第三章 材料與方法
三、 細胞培養
前脂肪細胞株3T3-L1 購自食品工業發展研究所菌種中心/國家衛生研究院
細胞庫，菌種中心編號BCRC 60159，細胞株來源 ATCC CL-173，組織來源﹕
Mouse embryo 2、 培養基組成與配製
先將Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM；Gibco)粉末溶解，加入 1.5 g sodium bicarbonate ( sigma) ，再以 1N HCl 調整 pH 值為 7.1-7.2 之間，定 量1L 後以過濾膜 (0.22μm) 過濾。medium 為配好的 DMEM 再加入 10％ Bovine serum (BS) (Gibco) 、 2 ％ L-glutamine (Biological industries) 及 1x antibiotic-antimycotic (內含 penicillin G sodium、streptomycin sulfate、amphotericin B；Gibco)，此為 maintain medium (10％BS-DMEM)。
3、 細胞繼代培養
細胞解凍後以4×105cells 接種於 75T flasks，並加入 20% BS-DMEM，待隔 日細胞完全趴附後去除舊的medium，加入新的 10% BS-DMEM，於 37℃、5％
CO2下培養，每3-4 天進行繼代培養。
繼代培養時為待細胞約長滿 (約 90 ％ confluence)，移去培養基以 1X PBS 清洗細胞二次後，加入1mL trypsin-EDTA 潤濕所有細胞後，放入 37℃、5％ CO2
下作用約8-10 分鐘後取出，加入 10％ BS-DMEM 9mL 中和反應並使細胞脫落 後，經由trypan blue solution 染色，以細胞計數盤在倒立式顯微鏡下計數細胞數 後，再將細胞種入新的75T flask。解凍後細胞均進行繼代培養 2 代後才進行實 驗，實驗使用的繼代數均控制於p=U+8+11 至 p=U+8+13。
第三章 材料與方法
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四、誘導3T3-L1 脂肪細胞分化
根據許多文獻資料，以3T3-L1 前脂肪細胞株建立脂肪細胞分化流程
1、 藥品配製：
(1) 0.25 mM Dexamethasone (DEX) ：1000x stock
藥品 需要量 conc.
(2) 0.5 M 3-isobutyl-1-methyl-xanthine (MIX)：1000x stock
藥品 需要量 Stock conc. Working conc.
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Differentiation medium Ⅰ(DM Ⅰ)：10 % BS-DMEM 含 0.25μM DEX、0.5mM MIX、10μg/mL Insulin 及 0.1μg/mL Biotin Differentiation medium Ⅱ(DM Ⅱ)：10 % BS-DMEM 含 10μg/mL Insulin、0.1
μg/mL Biotin
3、 方法﹕
誘導分化的實驗，首先將細胞以2×105 cells/well 接種於 12-well plate 之後，待 細胞長滿後再培養 2 天，就把 maintain medium 換成 DM Ⅰ( 內含 DEX、MIX、
insulin、biotin )，培養 3 天去除舊的 medium 再換成 DM Ⅱ(內含 insulin、biotin)每 2 天更換medium 至第 7 天。
而terminal differentiation 實驗，則是將細胞接種於實驗所需的 plate 之後，待細 胞長滿後再培養2 天，就把 maintain medium 換成 DM Ⅰ(內含 DEX、MIX、insulin、
biotin ) 額外加入 100μM linoleic acid，培養 3 天去除舊的 medium 再換成 DM Ⅱ (內 含insulin、biotin)，此時仍然添加 linoleic acid 至第 7 天誘導細胞形成成熟脂肪細胞。
第三章 材料與方法
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五、各種測試物之處理 1、測試物種類
(1) 脂肪酸測試物：
Oleic acid Cayman
Linoleic acid Cayman
α-linolenic acid Sigma
Palmitic acid Cayman
Stearic acid Sigma
c9,t11,t13 conjuated linolenic acid (CLN) Cayman
Phytanic acid (PA) Cayman
脂肪酸測試物以絶對酒精配製成100mM 之 stock solution 進行實驗，實 驗組劑量為10μM、50μM、100μM、200μM，vehicle control 為絶對 酒精，劑量為0.01％、0.05％、0.1％、0.2％
(2) 天然抗氧化物類測試物：
