第 3 章 試驗研究
3.2 紅色螢光蛋白轉基因豬脂肪幹細胞誘導分化為類肝臟細胞之研究
3.2.1 前言
先前研究指出，幹細胞具有轉分化為其他胚層細胞之能力，研究團隊使用骨 髓間葉幹細胞為材料，於體外誘導其轉分化為類肝臟細胞 (Lee et al., 2004)，而跨 胚層之轉分化能力為複能性幹細胞 (multipotent stem cells) 特性之一。Hepatocyte Growth Factor (HGF) 為肝臟細胞生長因子，在 Schmidt 等人所發表的文獻中提及 其對肝臟細胞生長之重要性 (Schmidt et al., 1995)，其可透過受體 C-met 之交互作 用使得多種細胞開始進行有絲分裂及分化，許多將幹細胞轉分化為肝臟細胞的研 究皆添加此一生長因子。Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) 及 Fibroblast Growth Factor 4 (FGF4) 為第二型及第四型纖維母細胞生長因子，其於胚胎時期之肝臟發 育中扮演相當重要之角色 (Ruhnke et al., 2003)，在先前研究亦加入此兩種生長因 子以促進幹細胞分化成為肝臟細胞 (Schwartz et al., 2002)。因此本試驗擬將 HGF、
FGF2 以及 FGF4 此三種生長因子添加於培養液中，以測試試驗一所分離及純化之 脂肪來源幹細胞是否具有跨胚層轉分化為類肝臟細胞之潛能，希望藉此進一步證 明其跨胚層分化為肝臟細胞之潛能，做為後續肝纖維化小鼠幹細胞治療試驗之參 考依據。
3.2.2 材料與方法
FGF2 (prospec. CYT-085)、50 ng/ml 之 FGF4 (prospec. CYT-312)以及 100 ng/ml 之 HGF (peprotech 100-31)。3.2.2.4 細胞免疫螢光染色
(1)將一級抗體 (rabbit anti porcine HNF-1, Santa Cruz, sc-8986) 加入含有 1%
BSA 及 0.25% Triton-X 100 之 PBS 中，標記為 1st ready solution，一級抗體之 稀釋倍率為 200 倍。
(2)將二級抗體 (Alexa Flour 488, Goat anti rabbit IgG, Invitrogen, A11008) 與 DAPI 加入 PBS 中，標記為 2nd ready solution，二級抗體之稀釋倍率為 200 倍，DAPI 之稀釋倍率為 6000 倍。
(3)將細胞置入 PCR tube 中，以 4% paraformadehyde 固定十分鐘，以 PBS 潤洗。
(4)加入 1st ready solution，靜置 4℃，避光，overnight。
(5)以 PBS 潤洗一次，加入 2nd ready solution，靜置 4℃，避光，overnight。
(7)PBS 潤洗一次，以 25μl 之 PBS 懸浮細胞，並至於載玻片上，以蓋玻片及指 甲油封片，即可以光學顯微鏡觀察之。
3.2.3 結果與討論
3.2.3.1 紅螢光蛋白質轉基因豬脂肪幹細胞於體外誘導分化為類肝 臟細胞期間其形態學上之評估
本試驗使用紅螢光蛋白轉基因豬脂肪幹細胞，以體外培養之方式，於培養 液中添加肝細胞生長因子 (hepatocyte growth factor, HGF)，第二型纖維母細胞生 長因子 (fibroblast growth factor II, FGF-2) 以及第四型纖維母細胞生長因子 stem cells, BMMSC)、臍帶血幹細胞 (umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, UCB-MSCs) 以 及 人 類 脂 肪 幹 細 胞 (human adipose-derived mesenchymal stem cells, hAD-MSCs)，可在適當環境下誘導分化為類肝臟細胞 (Banas et al., 2007; Hong et al., 2005; Schwartz et al., 2002)，並可表現肝臟細胞特 有之蛋白質，及具有攝取低密度脂蛋白 (low-desity lipoprotein, LDL)，尿素分泌 等類似肝臟細胞之功能，其體外誘導分化過程中細胞型態之轉變與本試驗相似，
除 外 觀轉 變為 類似 肝臟 細 胞之 卵圓 形外 ，細 胞 間發 展出 類似 膽小 管 (bile canaliculi) 之結構也被認為是轉分化為類肝臟細胞之象徵，但其是否有相似於肝 臟細胞之功能，則需檢測其是否表現肝臟特異性表現之蛋白質，以獲得進一步 之結果。
圖 4. 體外誘導 AD-MSCs 分化成為類肝臟細胞期間之形態變化。
於誘導分化第三天後，細胞開始發生聚集，第六天已有部分細胞出現類似肝臟細 胞之外觀，第九天此種外觀之細胞增加，至第 12 天大部分細胞皆呈現類似肝臟細 胞之外觀。(比例尺為一百微米)
Figure 4. Morphologic changes of AD-MSCs trans-differentiated into hepatocytes like cells in vitro.
