃度下得到 DNA-藥物之長度變化及相對力量大小，最 後 可 得 DNA- 藥 物 之 力 量 - 長 度 (force-extension ， F-x) 二 維 相 圖 。 並 利 用 McGhee-von Hippel model 擬合所得到的數據，即可推算出平衡結合親和力常 數及藥物嵌入 DNA 的量。Williams 等學者並提出，當 DNA 受到一個外加的 拉力，會改變 DNA 的彈性(elasticity)及柔軟度(flexibility)，造成 DNA 的力學 特性改變，因此若 DNA 嵌入藥物後再受到一個外力作用，可能使得更多的藥 物嵌入 DNA 結構內，直到結合反應達到飽和狀態[6]。
然而，2009 年 Gijs J. Wuite 學者的研究團隊發現針對 YOYO 螢光染劑嵌 入單一DNA 分子後，利用雷射光鉗系統進行 DNA 的拉伸測試，並觀察 YOYO
染劑的螢光訊號變化。實驗結果顯示 YOYO 染劑在整個拉伸過程並沒有出現 螢光訊號強度的改變，同時發現即使在 DNA 分子高於過度拉伸的轉折區域 (overstretching transition)，YOYO 染劑仍與 DNA 緊密結合，亦即較高的拉力 並不會促進更多的藥物嵌入 DNA 結構中[7]，此論點恰與 Williams 團隊所提 出的假說相異。
由於外力作用是否會促使更多的藥物分子嵌入 DNA，目前尚無定論，同 時目前尚無利用生物單分子技術來探討PD153035 與 DNA 的結合模式以及相 關平衡結合親和力常數之量測值。因此本實驗希望藉由高解析度光鉗系統探 討 DNA 分子在低作用力的情況下，分析 PD153035 嵌入 DNA 時的結合模式 以及平衡結合親和力常數的計算，同時並配合溫控系統希冀得到 PD153035 藥 物分子完整的熱力學圖譜。
1-3 文獻回顧
1-3-1 非小細胞肺癌簡介
隨著高齡化與生活型態改變等因素，癌症已高居國人死亡率第一。根據 國民健康局統計，國人罹癌高度集中於肺癌、直腸癌、肝癌、乳癌和口腔癌 等前五大癌症。其中，空氣污染和吸菸人口的增加，是促使肺癌高居第一名 很大的因素[8]。肺癌可以分為小細胞肺癌(small cell lung cancers，SCLC)及非 小細胞肺癌(non-small cell lung cancers，NSCLC)兩種，而非小細胞肺癌又較為
常見，約佔所有肺癌病人數 80% - 85%，主要由腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌 所組成。
1-3-2 非小細胞肺癌臨床治療
治療非小細胞肺癌主要是靠手術、放射療法(radiotherapy)或化學療法 (chemotherapy)。不幸的是，約 70%的病人在診斷時都已經無法接受手術，只 能接受以化學治療為主之緩和治療。目前第一線化學治療藥物主要是以含鉑 類藥物-順鉑(cis-platin)為主，其結構式如圖 1-2 [9]。順鉑是以靜脈注射給予，
當其循環於血液中時，屬於高氯離子環境，濃度約在 100 mM，因此順鉑之結 構穩定而非離子化，這樣容易使藥物進入腫瘤細胞內。當順鉑進入細胞內，
氯離子濃度低(約為 4 mM)，導致順鉑結構中的氯分子被水分子取代形成正電 荷 之 活 性 物 。 這 樣 的 活 性 物 會 與 DNA 形 成 股 內 交 聯 結 合 (intrastrand cross-linking)，結合於 DNA 相近嘌呤(purine)間的氮原子(N7)上，其中又以鳥 嘌呤(Guanine)占多數[10,11]。此結合可以阻斷 DNA 模板(template)進行複製，
抑制 RNA 進行轉錄[12]，使得細胞停留於細胞週期 G2 階段，因而進行計劃 性死亡(programmed cell death)，如圖 1-3 所示[9]。也因此，此種藥物是唯一被 使用於抗腫瘤藥物的重金屬物質。然而，化療藥物不分癌細胞或是正常細胞 (normal cell)皆會造成毒殺，特別是骨髓造血細胞、口腔黏膜細胞和毛囊細胞，
化療後容易造成嘴破、掉髮、免疫低下等副作用。
圖 1-2 順鉑(Cisplatin)
圖 1-3 順鉑作用機制
因此，近年來研發出針對癌細胞量身訂「治」的標靶治療(target therapy)，
利用癌細胞大量表現生長因子之特性，以具專一性(specificity)的藥物來阻斷接 受器，使癌細胞無法接受到體內生長因子的刺激，或使癌細胞內生長訊息之 傳遞受到阻斷，無法將訊息傳入細胞核，以達到控制癌細胞的增殖、凋亡、
血管新生(angiogenesis)以及轉移，但對於正常細胞幾乎無傷害性[13]。