Epigallocatechin gallate Cayman
Curcumin Cayman
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天然抗氧物測試物以DMSO 配製成 100mM 之 stock solution 進行實驗，
實驗組劑量為10μM、50μM、100μM，vehicle control 為 DMSO，劑 量為0.01％、0.05％、0.1％
2、前脂肪細胞增生實驗之測試物處理流程
圖 3-1 前脂肪細胞增生實驗流程
Fig 3-1 stage of preadipocyte proliferation
maintain medium
測試物cell seeding
after 24hr
24hr
48hr
加入測試物48 小時之實驗，如 48hr MTT assay
LDH assay Apoptosis assay
加入測試物24 小時之實驗，如 24hr MTT assay
第三章 材料與方法
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3、differentiation 實驗之測試物處理流程
4、terminal differentiation (mature adipocyte) 實驗之測試物處理流程 圖 3-2 分化實驗流程
Fig 3-2 stage of differentiation cell seeding
confluence (Day -2)
post-confluence 2d (Day 0)
Day 3 Day 5 Day 7
Fig 3-3 stage of terminal differentiation
DM Ⅰ
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六、 MTT 染色法細胞存活率測定 1、 原理：
MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-y1]-2,5-diphenylterazolium bromide)是種活細 胞染色法，活細胞粒線體內的dehydrogenase 會將 MTT 之 tetrazolium ring 打斷 形成formazan，此時 MTT 由黃色轉變藍色，再用 acid isopropanol 將 formazan 溶出，測定540nm 吸光值，判定細胞存活數。
2、 藥品配製：
(1) MTT stock solution (5 mg / mL)
藥品 需要量
MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide)
(USB 19265)
5mg
滅菌1xPBS 1mL
將 MTT 粉末溶於滅菌的 1x PBS 中，再以 0.2 μm filter 過濾。分裝於 eppendorf 中，貯存在-20℃
(2) Acidic isopropanol (0.04 N HCl in isopropanol)
藥品 需要量
第三章 材料與方法
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MTT stock solution 5 μL / well
3、 方法：
在96 well micro-plate 接種細胞 (1×104 cells / well)，待細胞趴附後加入脂肪 酸標準品或多酚類標準品及其對應的vehicle control，濃度為 10、50、100、200 μM，培養 24 及 48 小時後進行 MTT 測定。測定當日吸除舊的 medium 後，以 滅菌1xPBS wash 後吸除，再加入 MTT solution 55μL / well 放入培養箱 37℃反 應3 小時後，再加入 acidic isopropanol (0.04 N HCl in isopropanol) 100μL / well，
震盪20 分鐘使染劑溶出後，以 ELISA 測定 540nm 吸光值。
4、 計算：
Cell viability (％) = (test sample / vehicle control) ×100%
七、 LDH 細胞毒性之測定
1、 原理：
Lactate dehydragenase(LDH)是一種穩定存在於各種細胞的酵素，所以若細 胞受到傷害時，細胞膜破裂之後則LDH 會釋放到 medium 中，測定 medium 中 的LDH 以表示 cytotxicity 程度。
2、 藥品配製：
使用市售套組BioVision LDH- Cytotoxicity assay kit Ⅱ Cat.K313-500 3、 方法：
將細胞以1×104cell/well 種於 96well-microplate24 小時待細胞全部趴附後，
換成各種不同實驗濃度 (10μM、50μM、100μM、200μM) 的各種測試物 100 μL/well 培養 48 小時，溫和 shake 後離心 600xg 10min，將 medium 取到
