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利用高解析度雷射光鉗系統進行肺癌標靶治療藥物PD153035之熱力學參數分析

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Academic year: 2021

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(1)臺北醫學大學 口腔醫學院 生醫材料暨工程研究所 碩士論文 Graduate Institute of Biomedical Materials and Engineering Collage of Oral Medicine Taipei Medical University. 利用高解析度雷射光鉗系統進行肺癌標靶治療 藥物 PD153035 之熱力學參數分析 Thermodynamic Characterization of the Targeted Lung Cancer Drug PD153035 Using High-Resolution Optical Tweezers System. 研究生:王薇婷 撰 (Wang, Wei-Ting) 指導教授:楊自森 博士 (Advisor: Yang, Tzu-Sen Ph.D.) 中華民國九十八年十二月 December, 2009.

(2) 中文摘要 近年來癌症發生率高居國人死亡率第一,根據國民健康局統計,2008 年 因肺癌喪命,占十大癌症死因第一位。臨床上肺癌可分為小細胞肺癌及非小 細胞肺癌(non-small-cell lung cancer,通常稱作 NSCLC),其中後者發生率占 85~88%。非小細胞肺癌治療方式主要以化學治療及標靶藥物治療為主。目前 第一線化療藥物-順鉑(cis-platin)其作用機制為藥物進入細胞核中與 DNA 上相 鄰的鳥嘌呤(Guanine)-N7 形成共價鍵,經由順鉑與 DNA 交聯結合(cross-linking) 造成 DNA 結構改變,使 DNA 無法進行複製、轉錄、轉譯等過程,進而抑制 DNA 與 RNA 合成。當 DNA 受損卻無法修復時,將會使細胞走向計畫性死亡, 造成細胞凋亡(apoptosis),如此達到殺死腫瘤細胞之目的。另一方面,非小細 胞肺癌常會出現過量的上表皮生長因子受體(EGFR)促使癌細胞快速生長。目 前非小細胞肺癌第二、三線標靶治療之藥物艾瑞莎(Iressa)及得舒緩(Tarceva), 皆為上表皮生長因子受體的酪胺酸酶抑制劑,藉由阻斷受體將訊號傳入細胞 核中,亦可達到抑制腫瘤細胞增生的目的。本實驗中所使用之 PD153035 亦屬 於酪胺酸脢抑制劑之一,但目前 PD153035 還未使用於臨床上。 本研究目的將針對非小細胞肺癌之標靶藥物-PD153035 與 DNA 之間的結 合作用,利用雷射光鉗系統以單分子層級來釐清藥物與 DNA 的結合模式;同 時,透過改變藥物濃度,測量 DNA 分子在有、無 PD153035 時作用力隨拉伸. II.

(3) 長度的變化,並經由 inextensible WLC model 藉以分析 DNA 分子的特徵長度 變化包括維持長度(Lp)及輪廓總長(Lc)。當藥物嵌入 DNA 時會造成 DNA 結構 變得較為鬆軟(soft),造成維持長度變短,同時藉由 B-form DNA 輪廓總長的 變化量進而求出 PD153035 平衡結合親和力常數值。並透過 van’t Hoff 衍生方 程式(ΔG = -RTlnKA)求出自由能變化量。實驗結果顯示,PD153035 僅於 1 mM sodium cacodylate 低鹽濃度條件下嵌入 DNA 結構中,當藥物濃度為 200 μM 時趨於飽和,此時 n = 12 ± 0.92,代表每隔 12 個鹼基對即會有一藥物嵌入 DNA 結構中,平衡結合親和力常數值為 1.34 ( ± 0.53) × 104 M-1,自由能變化量為 -5.53 ± 0.92 kcalmol-1,表示 PD153035 在此條件下嵌入 DNA 結構中屬於自發 性反應。未來希望利用自行設計之溫控系統,經由吉布斯自由能方程式 (ΔG=ΔH-TΔS,G:自由能;H:焓值;S:熵值;T:溫度),分析完整熱力學 參數的變化量(ΔG、ΔH 以及 ΔS)。. III.

(4) Abstract Lung cancer is the most common cause of cancer-related death in human. According to the statistics from Bureau of Health Promotion, lung cancer is the first leading cause of cancer-related death in Taiwan in 2008. The main types of lung cancer are small cell lung cancer (SCLC) and non-small cell lung cancer (NSCLC). The occurrence of NSCLC accounts for as many as 85% to 88% of the cases. The primary treatment for NSCLC usually involves chemotherapy and target therapy. The chemotherapy involves cis-platin, which can get into nucleus, and form a variety of DNA adduct. In this adduct, the platinum is covalently bound to the N7 positions of adjacent Guanine bases, and cross-linked with DNA. For this reason, it is capable of changing DNA conformation, and a number of processes such as regulation, transcription, and translation are not working. When a cell with irrepairable DNA damage which switched on the apoptosis mechanism and, therefore, frequently used to kill the tumor cells. On the other hand, define EGFR is normally found on the surface of epithelial cells and is often over-expressed in NSCLC, which cause promotion of cancer cells proliferation. Presently, Iressa and Tarceva are the second/ third line target therapy. All of them are epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI), and which can block the signal transduction via nucleus. Hence, EGFR-TKI can inhibit the cancer cell proliferation. Besides, PD153035 was used in our study which is also EGFR-TKI but not clinical medicine. In this study, we investigated PD153035-DNA interaction, and presented a novel single-molecule approach to validate the binding mode using optical tweezers system. In addition, we measured the force-extension curves of single λ-DNA molecule coexisting with PD153035 or not in various concentrations from IV.

(5) 0 to 200 μM. We then utilized the inextensible wormlike chain model to determine the DNA persistence length (Lp) and B-form contour length (Lc) in the absence and presence of PD153035. We found that the persistence length was reduced by the presence of the intercalating agent, which suggests that the DNA molecules become softer due to the presence PD153035. On the other hand, the binding affinity constant (KA) ie explicitly related to the B-form contour length of DNA molecule in the absence and presence of PD153035. Furthermore, based on the van’t Hoff equation, ΔG = -RTlnKA, the binding free energy of PD153035-DNA interaction could be dertermined. In this study, we found that there is noticeable increment in Lc only in 1 mM sodium cacodylate, and the binding of PD153035 to λ-DNA began to saturate at about 200 μM. In addition, the exclucion number, the binding affinity constant, and the binding free energy are 12 ± 0.92, 1.34 ( ± 0.53) × 104 M-1, -5.53 ± 0.92 kcalmol-1, respectively, indicating that the PD153035-DNA interaction tends to occur spontaneously. In the future, using our home-made temperature control system, together with utilizing the Gibb’s free energy function (ΔG = ΔH - TΔS, where G, H and S represent free energy, enthalpy, and entropy, respectively), we can determine the thermodynamic characteristics including changes in free energy (ΔG), enthalpy (ΔH), and entropy (ΔS) due to the presence of PD153035.. V.

(6) 目錄 中文摘要 .................................................................................................................. II  Abstract.................................................................................................................... IV  目錄 ......................................................................................................................... VI  表目錄 ..................................................................................................................... IX  圖目錄 ...................................................................................................................... X  符號索引 ................................................................................................................XII  第一章 緒論 ............................................................................................................. 1  1-1 前言 ............................................................................................................. 1  1-2 研究動機..................................................................................................... 3  1-3 文獻回顧..................................................................................................... 5  1-3-1 非小細胞肺癌簡介 ........................................................................ 5  1-3-2 非小細胞肺癌臨床治療 ................................................................ 6  1-3-3 藥物與 DNA 之結合模式類型 ..................................................... 9  1-3-4 以單分子技術量測藥物與 DNA 結合模式 ............................... 12  1-3-5 藥物結合於 DNA 之熱力學分析 ............................................... 22  1-4 章節提要................................................................................................... 27  第二章 實驗原理 ................................................................................................... 28  2-1 分析藥物結合於 DNA 之熱力學 ............................................................ 28 . VI.

(7) 2-2 高解析度雷射光鉗系統 .......................................................................... 30  2-2-1 雷射光之特性 ............................................................................... 30  2-2-2 高解析度雷射光鉗原理 ............................................................... 32  2-2-3 偵測雷射之原理 ........................................................................... 37  第三章 系統介紹 ................................................................................................... 38  3-1 系統光路元件與雷射之架設 .................................................................. 38  3-2 溫控系統介紹........................................................................................... 42  第四章 實驗設計與方法 ....................................................................................... 43  4-1 實驗流程圖............................................................................................... 43  4-2 實驗材料與儀器設備............................................................................... 44  4-2-1 光學元件 ....................................................................................... 44  4-2-2 實驗材料 ...................................................................................... 44  4-2-3 儀器設備 ...................................................................................... 45  4-3 實驗方法................................................................................................... 46  4-3-1 DNA 分子之黏合與稀釋保存 ..................................................... 46  4-3-2 玻片微流道之製作 ....................................................................... 47  4-3-3 藥物與 DNA 之反應條件 ............................................................ 48  第五章 實驗結果與討論 ....................................................................................... 49  5-1 系統建立與數據分析.............................................................................. 49 . VII.