Cells were clustered after 3 days trans-differentiated, part of cells showed hepatocytes like morphology in day 6 and increased during the experiment, after 12 days trans-differentiation, most of AD-MSCs showed hepatocytes like morphology. (scale bar = 100 μm)
3.2.3.2 紅螢光蛋白質轉基因豬脂肪幹細胞經體外誘導分化為類肝 臟細胞後其肝臟細胞特異性蛋白質之表現
紅螢光蛋白轉基因豬脂肪幹細胞經過 12 天體外誘導分化後，為了解其是否表 現肝臟細胞特定表現之蛋白質，以細胞免疫螢光染色之方式，標記第一型肝細胞 核因子 (hepatocyte nuclear factor I, HNF-1) 之表現，其為肝臟細胞生長時所表現之 特異性蛋白質。試驗結果顯示，經過 12 天誘導分化後，多數細胞皆表現 HNF-1 蛋白質 (圖 5C)，此外，DsRed 轉基因所表現之紅色螢光蛋白質在大多數已分化之 細胞中依然穩定表現 (圖 5B)。
先前研究顯示，肝細胞成熟過程中，需 HNF 之參與以維持 hepatic sinusoidal architecture，此外，HNF 之表現也促使肝細胞外 adhesion molecules 透過 cell-cell interaction 形成肝細胞間獨特的 junction，以維持 sinusoidal capillaries 之結構 (Parviz et al., 2003)，因此許多文獻中將其視為細胞轉分化為類肝臟細胞之標記。本試驗結 果除證明試驗一所分離及純化出之紅螢光蛋白轉基因豬脂肪幹細胞，具有跨胚層 分化為類肝臟細胞之潛能外，其紅色螢光蛋白質之穩定表現，也可提供後續試驗 作為標定細胞位置以及追蹤細胞命運之用途。
圖 5. AD-MSCs 經過 12 天體外誘導分化後表現 HNF-1 蛋白質。
經過 12 天體外誘導分化後，以細胞免疫螢光染色之方式，偵測到其表現肝臟細胞 特異性表現之 HNF-1 蛋白質。(A) 為 DAPI 所標示出之細胞核位置，(B) 為紅螢光 蛋白質 DsRed 之表現，(C) 為經由綠色螢光二級抗體標記之肝臟特異性蛋白質 HNF-1 之表現，(D) 為以上三者之疊圖。結果顯示許多細胞同時表現 DsRed 以及 HNF-1 兩種蛋白質。(比例尺為五十微米)
Figure 5. AD-MSCs expressed HNF-1 protein after 12 days trans-differetiation.
Expression of hepatocyte specific protein HNF-1 in inducted AD-MSCs detected by immunocytochemistry after 12 days culture. (A) DAPI, (B) red flourecent protein DsRed expression, (C) HNF-1 protein expression detected by Alexa Flour 488 secondary antibody, (D)merge. The results shown most of cells express both DsRed and HNF-1 protein. (scale bar = 50μm)