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eppendorf，再從 eppendorf 取出 sample 10μL，並加入 100μL LDH reaction mix 後，室溫反應30min 測 450nm 吸光。
4、 計算
( Test sample - Low control) Cytotoxicity(%) ＝
( High control – Low control) ×100 Hignt conrol：不以測試物處理之細胞，再以 lysis solution 處理之吸光值 Low control:不以測試物處理之細胞之吸光值
採用市售試劑組 (RANDOX, Amtrim, UK)，將 Buffer 1 (含 pipes buffer pH7.6, 4-chlorophenol, magnesium-ions) 與 Enzyme regent 2 ( 含 4-aminophenazone, ATP, lipase, glycrol-kinase, glycerol-3phosphate oxidase, peroxiase)混合，配成反應試劑備用。
3、 方法：
吸除舊的medium 後，緩緩加入 1mL 之 1x PBS 潤濕整個培養皿後吸除，
重複二次，再以細胞刮勺將細胞刮下，加入適量1xPBS 將細胞沖下，細胞液收
集至1mL eppendorf 中，以 100xg 離心 5 分鐘，小心去除上清液，加入 0.5mL
第三章 材料與方法
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二次水打散pellet 後，以 sonicater 打破細胞，儲存於-20℃。
取4μL Sample 或 triglycerides standard 於 96 well micro-plate 中，加入 200 μL 上述反應試劑，於室溫反應 10 分鐘，測 500nm 之吸光值。另做 Blank 及 triglycerides standard 作為對照，根據下列公式計算細胞內三酸甘油酯含量。
4、 計算
Triglycerides (mg/mL) = (Asample - Ablank / Astandard - Ablank) × 2 (mg/mL)
九、 細胞內G3PDH 活性測定
1、 原理：
參考Kozak & Jensen(1974)之方法。細胞質中的 G3PDH 為三酸甘油酯合成之指 標酵素，催化反應如下：
DHAP + NADH G3PDH glycerol-3-phasphate + NAD+ 2、 藥品配製：
(1) Extraction buffer
藥品 需要量 最終濃度
Tris-HCl (Merck) 7.88g 50mM
EDTA (BDH) 0.292g 1mM
β-mercaptoethanol (Merck) 70μL 1mM
Triton X-100 (Merck) 5mL 0.5％
將Tris–HCl 和 EDTA 溶於 800 mL 二次水中，再加入 β-mercaptoethanol 和Triton X-100。調整 pH 值至 7.5，再以二次水定量至 1L，儲存於 4℃
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(2) 前 Reaction buffer
藥品 需要量 最終濃度
Triethanolamine/HCl (Merck) 18.56g 100mM
EDTA (BDH) 0.7305g 2.5mM
β-mercaptoethanol (Merck) 7μL 0.1mM 將上述藥品溶於800 mL 的二次水中，調整 pH 值至 7.5，再以二次水定 量至1L，儲存於 4℃
(3) 反應受質
NADH stock：1000x stock
藥品 需要量 最終濃度
β-nicotinamide adenine dinucleotide reduced
(MP Biomedicals) 0.08513g 120mM
將NADH powder 溶於 1 mL 的二次水中（微黃色），分裝（100 μL / tube）， 儲存於-20℃
DHAP stock：1000x stock
藥品 需要量 最終濃度
dihydroxyacetone phosphate (Sigma D-7137) 0.017g 200mM 將DHAP powder 溶於 0.5 mL 的二次水中（無色透明），分裝（100 μL / tube），儲存於-20℃
(4) Reaction buffer
藥品 需要量
第三章 材料與方法
再以25000xg、4℃離心 1 小時(Hitach CR21, rotor R21 A-39)，取出上清液至另 一個eppendorf，混勻後分裝凍於-80℃。
取適量sample 加入 1mL Reaction buffer 於 cuvette 中，上下搖晃均勻後放入 分光光度計(U-2000 spectrophotometer, Hitachi)，1mL reaction buffer 為空白組，
測 340nm 吸光值，每個 sample 進行 5 分鐘，以下列公式計算下降速率，並以
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1、 原理