(8) 5-1-1 雷射光鉗系統之架設 ................................................................... 49  5-1-2 系統參數之設定與數據轉換 ....................................................... 51  5-1-3 利用 WLC model 擬合方式求 Lc 及 Lp 值 .................................. 56  5-2 鹽離子效應與 DNA 之探討 .................................................................... 57  5-2-1 離子濃度對捕獲 DNA 之影響 ................................................... 57  5-2-2 分析 DNA 作用於兩種鹽類溶液中輪廓總長之改變量 ........... 59  5-3 探討不同離子濃度下 PD153035 與 DNA 之結合作用 ........................ 60  5-3-1 PD153035 特性 ............................................................................. 60  5-3-2 高鹽濃度環境下對 PD153035 結合 DNA 效率之影響 ............. 61  5-3-3 低鹽濃度環境下對 PD153035 結合 DNA 效率之影響 ............. 63  5-4 計算 PD153035 平衡結合親和力常數與熱力學參數(ΔG) .................. 67  5-4-1 PD153035 平衡常數之推估 ......................................................... 67  5-4-2 PD153035 熱力學參數(ΔG) ......................................................... 73  第六章 結論 ........................................................................................................... 74  第七章 未來方向 ................................................................................................... 76  參考文獻 ................................................................................................................. 78  附錄 ......................................................................................................................... 82  I.  熱力學參數分析 ....................................................................................... 82 . VIII.

(9) 表目錄 表 1-1 單分子操作技術........................................................................................... 2  表 1-2 多種嵌入型及結合於 DNA 溝槽的藥物分子之熱力學參數................... 26  表 5-1 Effect of monovalent ionic strength on the B-form native DNAcontour length …………………………………………………………………………….………....60 表 5-2 Effect of monovalent ionic strength on the B-form DNA contour length in the absence and presence of PD153035 ……………….…………………………..62 表 5-3 Effect of 1 mM sodium cacodylate on the B-form DNA contour length in the presence of PD153035……………….…………………………………………….65 表 5-4 Dependence of the persistence length on the PD153035 concentration……65. IX.

(10) 圖目錄 圖 1-1 單一 DNA 分子的三相圖……….……………………………...………….……………3  圖 1-2 順鉑(Cisplatin) ……….……………………………...………….………….7  圖 1-3 順鉑作用機制……….……………………………...………….…………... 7  圖 1-4 EGFR 訊號傳遞路徑之簡易圖……………………...………….………….9  圖 1-5 藥物結構式……….……………………………...………….……………... 9  圖 1-6 DNA 與配體結合模式…………………………...………….…………… 11  圖 1-7 卟啉半嵌入 DNA 結構中……………………...………….……………... 11  圖 1-8 SFM 影像圖…….……………………………...………….……………… 13  圖 1-9 DNA 進行拉伸-回復過程…………………...………….………………... 16  圖 1-10 利用. 1 F. - x 關係圖求得輪廓總長……...………….……………….......17 . 圖 1-11 Force-Extension 曲線圖…………………...………….……………….... 19  圖 1-12 DNA-Daunomycin complex 之 F-x 曲線圖………….………………..... 20  圖 1-13 DNA - Ethidium complex 之 F-x 曲線圖………….……………….........22  圖 1-14 嵌入型小分子之自由能參與概念圖………….………………............... 25  圖 2-1 平衡常數(lnKD)-溫度(1/T)作圖………………...………….……………. 30  圖 2-2 雷射光束發散現象…………………...………….……………………….. 31  圖 2-3 雷射光束直徑及雷射光腔圖…………...………….…………………….. 32  圖 2-4 光子遇上會折射之物體產生的動量變化量…….………………………. 34  X.

(11) 圖 2-5 Mie 散射原理…………………...………….…………………………….. 35  圖 2-6 偵測乳膠珠與捕捉中心的位移量……….………………………………. 37  圖 3-1 系統光路架設圖………………...………….…………………………….. 40  圖 3-2 利用 QPD 偵測 detection laser 訊號之光路元件架設圖……………….. 41  圖 3-3 加熱平台之實體圖……...………….…………………………….............. 42  圖 4-1 寡核甘酸與 Lambda DNA 黏合配置圖…………………………............. 46  圖 4-2 微流道之製作…...………….…………………………….......................... 48  圖 5-1 雷射光鉗系統俯視圖…...………….…………………………….............. 50  圖 5-2 QPD 偵測 detection laser 訊號之實際架設圖……………........................50  圖 5-3 PD153035-DNA complex F-x 曲線圖……….............................................52  圖 5-4 CCD 影像圖…...………….…………………………….............................53  圖 5-5 決定捕獲之 DNA 為單一條 dsDNA………………….............................. 55  圖 5-6 PD153035-DNA complex 之. 1 F. -x 圖…………….................................... 57 . 圖 5-7 鈉離子濃度對雙股 DNA 分子結構穩定度之影響................................... 58  圖 5-8 PD153035 特性...………….……………………………............................61  圖 5-9 比較 native DNA 與 PD153035-DNA 複合物其力量-長度變化圖.......... 66  圖 5-10 DNA 維持長度隨藥物 PD153035 濃度的增加而相對遞減................... 66  圖 5-11 n 值決定趨勢圖...………….……………………………......................... 71  圖 5-12 DNA 輪廓總長隨 PD153035 濃度變化圖………………....................... 72 . XI.

(12) 符號索引 Š. a:藥物嵌入 DNA 所造成的長度改變(lengthening per intercalation event). Š. B:DNA 鹼基數量(number of base pairs per DNA molecule). Š. d:光速直徑(diameter). Š. E:電場(electric field). Š. E:楊式模數(Yang’s modulus). Š. F:力量(force). Š. I:轉動慣量(moment of inertia). Š. KA:平衡結合親和力常數(binding affinity constant). Š. kB:波茲曼常數(Boltzmann constant). Š. Lc:DNA 輪廓總長(contour length). Š. Lp:DNA 維持長度(persistent length). Š. N:量測組數(number of measurement). Š. n:藥物間隔幾個鹼基對(size exclusion number). Š. nb:乳膠珠折射率(refractive index of bead). Š. ns:溶液折射率 (refractive index of medium). Š. p:光動量(momentum). Š. R:氣體平衡常數(gas constant). XII.

(13) Š. r:DNA 半徑(radius of DNA). Š. S:拉伸模數(stretching modulus). Š. T:絕對溫度(absolute temperature). Š. x:拉伸長度(extension). Š. ΔG:自由能變化量(change in free energy). Š. ΔH:焓值變化量(change in enthalpy). Š. ΔS:熵值變化量(change in entropy). Š. θ:光束發散全角(full-angle beam divergence). XIII.

(14) 第一章 緒論 1-1 前言 過去用於治療癌症之化療方式不但會將癌細胞摧毀,同時亦會造成正常 細胞的死亡,然而隨著醫學的進步,抗癌藥物出現新突破-標靶藥物的問世。 標靶藥物之設計是針對癌細胞有別於正常細胞的部分加以破壞,因此了解藥 物對細胞內機制的作用關係也就相對重要。核酸(nucleic acid)是最常被當作抗 病毒、抗癌、抗生素等藥物的目標物(target)。一般設計結合於 DNA 之藥物, 其主要作用為調節基因的活性;結合於 RNA 之藥物則是抑制蛋白質的轉譯。 因此要設計出一種有效的新藥物,必須深入了解藥物與核酸之間的作用,包 括藥物可辨識的序列、結構之間的影響以及藥物結合的熱力學探討等亦相當 重要[1]。熱力學參數可表現當藥物因不同結構或特殊辨識序列所造成的影 響,因此探討熱力學方面的研究,微卡計(microcalorimetry)成為一個重要的工 具,可用於量測分子間結合的熱力學參數,其中又以 ITC 及 DSC 兩種儀器較 為常見。然而利用微卡計是一種以巨觀方式進行量測的工具,隨著科學的進 步,生物方面的研究已從分子層級更進一步來到"單分子"的層級,因此利用單 分子技術從微觀角度來偵測分子之間相互的關係,已成為近年來熱門的研究 主題。 單分子的操作技術包含兩個主要的元素:其一為探針(probe),主要為偵. 1.

(15) 測力量及位移的變化;另一個則是能夠呈現分子於空間中所在位置之方式。 不同的單分子技術對於力量的量測範圍、位移的改變量、探針的強硬度 (stiffness)都有各自適合應用的地方,也有各自的優缺點。2003 年 Bustamante 學者將不同的單分子偵測技術進行回顧與比較,如表 1-1 [2]: 表 1-1 單分子操作技術 偵測方式. 懸臂樑法. 力量範圍. 最小位移. 強硬度. (N). (m). (Nm–1). 10–11–10-7. 10–10. 10-3–102. (Cantilevers) 10-12–10-10. 微針. 10-9. 10-6–1. (Microneedles) 10-13–10-9. 流場. 10-8. n.a.. (Flow field) 10-14–10-11. 磁場. 10-8. n.a.. (Magnetic field). 應用範圍. 優點. 蛋白/聚醣類. 高空間解析度. 鍵結強度. 商業可用性高. 肌凝蛋白馬達力量. 良好操作控制. DNA/titin蛋白之張力. 柔軟的彈力常數. DNA動力學. 緩衝液重複變換. RNA聚合酶. 設計簡易. DNA entropic. 專一性的磁鐵. elasticity. 誘導力矩的能力. Topoisomerase activity 光子場域. 10-13–10-10. 10-9. 10-10–10-3. (Photo field). 蛋白馬達. 專一性的操作. Protein unfolding. 高力量解析度. 2005 年 Mark C. Williams 團隊利用高解析度雷射光鉗系統進行藥物與 DNA 之間的量測分析,發現當有外力作用下雙股 DNA 變為單股 DNA 時,此 過程中會生成可改變 DNA 結構的自由能,稱之為 melting transition free energy。又提出 DNA 所結合之藥物濃度低於臨界值(critical value)時,DNA 因 受外力作用會造成結構轉變,使 DNA 長度增長,由雙股結構變為單股 DNA, 此過程若將力量及長度作圖,會呈現一個 transition platue 的平穩區間。隨著 藥物濃度的增高,transition platuea 的區域會愈來愈短,當到達臨界值後即消 2.