表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)為酪胺酸激 酶(tyrosine kinase)家族之一，於不同型態的細胞上表現。EGFR由三種蛋白結 構域(protein domain)所組成，分別為細胞膜外的配體結合結構域(extracellular ligand-binding domain)，穿透細胞膜之間的穿透膜親油性片段(transmembrane lipophilic segment) ， 以 及 細 胞 質 內 的 酪 胺 酸 激 酶 蛋 白 結 構 域 (cytoplasmic protein tyrosine kinase domain)。當配體與細胞外接受器結合後，就會引發結構 改變形成雙聚體化(dimerization)，受體將會相互磷酸化而形成活化狀態，這個 現象稱作自體磷酸化(autophosphorylation)，引發一連串的訊號由細胞質傳遞進 入細胞核，造成細胞的增生以及癌細胞的生長。許多類型之癌細胞皆會大量 表現EGFR，非小細胞肺癌亦屬於其中之一[14,15]。故標靶藥物之設計即利用 單株抗體(monoclonal antibodies，mAb)阻礙配體結合結構域，或以小分子的抑 制劑來抑制EGFR之酪胺酸激酶活性[16-18]，使癌細胞生長停滯，進入細胞凋 亡(apoptosis)，如圖1-4所示。目前標靶藥物主要以艾瑞莎(ZD1839，Iressa®)、
得 舒 緩(OSI-774 ， Tarceva®) 以 及 PD153035 三 種 酪 胺 酸 激 酶 抑 制 劑 (tyrosin kinase inhibitor，TKI)為常見藥物，結構式如圖1-5[18,19]。
而2007年Thomas W. Grunt等學者提出PD153035除具有TKI功能外，同時 還會進入細胞核，嵌入(intercalate)DNA結構中，造成染色質結構的改變[20]，
然而ZD1839同樣具有TKI功能，卻不具有嵌入DNA結構中的特性。
圖1-4 EGFR 訊號傳遞路徑之簡易圖
圖1-5 藥物結構式
(A) Iressa®、(B) Tarceva®、(C) PD153035
1-3-3 藥物與 DNA 之結合模式類型
核酸配體(nucleic acid ligand)已被發現且成功的用於抗癌藥物設計與研 究，同時亦可作為 DNA 上核酸損壞(damage)及結構分析的探針(probe)；另一 方面可用於治療因基因、致癌基因(oncogene)以及病毒所造成之疾病[21]。任
A B C
何可與 DNA 作用之小分子或藥物皆屬於配體的一種。利用配體作為癌症治療 之有效設計，一直以來都是研究的重心，了解藥物與 DNA 之間的結合模式與 作用機制亦相對重要[3]。DNA 與藥物之間的結合模式，除了共價鍵結之外，
還可分為專一性及非專一性之非共價鍵結合類型[21,22]：
(1) 嵌入式(intercalation)，嵌入型的藥物會經由 π-π 疏水鍵(π-π hydrophobic)以 及凡得瓦力(van der Waals)與 DNA 上相鄰鹼基對(base pair)穩定結合 [1,2,23]。1991 年 McMurray 等學者提出，當配體嵌入 DNA 中，將可能導 致 DNA 之雙股螺旋解開，對於核小體(nucleosome)結構造成極大的影響 [24]，如圖 1-6 (A)；
(2) 雙嵌入式(bisintercalation)[25]，例如常見的 DNA 染劑 YOYO-1 即為此類 型；
(3) 結合於 DNA 之大溝(major groove)或小溝(minor groove)，配體以凡得瓦力 與 DNA 結合，中間會形成氫鍵並產生靜電(electrostatic)作用力。1986 年 Zimmer 及 Wähnert 證實藥物結合於 DNA 之小溝，會妨礙 DNA 發生彎折 (bending)進而影響調節蛋白結合於 DNA 結構中的特殊序列[26]，如圖 1-6 (B)及(C)；
(4) 非典型式(nonclassical)結合，1996 年 Leigh Ann Lipscomb 等學者於文獻中 提到卟啉(prophyrin)，此種配體半嵌入 DNA 結構後，使單股結構中的鹼基 被擠出原雙股螺旋結構外，形成凸起物(bulge)，如圖 1-7 [27]；
DNA 與配體之間的作用對於細胞內許多生化反應之過程相當重要，當細 胞內特殊蛋白結合於 DNA 上特定序列時將可控制 DNA 進行複製、轉錄、轉 譯等過程。因此，當小分子配體結合於 DNA 上非特定序列時，將可能改變 DNA 原有結構之力學特性(mechanical property)，抑制這些生化過程之進行，
故經常用於癌症治療一途上[28]。
故經常用於癌症治療一途上[28]。