biuret 法的延伸，當銅離子與胜鏈形成複合物後，可再與 Folin-Ciocalteau 試劑的 phosphomolybdic-phosphotungstate 作用產生藍色物質。
2、 藥品配製
(1) Reagent A (0.5％ CuSO4‧5H2O in 1％ Na3-citrate 2H‧ 2O)
藥品 需要量 最終濃度
CuSO4‧5H2O (聯工) 0.5g 0.02M
Na3-citrate 2H‧ 2O (USB) 1.14g 0.04M 將0.5 g CuSO4‧5H2O 溶於 80 mL 二次水，再加入 1.14 g 的
Na3-citrate 2H‧ 2O(Na3C6H5O7‧2H2O)，最後以二次水定量至 100 mL
(2) Reagent B (2％ Na2CO3 in0.1N NaOH)
藥品 需要量 最終濃度
Na2CO3 (聯工) 20g 0.2M
NaOH (Katayama chemical) 4g 0.1N
將20 g Na2CO3溶於800 mL 二次水中，再加入 4 g NaOH，最後以二次水 定量至1L
(3) Reagent C (Reagent A: Reagent B=1:50) 取1 mL Reagent A 加 50 mL Reagent B
(4) Reagent D (需避光) (Folin & Ciocalteu’s phenol reagent : 二次水 = 1:1
藥品 需要量
Folin & Ciocalteu’s phenol reagent 10mL
第三章 材料與方法
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二次水 10mL
取10 mL Folin & Ciocalteu’s phenol reagent 加 10 mL 二次水 Reagent C 和 Reagent D 每次依照使用量當日新鮮配置 入96 well-microplate，加入 150μL reagent C 後於 microplate mixture vortex 上混 勻反應15 分鐘，再加入 20μL Reagent D 於 microplate mixture vortex 上混勻反 應30 分鐘。以 ELISA reader (μQuant)測 660nm 吸光值。再以標準曲線公式換
2H2O2 + 4-aminophenazone + 3,5-dichloro-2-hydroxybenzene sulphonic acid POD n-(4-antipyryl)-3-chloro-5sulphonate-p-benzoquinoneimine
以測定甘油的釋出作為指標，根據原理測定quinoneimine 在 520nm 吸光值 2、 藥品配製：
採用市售試劑組 (RANDOX, Amtrim, UK)，將 Buffer 1 (含 pipes buffer pH7.6, 3,5-dichloro-2-hydroxybenzene sulphonic acid， magnesium-ions) 15mL 與 Enzyme regent 2 (含 4-aminophenazone, ATP, glycrol-kinase, glycerol-3-phosphate
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oxidase, peroxiase， ascorbic acid oxidase)混合，配成反應試劑備用。
3、 方法：
吸起舊的medium 收集至 15mL 離心管中，以 1000xg 離心 5 分鐘，吸起上 清液到另一個離心管，混勻後取出 1mL medium 至 eppendorf，再從 eppendorf 取出100μL medium 至另一個 eppendorf 中，以 70℃加熱 10 分鐘後冰浴，100xg 離心30 秒，離心後取上清液，儲存於-20℃或進行實驗。
取40μL sample 或 glycerol standard 於 96 well micro-plate 中，加入 200μL 上述反應試劑，於室溫反應10 分鐘，測 500nm 之吸光值。另做 blank 及 glycerol
油紅染劑是取212 mg Oil-Red O 加入 60 mL isopropanol，蓋上蓋子，stir at 4℃ overnight，以 Whatman 3MM paper 過濾。過濾後 Oil-Red O solution : dd water = 3 : 2 混勻後， 放於 4℃ overnight ，最後再以 Whatman 3MM paper 過 濾，貯存於4℃。
10% formalin/PBS 是取 27.03 mL 37% formaldehyde solution + 72.97 mL PBS
3、 方法：
第三章 材料與方法
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吸除medium，用 PBS（-）5mL 洗細胞兩次後加入 2 mL 10% formalin/PBS(-) 固定細胞1 hr，再以 5mL dd-water 洗 3 次，加入 1.5 mL 油紅染劑（蓋過細胞 層即可）染10 min，吸除染劑，以 5mL dd-water 洗數次，室溫倒扣晾乾即可照 相。