(16) 失。因此提出一個類似於水之三相圖(壓力-體積-溫度)概念,即力量-長度-藥 物濃度圖,如圖 1-1 [3],然而與水之三相圖相異之處在於水為液態及氣態時 會隨壓力而造成體積減少,DNA 的長度卻會隨著外力上升而增加。此相圖可 以更了解單一 DNA 分子的作用機制及其熱力學變化。 A. B. 圖 1-1 單一 DNA 分子的三相圖 (A)力量-藥物濃度;(B)力量-長度[3]。. 1-2 研究動機 本 論 文 最 重 要 的 研 究 動 機 是 建 立 以 生 物 單 分 子 技 術 (single-molecule technigue)來檢測藥物分子與 DNA 的結合反應,希冀建構以生物單分子力學特 性為基礎的微觀分析方式,進而與傳統利用生物物理或生物化學技術所獲得 巨觀量測方法的實驗數據相互比較與對照。 2001 年 Goossens 學者等人利用螢光光譜儀(fluorometer)分析 PD153035 及其類似結構物 EBE-A22,實驗條件將藥物濃度固定為 5 μM,改變 DNA 相 對濃度範圍(0.1 μM~1 mM bp),以波長 360 nm 分別激發兩藥物。發現當 EBE-A22 接上 DNA 後,在發光波長(emission wavelength) 436 nm 可看見一個. 3.

(17) 明顯的吸收峰值(absorption peak);然而當 DNA 未接上 EBE-A22 時,其吸收 值則非常弱。因此可以推算出 EBE-A22 其平衡結合親和力常數值(binding affinity constant)約為 1.86 × 104 M-1。但相較於 PD153035 則因為螢光強度太 過微弱,無法測得吸收值,因此無法推算出平衡結合親和力常數[4]。2007 年 Grout 學者證實 PD153035 可嵌入 DNA 結構中,造成染色質結構的改變[5]。 近年來,雷射光鉗系統(optical tweezers system)已證實對於嵌入型的結合 模式極具靈敏性,即使藥物的濃度非常低,抑或者 DNA 與藥物間靜電作用力 極強,依舊可以推算 DNA 與藥物之間的結合相關參數以及熱力學相關參數 [3,6]。2007 年 Mark C. Williams 團隊利用光鉗系統測量四種小分子(ethidium、 Ru(phen)2dppz2+、Ru(phen)32+、Ru(bpy)32+)與 DNA 的結合模式。實驗中改變藥 物的濃度,分別於不同濃度下得到 DNA-藥物之長度變化及相對力量大小,最 後 可 得 DNA- 藥 物 之 力 量 - 長 度 (force-extension , F-x) 二 維 相 圖 。 並 利 用 McGhee-von Hippel model 擬合所得到的數據,即可推算出平衡結合親和力常 數及藥物嵌入 DNA 的量。Williams 等學者並提出,當 DNA 受到一個外加的 拉力,會改變 DNA 的彈性(elasticity)及柔軟度(flexibility),造成 DNA 的力學 特性改變,因此若 DNA 嵌入藥物後再受到一個外力作用,可能使得更多的藥 物嵌入 DNA 結構內,直到結合反應達到飽和狀態[6]。 然而,2009 年 Gijs J. Wuite 學者的研究團隊發現針對 YOYO 螢光染劑嵌 入單一 DNA 分子後,利用雷射光鉗系統進行 DNA 的拉伸測試,並觀察 YOYO. 4.

(18) 染劑的螢光訊號變化。實驗結果顯示 YOYO 染劑在整個拉伸過程並沒有出現 螢光訊號強度的改變,同時發現即使在 DNA 分子高於過度拉伸的轉折區域 (overstretching transition),YOYO 染劑仍與 DNA 緊密結合,亦即較高的拉力 並不會促進更多的藥物嵌入 DNA 結構中[7],此論點恰與 Williams 團隊所提 出的假說相異。 由於外力作用是否會促使更多的藥物分子嵌入 DNA,目前尚無定論,同 時目前尚無利用生物單分子技術來探討 PD153035 與 DNA 的結合模式以及相 關平衡結合親和力常數之量測值。因此本實驗希望藉由高解析度光鉗系統探 討 DNA 分子在低作用力的情況下,分析 PD153035 嵌入 DNA 時的結合模式 以及平衡結合親和力常數的計算,同時並配合溫控系統希冀得到 PD153035 藥 物分子完整的熱力學圖譜。. 1-3 文獻回顧 1-3-1 非小細胞肺癌簡介 隨著高齡化與生活型態改變等因素,癌症已高居國人死亡率第一。根據 國民健康局統計,國人罹癌高度集中於肺癌、直腸癌、肝癌、乳癌和口腔癌 等前五大癌症。其中,空氣污染和吸菸人口的增加,是促使肺癌高居第一名 很大的因素[8]。肺癌可以分為小細胞肺癌(small cell lung cancers,SCLC)及非 小細胞肺癌(non-small cell lung cancers,NSCLC)兩種,而非小細胞肺癌又較為. 5.

(19) 常見,約佔所有肺癌病人數 80% - 85%,主要由腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌 所組成。. 1-3-2 非小細胞肺癌臨床治療 治療非小細胞肺癌主要是靠手術、放射療法(radiotherapy)或化學療法 (chemotherapy)。不幸的是,約 70%的病人在診斷時都已經無法接受手術,只 能接受以化學治療為主之緩和治療。目前第一線化學治療藥物主要是以含鉑 類藥物-順鉑(cis-platin)為主,其結構式如圖 1-2 [9]。順鉑是以靜脈注射給予, 當其循環於血液中時,屬於高氯離子環境,濃度約在 100 mM,因此順鉑之結 構穩定而非離子化,這樣容易使藥物進入腫瘤細胞內。當順鉑進入細胞內, 氯離子濃度低(約為 4 mM),導致順鉑結構中的氯分子被水分子取代形成正電 荷 之 活 性 物 。 這 樣 的 活 性 物 會 與 DNA 形 成 股 內 交 聯 結 合 (intrastrand cross-linking),結合於 DNA 相近嘌呤(purine)間的氮原子(N7)上,其中又以鳥 嘌呤(Guanine)占多數[10,11]。此結合可以阻斷 DNA 模板(template)進行複製, 抑制 RNA 進行轉錄[12],使得細胞停留於細胞週期 G2 階段,因而進行計劃 性死亡(programmed cell death),如圖 1-3 所示[9]。也因此,此種藥物是唯一被 使用於抗腫瘤藥物的重金屬物質。然而,化療藥物不分癌細胞或是正常細胞 (normal cell)皆會造成毒殺,特別是骨髓造血細胞、口腔黏膜細胞和毛囊細胞, 化療後容易造成嘴破、掉髮、免疫低下等副作用。. 6.

(20) 圖 1-2 順鉑(Cisplatin). 圖 1-3 順鉑作用機制. 因此,近年來研發出針對癌細胞量身訂「治」的標靶治療(target therapy), 利用癌細胞大量表現生長因子之特性,以具專一性(specificity)的藥物來阻斷接 受器,使癌細胞無法接受到體內生長因子的刺激,或使癌細胞內生長訊息之 傳遞受到阻斷,無法將訊息傳入細胞核,以達到控制癌細胞的增殖、凋亡、 血管新生(angiogenesis)以及轉移,但對於正常細胞幾乎無傷害性[13]。. 7.

(21) 表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)為酪胺酸激 酶(tyrosine kinase)家族之一,於不同型態的細胞上表現。EGFR由三種蛋白結 構域(protein domain)所組成,分別為細胞膜外的配體結合結構域(extracellular ligand-binding domain),穿透細胞膜之間的穿透膜親油性片段(transmembrane lipophilic segment) , 以 及 細 胞 質 內 的 酪 胺 酸 激 酶 蛋 白 結 構 域 (cytoplasmic protein tyrosine kinase domain)。當配體與細胞外接受器結合後,就會引發結構 改變形成雙聚體化(dimerization),受體將會相互磷酸化而形成活化狀態,這個 現象稱作自體磷酸化(autophosphorylation),引發一連串的訊號由細胞質傳遞進 入細胞核,造成細胞的增生以及癌細胞的生長。許多類型之癌細胞皆會大量 表現EGFR,非小細胞肺癌亦屬於其中之一[14,15]。故標靶藥物之設計即利用 單株抗體(monoclonal antibodies,mAb)阻礙配體結合結構域,或以小分子的抑 制劑來抑制EGFR之酪胺酸激酶活性[16-18],使癌細胞生長停滯,進入細胞凋 亡(apoptosis),如圖1-4所示。目前標靶藥物主要以艾瑞莎(ZD1839,Iressa®)、 得 舒 緩 (OSI-774 , Tarceva®) 以 及 PD153035 三 種 酪 胺 酸 激 酶 抑 制 劑 (tyrosin kinase inhibitor,TKI)為常見藥物,結構式如圖1-5[18,19]。 而2007年Thomas W. Grunt等學者提出PD153035除具有TKI功能外,同時 還會進入細胞核,嵌入(intercalate)DNA結構中,造成染色質結構的改變[20], 然而ZD1839同樣具有TKI功能,卻不具有嵌入DNA結構中的特性。. 8.

(22) 圖 1-4 EGFR 訊號傳遞路徑之簡易圖. A. B. C. 圖 1-5 藥物結構式 (A) Iressa®、(B) Tarceva®、(C) PD153035. 1-3-3 藥物與 DNA 之結合模式類型 核酸配體(nucleic acid ligand)已被發現且成功的用於抗癌藥物設計與研 究,同時亦可作為 DNA 上核酸損壞(damage)及結構分析的探針(probe);另一 方面可用於治療因基因、致癌基因(oncogene)以及病毒所造成之疾病[21]。任 9.

(23) 何可與 DNA 作用之小分子或藥物皆屬於配體的一種。利用配體作為癌症治療 之有效設計,一直以來都是研究的重心,了解藥物與 DNA 之間的結合模式與 作用機制亦相對重要[3]。DNA 與藥物之間的結合模式,除了共價鍵結之外, 還可分為專一性及非專一性之非共價鍵結合類型[21,22]: (1) 嵌入式(intercalation),嵌入型的藥物會經由 π-π 疏水鍵(π-π hydrophobic)以 及凡得瓦力(van der Waals)與 DNA 上相鄰鹼基對(base pair)穩定結合 [1,2,23]。1991 年 McMurray 等學者提出,當配體嵌入 DNA 中,將可能導 致 DNA 之雙股螺旋解開,對於核小體(nucleosome)結構造成極大的影響 [24],如圖 1-6 (A); (2) 雙嵌入式(bisintercalation)[25],例如常見的 DNA 染劑 YOYO-1 即為此類 型; (3) 結合於 DNA 之大溝(major groove)或小溝(minor groove),配體以凡得瓦力 與 DNA 結合,中間會形成氫鍵並產生靜電(electrostatic)作用力。1986 年 Zimmer 及 Wähnert 證實藥物結合於 DNA 之小溝,會妨礙 DNA 發生彎折 (bending)進而影響調節蛋白結合於 DNA 結構中的特殊序列[26],如圖 1-6 (B)及(C); (4) 非典型式(nonclassical)結合,1996 年 Leigh Ann Lipscomb 等學者於文獻中 提到卟啉(prophyrin),此種配體半嵌入 DNA 結構後,使單股結構中的鹼基 被擠出原雙股螺旋結構外,形成凸起物(bulge),如圖 1-7 [27];. 10.

(24) DNA 與配體之間的作用對於細胞內許多生化反應之過程相當重要,當細 胞內特殊蛋白結合於 DNA 上特定序列時將可控制 DNA 進行複製、轉錄、轉 譯等過程。因此,當小分子配體結合於 DNA 上非特定序列時,將可能改變 DNA 原有結構之力學特性(mechanical property),抑制這些生化過程之進行, 故經常用於癌症治療一途上[28]。 A. B. C. 圖 1-6 DNA 與配體結合模式 (A)嵌入 DNA 鹼基對間、(B)結合於大溝、(C)結合於小溝。. 圖 1-7 卟啉半嵌入 DNA 結構中. 11.

(25) 1-3-4 以單分子技術量測藥物與 DNA 結合模式 探討核酸與藥物間相互作用之結合模式(binding mode)及作用機制,是研 發一種新型藥物最基本之首要步驟。過去用於分析三度空間中結構之間的結 合模式,主要以NMR光譜及X光繞射(X-ray diffraction)方式為主,1994年 Shigehiro Kamitori 及 Fusao Takusagawa學者即利用單一結晶X-ray之方式証 實Actinomycin D此種抗癌藥物會以多種模式(multiple model)結合於DNA小溝 5’-GC-3’序列間,此結果與過去利用NMR方式証實許多藥物與DNA之間結合 的構形呈現多種模式亦相符合[29]。 然而,1996 年 Coury 等學者提出了新的分析方式,認為當 DNA 結合上 配體後會造成 DNA 的輪廓總長(contour length,Lc)改變,可利用掃描力顯微 鏡(scanning force microscopy,SFM)觀察長度之變化。Coury 等學者認為過去 以 NMR 及 X-ray 方式決定 DNA 與配體結合模式皆屬於間接量測,此外以這 些方式進行測量時,須將樣品製成結晶狀,不僅費時同時也因為製成結晶狀, DNA 的片段大小會受到限制,若結合模式包含多種型態將可能失去準確性。 因此提出利用 SFM 來做觀測,提供一個高空間解析度直接影像觀察法[21], 如圖 1-8。. 12.

(26) A. B. 圖 1-8 SFM 影像圖 (A) native DNA;(B) DNA 嵌入 ethidium,長度明顯變長[21]。. 當 DNA 在自然狀態下每個鹼基(base)的長度為 0.34 nm,若 DNA 結合配 體之後,DNA 的輪廓總長(Lc)增加,表示此配體屬於嵌入型,如圖 1-8 (B), 圖中為 DNA 嵌入 ethidium 後可發現長度明顯增加。此外將配體的濃度當作一 個可變參數,觀察隨濃度改變時 DNA-配體之長度變化,利用濃度與長度變化 可以推算出配體結合於 DNA 的平衡結合親和力常數 KA (equilibrium binding affinity constant,KA): KA =. [occupied intercalation sites] [unoccupied intercalation sites][free drug]. (1-1). 然而Coury等學者以SFM方式分析時,須將DNA固定於雲母片上,因此所得到 之分析結果僅限於DNA與配體反應後,靜止狀態下之表現,無法觀察DNA與 配體之間的動態模式。. 13.

(27) 2001年Goossens等學者利用螢光光譜儀希望可量測PD153035之平衡結合 親和力常數,因此分別利用PD153035及其類似結構物EBE-A22,將藥物濃度 固定為5 μM,而改變DNA相對濃度由0.1 μM至1 mM bp,以波長360 nm分別 激發兩藥物。發現當EBE-A22接上DNA後,在發光波長436 nm可得到一個明 顯的吸收峰值;然而當DNA未接上EBE-A22時,其吸收值則非常弱。因此可 以推算出EBE-A22其平衡結合親和力常數值約為1.86 × 104 M-1 。但相較於 PD153035則因為螢光強度太過微弱,無法測得吸收值,因此無法推算出平衡 結合親和力常數值[4]。 近年來,研究走向希冀藉由更為靈敏的技術以分子層級量測出分子內或 分子之間的力量變化。選擇一個適當的單分子量測技術相當重要,Bustamante 研究團隊於2000年文獻中提到藉由流力(hydrodynamic)、磁力(magnetic)以及光 子(photon)外加場下(external field)操作技術可提供另外測量單分子的方式。其 中利用光子場域方式量測主要為光鉗(optical tweezers)系統,此技術具有高力 量解析度(high force resolution)之特色。1980年Ashkin等學者揭露雷射光鉗系統 極具發展性後,開始引起許多學者將此技術做更深入之應用,用於量測不同 類型分子馬達(molecular motors)的力量強度變化,包括傳動素(kinesin)於微管 上的運動模式、肌動球蛋白、RNA及DNA聚合酶等研究,也有應用於測量DNA 的彈力特性及力學特性之探討[2,30]。2003年Andy Sischka等學者於研究中則 提出雷射光鉗系統是一個極靈敏又高精密的量測方式,可量測的力量強度範. 14.

(28) 圍最高與AFM量測範圍重疊(約150 pN),最小僅有0.5 pN亦可測得,較AFM系 統更為靈敏[31]。同年,Tessmer等學者利用光鉗系統量測不同藥物,包括會 結 合 於 DNA 小 溝 的 抗 生 素 藥 物 -netropsin ; 嵌 入 DNA 結 構 中 的 螢 光 染 劑 -ethidium bromide ; 以 及 同 時 結 合 於 DNA 大 溝 並 嵌 入 DNA 結 構 中 的 藥 物 -beneril,當藥物分別與DNA結合後,以光鉗系統將DNA兩端鉗住,固定速率 下拉伸DNA,即可得到一個力量-長度曲線圖(force-extension curve,簡稱F-x curve)。再利用Worm-Like Chain (WLC) model擬合所得數據,即可推算出DNA 結 合 不 同 藥 物 後 的 輪 廓 總 長 (Lc) 以 及 維 持 長 度 (Lp) 之 間 的 差 異 性 [30] 。 Bustamante等學者於1996年利用雷射光鉗系統拉伸DNA,分析不同拉力下 DNA的彈力特性,再利用過去文獻中所提出的WLC model進行擬合,如圖1-9 所示。圖中主要可分為三個部分,第一部分當DNA所受到的力小於15 pN時, 其DNA長度約在10~15 μm,此範圍內DNA所受之力用於抵抗DNA本身randon coil之熵值(entropy),此階段稱之為inextensible worm-like chain;直到DNA的 長度接近輪廓總長約16 μm (因λ-DNA具有48502 bp × 0.34 nm / bp≒16.4 μm) 時,力量會急遽上升,此時因為DNA所受之力用於抵抗DNA本身鹼基對之間 鍵結的焓值(enthalpy),因此此階段DNA長度幾乎不變。當力量小於60 pN時, DNA仍然維持B-form構形,此時DNA本身帶有一個彈性的拉伸係數(stretching modulus),如圖中以點狀代表的曲線,此階段亦稱為extensible worm-like chain;而圖中兩條虛線,左邊虛線為inextensible worm-like chain所延伸,會與. 15.

(29) 右邊虛線extensible worm-like chain所擬合之結果有差異性,因為extensible worm-like chain model中有加入了拉伸模數,因此較為準確,但所量測範圍不 超過overstrenching的部分。而overstrenching的階段即為圖中的第三部分,力量 約在65 pN,圖形趨於平緩,此時DNA分子的長度開始延伸,甚至發生DNA 鹼基外翻,造成過度拉伸(overstretch)的現象,過度拉伸的範圍幾乎到達原 B-form輪廓總長的1.7倍,相當於每個鹼基長度由3.4Å增長至5.8Å,在這個過 渡(transition)的區域間力量只有些微的增加約2 pN。而力量再次劇增會發生於 DNA長度大於28 μm,因為此時的DNA結構已完全的過度拉伸,若繼續拉伸至 100 pN時,DNA兩端的biotin-streptavidin鍵結將會斷裂[32]。. 圖 1-9 DNA 進行拉伸-回復過程 利用 λ-DNA 進行此實驗,緩衝溶液的條件為 150 mM NaCl,10 mM Tris,1 mM ETDA,pH 8.0[32]。. 1997 年,Steven M. Block 等學者於文獻中利用過去針對於 WLC model. 16.