十三、細胞凋亡測定
1、 原理：
Formamide 是種溫和的 denaturing reagent，它只會對 apoptotic cells 的 DNA 變性，對DNA 斷裂的細胞的 necrotic cell 或非 apoptosis cell 都不會作用。所以 本實驗是利用formamide 將 apoptotic cell 的 DNA 變性之後，再以單株抗體(標 有過氧化酶的二抗)結合上已變性的 DNA(ssDNA)再偵測其吸光。
2、 藥品配製：
使用市售套組BIOMOL, AK-120；ApoStrandTM ELISA Apoptosis Detection Kit
3、 方法：
由於實驗分成proliferation、differentiation 及 mature adipocyte 三個階段，
所以將細胞種於96 well microplate 並依照三階段的流程，以測試物處理後，離 心200xg 5min 後去除 medium，加入 200μL Fixative 反應 30min 固定細胞，離 心200xg 5min 去除固定液後於 56℃ oven 20min，再加入 50μL formamide 反應 10min，放入 56℃ oven 30min 後，冷藏 5min，去除 formamide 加入 200μL blocking solution 反應 1 小時，去除 solution 加入抗體反應 30min，以 wash buffer 清洗後加入peroxidase substate 後反應 60min 測 405nm 吸光。
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十四、統計分析
實驗結果均以平均值 ± 標準差 (Mean ± SD) 表示。數據之統計均須確定 為常態分布，否則轉型為對數值 (Log)。數據以單向變方分析 ( One way ANOVA ) 檢定組間差異之顯著性，再以 Duncan’s multiple range test 及 Dunnet’s test 檢定，統計比較以 p＜0.05 為具有顯著之差異。統計分析係以 SAS 軟體(SAS 8.2, Cary, NC, USA)分析。
第四章 結果
(absolute ethanol)與 DMSO 對 3T3-L1 分化的影響，同樣以細胞內 TG 堆積作為指標，
發現二種溶劑添加量至0.2％均與 blank 組沒有差異。
2、 一般脂肪酸對 3T3-L1 脂肪細胞分化的影響
圖4-2 為以細胞內 TG 堆積為指標測定 common fatty acid 對 3T3-L1 脂肪細胞分 化的影響。使用common fatty acid 包括有 SFA (saturated fatty acid)- palmitic acid、
stearic acid，MUFA (monounsaturated fatty acid)-oleic acid，PUFA (polyunsaturated fatty acid) - linoleic acid、linolenic acid，以 vehicle control 分化程度作為 100％，發現 5 種 脂肪酸都會促進脂肪細胞分化，並且從10-200μM 呈現良好 dose-response，而促進 脂肪酸分化程度分別是 SFA 最低其次是 MUFA，促分化程度最好的是 PUFA (p＜
0.05)。
3、 特殊脂肪酸對 3T3-L1 脂肪細胞分化的影響
由於前述實驗發現脂肪酸均會促進脂肪細胞分化，因此在測試特殊脂肪酸 c9,t11,t13 conjugated linolenic fatty acid (α-eleostearic acid ； c9,t11,t13-CLN) 和 phytanic acid (PA) 對 3T3-L1 adipogenesis 影響時，決定選用同為 18 碳 3 個雙鍵的一 般脂肪酸 α-linolenic acid 及 16 碳飽和的一般脂肪酸 palmitic acid，分別作為
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c9,t11,t13-CLN 及 PA 之對照，探討二種特殊脂肪酸對 3T3-L1 前脂肪細胞增生、分 化及成熟脂肪細胞脂質代謝之影響。
(1) Uncommon fatty acids 對 3T3-L1 differentiation 之影響
圖4-3 為以 TG 堆積為指標，測試 uncommon fatty acids 對 3T3-L1 分化 的影響。vehicle control 作為 100％，SFA-C16:0 與 PUFA- C18:3 比較，發現
圖4-3 為以 TG 堆積為指標，測試 uncommon fatty acids 對 3T3-L1 分化 的影響。vehicle control 作為 100％，SFA-C16:0 與 PUFA- C18:3 比較，發現