(30) 所提出的公式來擬合實驗數據。首先由 Marko-Siggia 於 1995 年提出的公式, 主要針對低外力(low force,F<15 pN)情況下,DNA 熵值的推測[33]: ⎛ k B T ⎞⎡ 1 1 x⎤ ⎟⎟⎢ − + ⎥ 2 4 Lc ⎦⎥ ⎝ LP ⎠⎣⎢ 4(1 − x / Lc ). F = ⎜⎜. (1-2). 此時的 F 為施予 DNA 的外力,x 為 DNA 分子的長度,kB 為波茲曼常數 (Boltzmann constant),T 為絕對溫度。當 DNA 所受外力屬於 low force,此時 的 DNA 總長趨近於 DNA 的輪廓長度(x ≈ Lc),因此公式 1-2 可化簡為: 1 F. 若以公式中的. 1 F. ≈. 4L p ⎛ x ⎜⎜1 − k B T ⎝ Lc. ⎞ ⎟⎟ ⎠. (1-3). 及 x 作圖,再利用曲線擬合(curve fitting)可得到一直線方程. 式,此方程式與 X 軸相交之截距即為輪廓總長(Lc);而方程式與 Y 軸相交所 得之截距為. 4L p k BT. ,因此可推算出維持長度(Lp)。如圖 1-10 所示:. 圖 1-10 利用. 1 F. - x 關係圖求得輪廓總長. 17.

(31) 而後又有學者針對 Marko-Siggia 提出之公式進行修改,將 DNA 的拉伸模 數考慮入內,針對熵值及焓值之推測,主要擬合的實驗數據為拉力較高(high force)的區域,20 pN 以上。此公式為: ⎛ k B T ⎞⎡ 1 1 x F⎤ ⎟⎟⎢ − + − ⎥ 2 ⎝ LP ⎠⎣⎢ 4(1 − x / Lc + F / S ) 4 Lc S ⎥⎦. F = ⎜⎜. 公式中 S 為 stretching modulus,若假設 y =. (1-4). x F − ,可將公式 1-4 改寫為: L0 S. ⎤ ⎛ k B T ⎞⎡ 1 ⎟⎟ ⎢ 0 . 25 − + y ⎥ 2 ⎝ L P ⎠ ⎣ 4(1 − y ) ⎦. F = ⎜⎜. (1-5). 在 F-x 曲線圖中 extensible 的部分可得到一直線方程式,此方程式與 X 軸交點 即為 Lc,此時 Lc 為 DNA 之輪廓總長,如圖 1-11 所示。而此直線方程式之斜 率(slope)乘上 Lc 可得到 DNA 的 stretching modulus (S)。而維持長度(Lp)可用下 列公式求得: Lp =. k k BT. (1-6). 其中, k = EI =. S ⎛ πr 4 ⎜ A ⎜⎝ 4. ⎞ S ⎛ πr 4 ⎟⎟ = 2 ⎜⎜ ⎠ πr ⎝ 4. ⎞ πr 2 ⎟⎟= 4 ⎠. (1-7). 公式中 E 為楊式模數,I 為圓柱轉動慣量,S 為 stretching modulus,r 為 DNA 的半徑(約 1 nm),kB 為波茲曼常數,T 為絕對溫度。因此可將公式 1-7 代入公 式 1-6 中求得維持長度之值:. 18.

(32) Sr 2 Lp = 4k B T. (1-8). 圖 1-11 Force-Extension 曲線圖 針對圖中的 extensible model 部分進行曲線擬合,可得一直線方程式,此方程 式與 X 軸之交點即為輪廓總長(Lc) [34]。. 2005 年,Andy Sischka 等學者亦利用雷射光鉗的方式量測 DNA 結合不同 藥物(YO-1、distamycin-A、daunomycin、YOYO-1)後之輪廓總長及維持長度, 當施予 DNA 的外力超過一數值後,即可觀察到 WLC model 中雙股 DNA 鹼基 對之間因外力造成外翻,稱之為 overstretching transition 的階段,此階段中 DNA 結構發生改變。此外,以固定的速率拉伸單一條 DNA 時,若系統反應達到平 衡則在拉伸-回復(stretching-relaxing)過程中,拉伸及回復的曲線會重合;若反 應未達平衡會發現 DNA 於 relaxing 階段,因外翻的鹼基來不及回復,F-x 曲. 19.

(33) 線圖中會出現磁滯現象(hysteresis) [22]。當 DNA 與藥物結合後亦然,就如 Andy Sischka 等學者文獻中指出拉伸 DNA-Daunomycin complex,因藥物與 DNA 反 應未達平衡即可觀察到 relaxing 過程中會出現磁滯現象,若以不同速率(1000 nm/s、5000 nm/s、12000 nm/s)進行,所呈現之磁滯現象亦會有所差異,此現 象即為藥物特性所造成,如圖 1-12 所示:. 圖 1-12 DNA-Daunomycin complex 之 F-x 曲線圖 在高速率之下,Daunomycin 嵌入 DNA 會於 stretching- relaxaing 週期中出現磁 滯現象[22]。. 2007年Mark C Williams團隊同樣以雷射光鉗系統來量測不同藥物與DNA 結合的F-x曲線圖,認為藥物嵌入DNA的量會隨著DNA所受外力提升而增加, 稱此現象為force-dependent,再藉由McGhee-von Hippel model來擬合實驗數 據,如方程式1-9,即可推算出不同外力下的平衡結合親和力常數(KF),在間. 20.

(34) 接推算出DNA不受外力下藥物的平衡結合親和力常數(K0),如方程式(1-9): γ F (C ) = K F × C ×. (1 − n F γ F )n (1 − n F rF + γ F )n f. f. K F = K0 × e FΔX / kBT. −1. (1-9) (1-10). 其中,方程式1-9中,KF及nF分別為不同外力下之藥物平衡結合親和力常 數及藥物結合位置大小(bp);方程式1-10中,K0為DNA不受外力下藥物平衡結 合親和力常數,kB為波茲曼常數,T為絕對溫度[6]。 此外2007年Mark C Williams文獻中,DNA未嵌入藥物時由F-x曲線圖中可 發現DNA受到的拉力在15 pN~ 60 pN左右時,DNA每個鹼基分子長度幾乎維 持於約0.34 nm,而後DNA長度開始增長至每個鹼基長度約0.55 nm,此階段 DNA所受的外力幾乎維持於60 pN,出現一個transition platue平穩區。然而藥 物分子嵌入DNA後,在相同外力之下,如40 pN時DNA每個鹼基平均的長度較 原DNA長(大於0.35 nm),當藥物分子濃度愈高時,每個鹼基平均長度亦愈長, F-x曲線圖的趨勢會愈往右移。因此當藥物分子為嵌入型,DNA長度會明顯增 長。另外,藥物分子的濃度愈高時,結構也愈穩定,因此要使DNA從雙股變 為單股結構所施予的外力也就相對愈大,故F-x曲線圖中出現transition platue 也向較高外力偏移。如圖1-13所示:. 21.

(35) 圖 1-13 DNA - Ethidium complex 之 F-x 曲線圖 DNA 長度之量測,分別比較單獨 DNA 及不同濃度下之 ethidium 嵌入 DNA 時 的 F-x 曲線圖。. 1-3-5 藥物結合於 DNA 之熱力學分析 要設計一個有效結合於 DNA 的新藥物,了解此藥物偏好結合之特殊序列 以及結合模式皆是值得深入探討的領域。為使這些經過設計合成的小分子藥 物能夠成功結合於 DNA,藉由抑制或調控基因表現以達到化學治療之目的, 過去文獻中提及不僅需了解藥物結合的模式,能量因子(energetic factor)對於 反應過程亦相當具有影響力[35]。因此,過去許多文獻皆針對 DNA 與藥物之 間作用時自由能的貢獻及其熱力學做深入探討。最常用於量測分析熱力學的 方式是利用微卡計來測量分子間熱力學變化,其中包括 ITC 及 DSC 兩種最為 廣泛,此兩種儀器皆以巨觀的方式量測物質的熱力學參數[1,36]。而在 2001 年 Gerhard Hummer 和 Attila Szabo 兩位學者提出利用單分子操作以微觀的方. 22.

(36) 式量測藥物與 DNA 作用時之自由能變化[37]。2004 年時 William L. Jorgensen 學者提出一篇以電腦程式來計算熱力學相關參數的文獻,研究學者利用數值 運算(numerical)之方式針對 DNA 與藥物分子間結合時的空間結構、辨識序列 來進行運算,模擬分子間結合之模式,進而推算出過程中自由能的變化[38]。 1998年Jonathan B. Chaires學者於文獻中提出兩種藥物與DNA結合的模式 分別為嵌入型分子以及結合於DNA溝(groove binder)兩類型,能夠嵌入DNA中 的小分子如EtBr、Daunorubicin、Actinomycin即是誘導DNA解開雙螺旋之結 構,使小分子嵌入鹼基對中出現堆疊的構型。然而會結合於DNA溝槽中的小 分子如Distamycin A、Netropsin、Hoechst 33258等則與嵌入式小分子相異,不 需要明顯改變DNA的結構即可與DNA結合。因此Jonathan B. Chaires學者認為 此種現象就如同於酵素-受質(enzyme-substrare)結合時,嵌入型的小分子會進 行induced fit DNA的機制,而結合於DNA溝槽中的小分子就如lock-and-key, 彼此構型吻合才會進行結合[39]。 然而不管是嵌入式或者結合於溝槽中的小分子,在進行結合的過程中皆 是取決於自由能變化量的大小以決定反應之快慢。當嵌入型的小分子要嵌入 鹼基對時,因為對於DNA結構造成改變,自由能對於此過程的貢獻也就相對 重要。為使小分子平面結構的發光基團-芳香族能夠進入鹼基對間,鹼基對必 須分開至足夠的空間,故會造成DNA雙股螺旋之解開,使得磷酸之間的空間 也增加,此時即會減少電荷的密度,釋放出抗衡離子(counterion)。如圖1-14. 23.

(37) (A) , 此 過 程 的 自 由 能 大 於 零 (ΔG>0) , 表 示 此 反 應 為 非 自 發 反 應 過 程 (non-spontanious process)。而接下來的步驟,嵌入的小分子中不帶電荷的芳香 族 要 從 溶 液 中 進 入 到 鹼 基 對 間 , 就 如 同 疏 水 性 造 成 的 轉 移 (hydrophobic transfer)。若小分子帶正電,此過程將會釋出額外的抗衡離子,使小分子能夠 更易進入鹼基對間,此時的自由能小於零(ΔG<0),過程為自發反應(spontaneous process),如圖1-14 (B)。當嵌入式小分子嵌入鹼基之間時,則會開始形成非共 價鍵之鍵結反應,小分子與DNA可能會形成專一性的氫鍵,伴隨著凡得瓦力、 離子鍵的形成以及芳香族堆疊的作用。此過程中的自由能即為自發反應 (ΔG<0),如圖1-14 (C)。而在groove binder中,因為不需要改變DNA構型,因 此參予的自由能只包括後兩者[39]。. 24.

(38) 圖 1-14 嵌入型小分子之自由能參與概念圖 (A) DNA 構型改變,ΔG>0;(B)疏水性轉移,ΔG<0;(C)分子間作用力重 組過程,ΔG<0 [39]。. 研究藥物與DNA之間完整的熱力學主要取決於藥物的結合親和力及其專 一性,在大多數的研究中第一步先決定實驗中平衡結合親和力常數(KA),也因 此可求得吉布斯自由能變化量(ΔG)。求得KA的方式一般是利用藥物未結合上 DNA以及已結合上DNA的濃度來估算。然而,自由能的變化(ΔG)又會隨著反 應平衡時環境中的溫度而影響,也就表示反應過程中的焓值變化(ΔH)亦會受 到溫度而改變。焓值的改變(ΔH)可間接藉由溫度隨著平衡結合親和力常數(KA) 25.

(39) 之間的變化關係,利用van’t Hoff衍生方程式來推算。而當溫度改變可得到對 應的焓值(ΔH),即可得到此藥物的熱熔變化量(heat capacity,ΔCp,ΔCp = ΔH / ΔT)。故當ΔG、ΔH為已知數,即可利用吉布斯自由能方程式(Gibbs free energy function,ΔG = ΔH - TΔS)來探討反應過程中的熵值變化(ΔS) [40]。最後即可得 到如過去文獻中多種嵌入型及結合於DNA溝槽中的藥物分子其完整的熱力學 圖譜,包含有不同溫度之下的(ΔG、ΔH、ΔS以及ΔCp),如表1-2 [1]:. 表 1-2 多種嵌入型及結合於 DNA 溝槽的藥物分子之熱力學參數. 26.

(40) 1-4 章節提要 本篇論文主要為探討 PD153035 之熱力學參數,利用 van’t Hoff 衍生方程 式(ΔG = -RTlnKA,R:氣體平衡常數,T:絕對溫度,lnKA:平衡結合親和力 常數),分析相關熱力學參數中自由能變化量(ΔG)。此外論文中將分為以下幾 個章節作介紹: 第一章 緒論:將簡介熱力學對於藥物設計之重要性,以及利用高解析度 雷射光鉗系統分析藥物與 DNA 之結合模式及相關熱力學參數。並提出本論文 將針對非小細胞肺癌之標靶藥物 PD153035 進行分析的研究動機,以及藉由文 獻回顧了解量測藥物與 DNA 結合模式之相關研究。 第二章 實驗原理:介紹本研究中所使用的高解析度雷射光鉗系統其作用 原理,並同時說明如何分析藥物熱力學參數之變化量。 第三章 系統介紹:在此章節中介紹本實驗設計光路之概念及原理,同時 簡單介紹本實驗團隊自行設計之溫度控制系統。 第四章 實驗設計及方法:利用流程圖呈現本實驗主要操作流程,並提供 實驗所使用之光學元件及儀器設備,同時簡單呈述實驗步驟及樣品配置流程。 第五章 實驗結果與討論:於此章節中呈現實驗所得結果並同時探討過程 中所發現之問題,詳細介紹實驗數據分析之方式。 第六章及第七章:本研究總結並提出未來可繼續深入探討之方向。. 27.

(41) 第二章 實驗原理 2-1 分析藥物結合於 DNA 之熱力學 熱力學於藥物設計時扮演相當重要的角色,能夠了解藥物的熱力學變化 才可設計出一個有效的藥物。熱力學主要為分析熱與其他能量形式間量化之 一門學問,包括機械能、化學能、輻射能等。一物質因為整體或某部分的運 動而具有動能,如分子、原子和電子,因為其位置或方位的特性而具有位能。 要想知道一個系統能量的絕對值是不可能的,但卻可以記錄當系統進行某種 轉變時的能量變化,熱能的變化常用卡(calories)表示。能量可視為一種與數量 無關的內涵因素(intensive property)及一個與系統質量成正比的外延因素 (extensive property)之變化量乘積來表示。而熱能的內涵因素為溫度(deg),外 延因素則為熵值的改變(entropy change,cal/deg),能量的單位常用卡。熱力學 基於三種原理推論所得的結論,通常以數學方程式來表達,稱之為熱力學定 律。本論文中相關熱力學公式推導請參見附錄 I。 過去文獻中用於探討藥物分子與DNA結合時之熱力學分析,藥物的平衡 結合親和力常數(KA)為其中一個重要的參數,2006年Yasmina S.N.等學者於文 獻中即利用van’t Hoff方程式來求得焓值變化量[41]。熱力學第二定律中提出的 Gibbs方程式如下: ΔG = ΔH - TΔS 而 van’t Hoff 方程式所衍生出的關係式:. 28. (2-1).

(42) ΔG = - RT lnKA. (2-2). 由公式 2-1 及 2-2 可得: ΔH – TΔS = - RT lnKA 故. lnKA = − ΔH + ΔS RT. R. (2-3). 而在 Yasmina S.N.等學者 2006 年文獻中利用 van’t Hoff 方程式求焓值變化時, 將 KA 取倒數後再進行作圖,假設 KD =. 1 ,因此可將公式 2-3 改寫為: KA. ln(KD) = ΔH - ΔS RT. R. (2-4). 再將公式 2-4 同時對溫度作微分,可得到: d ln(K D ) =. ΔH ⎛ 1 ⎞ d⎜ ⎟ R ⎝T ⎠. (2-5). 將公式 2-5 整理後可得: d ln (K D ) ΔH = R ⎛1⎞ d⎜ ⎟ ⎝T ⎠. (2-6). 由公式 2-6 可得知,利用平衡常數取自然對數(ln KD)後與相對溫度取倒數( 1 ) T. 作圖,可得到一條直線,而此直線之斜率即為焓值變化之常數除以氣體常數 (R),如圖 2-1 所示:. 29.

(43) 圖 2-1 平衡常數(lnKD)-溫度(1/T)作圖 利用 van’t Hoff 衍生方程式,將溫度取倒數後(1/T)與所對應之平衡常數取自然 對數後(lnKD)作圖,所得之斜率即為(. ΔH ) [41]。 R. 2-2 高解析度雷射光鉗系統 本實驗中所使用之雷射可分為兩部分:用於捕獲乳膠珠之 1064 nm 雷射 光鉗(trapping laser),以及作為量測位移之 830 nm 偵測雷射系統(detection laser)。將系統原理分為以下三節作簡介:. 2-2-1 雷射光之特性 雷射光與普通光源(如日光燈)所發出的光波相比較,雷射光通常具有高度 的單色性(窄頻帶)及指向性(小發散角),所謂高指向性是指雷射光雖然經過長 距離的傳播,它仍然可維持細小的光束而不擴散,而普通光源則會散開,固 可將雷射光視為準平行光。通常以擴散角(divergence angle)來量度雷射光的指 30.

(44) 向性,擴散角度大,代表指向性較差。雖然雷射所發射出的光被限制在極窄 的圓錐形內,但當光束向外傳播時,它將會慢慢地擴散或是扇形散開來。如 圖 2-2 所示,為圓柱型光束發散的放大圖。在雷射孔徑的輸出光速直徑為 d, 光束擴散角為θ。假設光束傳播 L 距離後,光束擴散成直徑 d’的圓柱型。因 為 d 本身極小,考慮簡單的幾何學可得: ⎛θ ⎞ ⎛θ ⎞ d ' = L⎜ ⎟ + L⎜ ⎟ + d ⎝2⎠ ⎝2⎠ = Lθ + d. (2-8). 2-8 式子中,θ稱為光束發散全角(full-angle beam divergence),發散角的大小 影響光束的平行度以及聚焦的能力,在校準時深受影響[42]。. 圖 2-2 雷射光束發散現象. 波傳播垂直方向上的電磁場變化現象稱之為電磁橫向模態,或稱 TEM 模 態,橫向模態通常以 TEMmn 來表示電場在空間位置的分佈,TEM 是取自 (transverse electromagnetic wave)的縮寫代表橫向電磁波的意思。而 TEM00 又被 稱為單相模態(uniphase mode),因為它是唯一能讓所有光束在任何給定的時間 內,均保持同相位的橫向模態。最低序模態為 TEM00 模態,其雷射光束輻射. 31.

(45) 強度呈現高斯分佈(Gaussian),故又稱之為高斯光束(Gaussian beam)。光束直 徑定義為:由光束中心到照度(E)減為 1/e2 = 0.135 之處,兩箭頭之間的距離。 光點大小定義為:最大照度到 1/e2 光點的輻射距離。光點的大小會隨著 z 增加 而增加,經過一段距離後,光點大小與 z 成線性比,取其漸近線和 z 軸的夾角, 定義為擴散角(divergence angle),如圖 2-3 所示。高斯光束的擴散角為 Θ : 2. Θ λ dw( z ) = =lim 2 π w0 z →∞ dz. (2-9). 圖中假設 z 軸為光軸,則雷射光傳導方向為 z 軸方向,而 w0 為雷射光經共振 腔聚集後的最小光點半徑,位於 z = 0 上,稱為光束腰部(beam waist)。. 圖 2-3 雷射光束直徑及雷射光腔圖. 2-2-2 高解析度雷射光鉗原理 選用 1064 nm 雷射光作為光鉗之光源,主要因為此波長對於生物的影響 性較小,同時於水中的穿透性較好,不會累積能量於高度聚焦的雷射光束附. 32.

(46) 近產生高熱而破壞生物分子。光具有粒子性與波動性之特徵,蒲朗克假設光 波與光子的能量能滿足 E = hv ,能量 E 滿足相對論,故 E = K + moc2 ,因為光子 的靜止質量 m0 為零,故其能量全為動能,而 v 表示光子頻率。康普吞效應證 明光波具有粒子才會有動量 p ,而可將光能量改寫為 E = mc2 = pc. (2-10). 此式中 p = mc ,故可得到 p=. hv h = c λ. (2-11). 這樣的動量會在物體發生碰撞時呈現,又稱之為光壓(radiation pressure)。來自 光源產生的此種壓力對於巨分子而言,並不會造成可量測的影響力,然而對 於微小分子(小於100 μm)而言,則是具有相當大的影響。1970年Ashkin學者發 現聚焦後的雷射光雖然能量只有mW,卻可以捕捉0.59至2.68 μm的乳膠珠。爾 後,將聚焦後可捕捉物體的雷射光束稱之為雷射光鉗(optical tweezers)。而此 原理的描述與物體粒徑大小具有相關性,主要可分為兩種:當粒子大於波長 時(d » λ),則稱為Mie regime ; 當粒子小於波長時(d « λ),稱之為Rayleight regime。 若粒子大小遠大於使用之光波長時,則適用於Mie散射(Mie regime) ,此 時 可 以 做 幾 何 光 學 的 近 似 解 , 故 又 稱 為 射 線 光 學 近 似 狀 況 (Ray optics regime)。假設當粒子折射率為 nb ,而溶液折射率為 ns ,且 nb > ns ( nrel =. 33. nb ),根 ns.

(47) 據Snell's Law ( ns sinθ s = nb sinθb ),當一光束入射打入此粒子時,會發生折射現 象。而入射的動量為Pin,折射θ角度後出來的動量為Pout,之間會產生一個動 量的變化量(ΔP),所產生的力量F =. dP dt. ,如圖2-4所示:. 圖 2-4 光子遇上會折射之物體產生的動量變化量 Mie散射主要所描述情況:假若打入粒子的光束強度不均勻,如圖2-5(a) 中,p1大於p2此瞬間折射角的變化(Δp1、Δp2)亦不相同,因此使得淨力(net force) 會往入射光較強之處移動。假若打入粒子的光束位於軸上,此時因為淨力方 向皆朝向聚焦點,故捕捉的力量會朝向光束聚焦的地方,將推動粒子往上移 動,如圖2-5 (b)及(c) [43]。而本實驗中所使用之乳膠珠為1.5~1.9 μm左右,屬 於此種類型。. 34.

(48) 圖 2-5 Mie 散射原理 物質粒徑大小大於光束聚焦點時,光束打入粒徑之方向將對粒徑造成不同大 小的 trapping force。. 35.

(49) 當為 Rayleight 散射情況時,將粒子看做是一個電介質,會因電場而誘發 產生偶極矩(dipole moment),因而產生一個抓取力(Fg),此力為: Fg =. 式中的E為電場, α = α ( d 3 ,. α 2. ∇ E2. (2-12). nb )為極化率。 ns. 然而除抓取力外,光束還產生一個散射力(scattering force,Fs),此力主要 因為入射光之反射,起因於電場隨時間週期性的變化,這個隨著電場同步感 應的電偶極接著向四周放出散射波。如此的散射改變了入射波的強度及方 向,形成散射力。而此時的電場對於粒子來說是一個定值,此散射力可由下 列公式而得: Fs = nb. Sσ c. (2-13). 其中S = E × H (E為電場,H為磁場)為Poynting vector電磁波對時間的平均值, 而nb為粒子的折射率,σ為粒子對於此光波的散射截面(cross section),c為光 速。散射力必定沿著光行進的方向,並且與該處光強度成正比。因此,粒子 將會因散射的關係而被推往光前進的方向,故對於z軸的光學力來說,散射力 無疑的是破壞其穩定性及對稱性的重要因子,故對於設計光鉗時若要求z軸方 向的穩定性,必須讓抓取力Fg大於散射力Fs。因此,要增大z軸的穩定性,最 好的方法是增大粒子的相對折射率和減小光束腰部半徑。. 36.

(50) 2-2-3 偵測雷射之原理 而在偵測位移之 detection laser 部分,所使用光源為 830 nm 之雷射光,使 用此波長之雷射主要是因為四象限光電二極體(Quadrant photodiode,QPD)對 於此波長較為靈敏。雷射光束經由物鏡通過蓋玻片後,會形成高度聚焦的高 斯光束(Gaussian beam),而與此光束傳遞方向正交之波稱為高斯光束波緣 (wave front)。此時若微流道(chamber)內之乳膠珠於液體中進行布朗運動,當 粒子接觸到高斯光束之波緣,便會形成球形散射波,兩波緣互相干涉即會於 condenser 的 BFP (back focal plane)形成干涉條紋,再藉由 condenser 後方的透 鏡將此干涉條紋成像於 QPD 上。因此當粒子產生位移時,所形成干涉條紋之 亮暗紋將隨之改變,因此可紀錄干涉條紋的位移做為乳膠珠位移量測之方 式,如圖 2-6 所示[43]:. 圖 2-6 偵測乳膠珠與捕捉中心的位移量 將成像於 BFP 的干涉條紋成像於 QPD 上,以記錄位移量。. 37.

(51) 第三章 系統介紹 3-1 系統光路元件與雷射之架設 本實驗中捕獲雷射光(trapping laser)以及偵測雷射(detection laser)之光路 設計如圖3-1所示,其中所使用之各種光學元件及雷射系統詳細規格與廠牌請 參閱第四章實驗材料與儀器設備。圖3-1主要可分為兩道雷射光路,實線所繪 製之光路為trapping laser,使用1064 nm雷射作為光源,雷射光之直徑約為2 mm,置於雷射出口前的二分之一玻片(λ/2 plate)可調整光之偏振態,以確保分 光後的兩道光束強弱一致。而光路中所使用之反射鏡皆為45度反射鏡,使光 束以45度進入,45度反射,藉由調整反射鏡以確保光為直線進行。在接近雷 射光出口進行1:1擴束(L1:L2 = 50:50),主要目的為避免雷射光太快發散, 能夠經由1:1擴束後維持平行光,進入偏振分光器中(PBS)。光束經由偏振分 光器將分為水平偏振態之穿透光及垂直偏振態之反射光。接著經50 mm及250 mm的透鏡進行五倍擴束,希望最後進入物鏡之光鉗大小可達到10 mm,且可 充分利用物鏡N.A.值,將聚焦點聚得更小,以達到較佳的雷射捕獲效果。擴 束後的光束經過兩片150 mm透鏡,最後打在一片45度的雙色分光鏡(dichroic mirror)上,經反射垂直入射進入一數值孔徑(N.A.值)為1.4之60X Plan Apo顯微 物鏡。 為能夠調整光束進入物鏡後方數值孔徑的入射角度,又不影響雷射入 射 於 物 鏡 上 的 位 置 及 強 度 , 因 此 於 系 統 中 加 入 telescope 以 及 共 軛 平 面 (conjugate plane)之概念。 38.

(52) Telescope是利用兩片透鏡所組成,如本系統中L3 (f = 50 mm)及L4 (f = 250 mm),以及等焦距L7及L8 (f = 150 mm)之透鏡等。將L8放置於L7透鏡後方的 兩倍焦距平面上,而顯微物鏡之後方數值孔徑則架設於L8透鏡後的兩倍焦距 平面上。如此,物鏡的back focal plane(BFP)與透鏡L7形成共軛平面。另外, 光路中還另外設計兩組共軛平面,第一組為1064 nm trapping laser中的掃描鏡 (scanner),與透鏡L7;另一組為830 nm detection laser中的第二片反射鏡與透 鏡L7。雷射光束經由telescope 調整入射於顯微物鏡的BFP 的角度,使其垂直 入射顯微物鏡的BFP。 而在圖中的第二道光路以虛線表示,此光路以 830 nm 雷射光作為 detection laser,因雷射光的瓦數過強,故放入 N.D.filter 將能量減弱,接著再 以 50 mm 及 150 mm 之透鏡進行擴束 3 倍。而放置於 1064 nm 及 830 nm 兩道 光路重合處的鏡面須讓 1064 nm 光束反射,830 nm 光束穿透,最後皆可進入 物鏡中。當兩道光束皆進入物鏡後,會再進入 condenser 中,經由 condenser 中的第二片 Dichroic mirror 以 45 度角固定,會將 1064 nm 及 830 nm 雷射光以 90 度反射,而後利用 50 mm 的透鏡將影像成像於 QPD 上。然而系統中作為 detection laser 為 830 nm 的雷射光,同時因光功率過強,因此於 50 mm 透鏡後 架設一片可阻擋 1064 nm 雷射光的濾光片(filter)以及一片 N.D filter,最後僅有 830 nm 雷射光會進入 QPD 內。. 39.

(53) 圖 3-1 系統光路架設圖 黑色實線為 1064 nm 雷射光路圖,藍色虛線為 830 nm 雷射光路圖,其中透鏡 單位為釐米(mm)。. 在 830 nm detection laser 的部分,為能夠使影像成像於 QPD 上,會利用 成像公式計算物體到透鏡與 QPD 的距離: 1 1 1 + = p q f. (3-1). 本實驗中,condenser 的寬度(D)為 30 mm,而 QPD 偵測範圍其寬度(I)為 10 mm,故可假設 D=3I,當透鏡為 50 mm,經由公式 3-1 計算後得物距( p )=200. 40.

(54) mm,像距( q )=66.7 mm,如圖 3-2 所示。. 圖 3-2 利用 QPD 偵測 detection laser 訊號之光路元件架設圖. 實驗中,為降低環境中高頻震動產生的雜訊(noise)影響實驗進行,故將整 套雷射光學系統架於光學防震桌上,所使用之光學防震桌型號為 M-RS2000-46-8,置於光學桌下的震動隔離桌腳(isolator)型號為 I-2000-428 LabLegsTM。I-2000 系列的震動隔離桌腳共振頻率分別為 1Hz (垂直方向)、1.5Hz (水平方向),承載重量為 300-3636kg,可用於高解析度的實驗中。而一般單分 子操作所使用之光學桌型號為 RPR 系列,震動隔離桌腳為 RL-2000 系列。本 實驗使用的光學防震桌抗震程度較優於 RPR 系列,足夠抑制實驗中外界因素 造成的高頻雜訊干擾。. 41.

(55) 3-2 溫控系統介紹 本實驗所使用的加熱系統可分為兩部分:加熱板及溫度控制器,加熱板 是以鎳絲材質纏繞之線圈,外層包覆銅片,埋入厚度 10 mm 的鋁製薄板中, 以 CNC 控制方式將薄板中空加工切除,詳細規格如圖 3-3 所示。圖中位於 condensor 下方即為加熱板放置處,加熱板的中間為載玻片放置處,加熱板內 埋有四組平行擺置的加熱棒,可對玻片兩邊同時加熱傳導,將熱源傳導至玻 片中央,同時於物鏡上方裝置熱電偶(thermocouple),可監控玻片中實際溫度, 校正玻片中心實際溫度與加熱控制器上設定溫度之溫度差。而溫度控制器其 加熱溫度範圍由室溫至 400℃左右,其中內部另設有溫度回饋控制器(feedback control),以每千分之一秒即自動監測溫度變化,並且可自動增益補償。. 圖 3-3 加熱平台之實體圖. 42.

(56) 第四章 實驗設計與方法 4-1 實驗流程圖. Free DNA and DNA-PD153035 complex y Using 1064nm trapping laser Setting different temperature (20~50℃) by temperature control system y Using 830nm detection laser and QPD (Volt v.s. Time) Force - Extension curve y Fitting by inextensible WLC model Low force 1 F. =. 4L p ⎛ x ⎜⎜1 − k B T ⎝ Lc. ⎞ ⎟⎟ ⎠. Determing the contour length (Lc) and persistent length (Lp) Estimating the different temperature which correspond to the binding constant (KA) Calculating the free energy (ΔG) by van’t Hoff function. 43.

(57) 4-2 實驗材料與儀器設備 4-2-1 光學元件 Dscription Laser Light Path. manufacturer. Part Number. 1"Lenses (50mm). New Focus. Model #5621-3072. 2"Lenses (150, 250mm). New Focus. Model #5621-4112. Dichroic mirror 1. Semrock. FF720. Dichroic mirror 2. Chroma. 780dcspxr. Nd:YAG Laser Mirrors. Newport. 10QM20HDM. 15. Gimbal optical mount. Newport. U100-ACG-3K-NL. Polarizer rotation mount. Newport. RM255A. 3-Axis Prism Mount. CVI. 1800. Lens Positioners. Newport. LP-2A-XY. Lens Positioners(3-Axis). New Focus. Model # 9841. Laser Clean-up Filter. Chroma. nc007272. N.D. Filter (O.D.2.0). New Focus. Model # 5242. PBS Cubes. CVI. PBSK-950-1230-100. 4-2-2 實驗材料 ‹ 噬菌體 Lambda DNA,NEB,USA ‹ Streptavidine-polystyrene,KISKER,Germany ‹ PD153035,Merck,Germany ‹ 寡核酸(oligonucleotide),每得科技有限公司,Taiwan. 44.

(58) ‹ T4 連接酶,NEB,USA ‹ YM-30 濃縮過濾離心管,millipore,USA. 4-2-3 儀器設備 ‹ 倒立式顯微鏡,TE2000,Nikon,Japan ‹ 顯微物鏡(N.A.=1.4,60X),Plan Apo,Nikon,Japan ‹ 電荷耦合元件(CCD),XC_ST70,SONY,Japan ‹ 訊號放大器,悅樺工程有限公司,Taiwan ‹ 四象限光電二極體(QPD),悅樺工程有限公司,Taiwan ‹ 加熱控制系統,悅樺工程有限公司,Taiwan ‹ 光源功率檢測儀(optical power meter),1916-C,Newport,USA ‹ 光學桌,M-RS2000-46-8,Newport,USA ‹ 光學板,9510-DF2-M,New Focus,USA ‹ 1064nm 雷射,VA-II-N-1064,榜首科技有限公司,China ‹ 830nm 雷射,ODM-SA09-08,震凱科技股份有限公司,Taiwan ‹ IR Viewer,350–1300 nm Range,Newport,USA. 45.

(59) 4-3 實驗方法 4-3-1 DNA 分子之黏合與稀釋保存 (I) λ-DNA 原液稀釋: 實驗中所使用之 DNA 為 Lambda DNA (λ-DNA),每次取 100 λ (500 μg/ml) 原液 DNA,分別加入 0.5 M EDTA、5 M NaCl、1 M Tris (pH 7.5)各 14.3 λ,將 DNA 稀釋配製成濃度 350 μg/ml,總體積為 143 λ。 (II) λ-DNA 與寡核酸(oligos)黏合: 從步驟(I)中取出 40 μl 稀釋後 DNA 加入 168 λ TE 緩衝液,經過 65℃乾浴 槽加熱 30 分鐘,使得 λ-DNA 的環形結構打開。接著分別加入如圖 4-1 兩種寡 核甘酸(oligo)序列各 4 μl Bio-oligo-1、2 及 4.5 μl 10X 黏合緩衝液(100 mM HEPES, pH 7.5, 1 M NaCl, 10 mM EDTA)並冷卻 60 分鐘。為移除未接上 DNA 之 oligos,置入 YM-30 過濾離心管中,於 4℃下以 10000 rpm 離心 30 分鐘兩 次,接上 oligos 之 DNA 將附著於過濾膜上,因此須將過濾膜倒置以 7000 rpm, 30 分鐘再次離心,最後約可得到 105 μl 接上 oligos 的 λ-DNA。. 圖 4-1 寡核甘酸與 Lambda DNA 黏合配置圖. 46.

(60) (III)以 T4 連接酶(ligase)接合: 因為 DNA 與外接 oligos 之間(5’- 3’)會有缺口(nick),藉由 T4 ligase 來幫 助 5’- P 與 3’- OH 進行接合。取步驟(II)中 105 μl λ-DNA 加入 12 μl 10X T4 ligase 緩衝液及 1 μl T4 ligase,放置於 4℃下約 7 小時。為移除 T4 ligase 緩衝液中的 氯化鎂,加入 8 μl 0.5 M EDTA 以及 372 μl (30 mM HEPES, 5 mM EDTA, pH 7.5) 緩衝液,置入 YM-30 過濾離心管中,以離心機 10000 rpm,4℃下離心 30 分 鐘二次,再將過濾膜倒置,加入 88 μl (30 mM HEPES, 5 mM EDTA, pH 7.5)緩 衝液,以 7000 rpm、4℃下離心 30 分鐘,取得的離心液即為 DNA 溶液。 (IV)儲存 λ-DNA/oligo 樣品溶液: 將步驟(III)中最後得到的 88 λ λ-DNA/oligo 溶液儲存於 0.5 M NaCl,10 mM EDTA 溶液中,並置放在 4℃。. 4-3-2 玻片微流道之製作 本實驗中,自製玻片上之微流道(chamber)裝載樣品,如圖 4-2,首先於 載玻片(slide)上貼上雙面膠兩條,中間相隔寬度約為 5 mm,此空間即為承裝 樣品的區域,再將蓋玻片(cover glass)蓋上,以 pipetman 吸取樣品約 7.5λ置入 雙面膠之間所預留的空間,過程中要注意避免產生氣泡,接著再以真空膠將 兩端密封。. 47.

參考文獻

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