第二章 文獻回顧
2、 PPARγ與脂肪細胞分化
Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) 屬固醇類荷爾蒙核受器家族 (steroid hormone nuclear receptor family) 為一種轉錄因子，當與專一性 ligand 結合可
誘發下游基因的轉錄反應，而早期 PPAR 被選殖出來時，發現可被各種過氧化體增
生劑 (peroxisome proliferators;PP) 活化，而 PP 主要以各種 fibrates 類降血脂藥為主，
如clofibrate、ciprofibrate 等，Issemann 等學者於 1990 年發現 arachidonic acid 可活 化mPPAR，並誘發 PPAR 調節之基因轉錄，推測 eicosanoids 在 PPAR 傳訊中扮演重 要角色(9)，Gottlicher 等學者也發現 C18:0、C18:1、C18:2、C18:3 等脂肪酸可活化 chimeric receptor 上的 rPPAR(10)，直到 Lehamann 證實治療糠尿病藥物 TZDs 可與 mPPARγ結合，PPAR 才首次被認為是 ligand-activated transcription factor(11)，而 PPAR 具有三種 isoform 分別是 PPARα、PPARβ和 PPARγ，其中 PPARγ專一表 現在脂肪組織，可受脂肪酸或藥物調控而影響脂質與葡萄糖代謝、脂肪細胞分化相 關基因表現，說明如圖2-3 (12)。
圖
2-3 PPARγ之活化與作用 (11)
Fig 2-3 The activation of PPARγ and its action effect
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PPARγ最早是在哺乳動物中被發現(13)；Spiegelman 學者與其研究團隊也在脂
肪細胞中發現脂肪細胞專一性之PPARγ，並且發現 PPARγ會大量表現在脂肪組織
中且會於脂肪細胞生合成期間被誘導(14, 15)；Tontonoz 等學者將纖維母細胞利用 Retrovirus 異位表現 PPARγ的 gain-of-function 方式，首次指出 PPARγ在脂肪細胞 生合成中扮演重要角色(16)。1999 年 Barak 及 Kubota 等學者利用基因剔除胚胎 PPAR
γ的小鼠的模式，發現小鼠於胚胎 10-10.5 天期間由於胎盤不正常而導致胎死腹中
(17, 18)。為了解決 PPARγ-/- embryo 無法存活的問題，Rosen 等學者利用 wild-type ES cells 與完全剔除 PPARγ之 ES cells 製造出 chimeric mice (19)；Barak 等學者利用正 常的tetraploid cells 校正胎盤之缺失製造 chimeric embryo，解剖後發現沒有棕色或白 色脂肪組織(17)，二個學者成功製造缺乏 PPARγ小鼠，並證明 PPARγ在脂肪組織 形成之重要性。
之後He 等學者利用 cre-loxp 技術產生 PPARγ的 knockout mice，其皮下和副睪 脂肪塊、血漿 leptin 和 adiponectin 會減少、血漿游離脂肪酸與三酸甘油酯會增加 (20)；Zhang 等人選擇性破壞 PPARγ2發現會使小鼠腹膜後、腹股溝以及生殖器周 邊脂肪減少(21)。
PPARγ被認為是決定脂肪細胞分化重要因子，證據還包括 Lehmann 等學者發 現高度專一性PPARγ ligand-抗糖尿病藥物 thiazolidinediones (TZDs)，可以促進脂 肪細胞分化(11)，另一 PPARγ之 ligand-BRL49653 也證實可促進鼠胚纖維母細胞 C3H10T1/2 分化為脂肪細胞(22)。
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二、 3T3-L1 介紹
近來前脂肪細胞株如3T3-L1、3T3F442A(23)、Ob1771(24)以及初代培養前脂肪 細胞 (stromal-vascular cell；SV cell) 為研究脂肪細胞分化常用之體外模式，3T3-L1 及3T3F442A 都來自於 Swiss 3T3 cell，而 Swiss 3T3 cell 是由 Green 等學者由小鼠胚 胎纖維母細胞 (fibroblasts) cloning 出來具有高度分化為成熟脂肪細胞潛力的前脂肪
dexamethasone (DEX) 屬於 glucocorticoids，Rubin 等學者利用 DEX 及 MIX (methylisobutylxanthine)作為 3T3-L1 cells 分化的 differentiation cocktail 成分(26)，
DEX 可透過促使 C/EBPβ和 C/EBPδ形成 heterodimers，來活化 PPARγ表現(8, 27)；另外在 PPARγ和 C/EBPα transfection 研究也發現 DEX 可誘導 preadipocyte 分化為adipocyte(28)。
2、methylisobutylxanthine (MIX)
MIX 和 DEX 一樣都會促進脂肪細胞的分化作用，它是透過增加 C/EBPβ表現，
抑制phosphodiesterase 及競爭抑制 A1 adenosine receptor，也透過阻斷 inhibitory regulatory protein G1 來刺激 adenyl cyclase 活性，表示 MIX 可透過增加 cAMP 來促 進分化(7)。
3、insulin
insulin 以促進 deoxylglucose uptake，並將 glucose 轉換成 CO2及lipid，另外由 於p38 mitogen activated protein kinase (MAPK) 可以促進 preadipocyte 自發性分化作
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用(29)，加上 insulin 可以刺激 p38 MAPK 活性(30)，所以可以促進分化；而在分化 後的第三或第四天起insulin binding 活性會增加到 6-10 倍(26)。
4、biotin
為脂肪酸合成過程中之關鍵酵素ACC (acetyl-CoA carboxylase) 的 cofactor，故 添加biotin 可促進脂肪酸合成，促進分化作用。
三、 食物成分與脂肪細胞生合成相關研究
(一) 脂肪酸類
1、 一般脂肪酸 (Common fatty acid)
Medium-chain triglycerides (MCT) 餵食動物會降低脂肪細胞數目及大 小，因為 MCFA 可增加粒線體β-oxidation。另外給予大鼠 MCTs 會降低 大鼠脂肪塊、向下調節 PPARγ、C/EBPα及其下游基因，改善 insulin 敏 感性及葡萄糖耐受性，類似的結果在以MCFA 處理的 SV cell 中也發現，
與control 組 long-chain fatty acid (LCFA) 比較，MCFA 會降低 PPARγ和 C/EBPα， 在 3T3-L1 脂肪細胞上也可發現， C10:0 和 C18:1 比較，其促 分化效果較差，且會抑制3T3-L1 分化及成熟脂肪細胞的 lipogenesis(31)。
同樣是SFA 的 C8:0 處理 3T3-L1 也會抑制 adipogenic gene，如 PPAR γ、C/EBPα、SREBP-1c，抑制分化(32)；visfatin 為內臟脂肪分泌為類 insulin 蛋白質，C16:0 及 C18:1 會向下調節 3T3-L1 前脂肪及成熟脂肪細胞 visfatin mRNA 表現，降低 insulin 促進 glucose uptake 造成 insulin 阻抗(33)。
Amri 等學者以各種脂肪酸處理 Ob1771 脂肪細胞，發現脂肪酸皆會促 進aP2 gene 表現，且 LCFA (≧C12) 如 C16:0、C18:0 比 SCFA 佳，也發現 PUFA (如 C18:3) 比 MUFA (如 C18:1) 好，SFA 最差(34)。
在 PUFA 的動物實驗證據，Xu 等學者則是給予大鼠魚油，發現 FAS mRNA 表現降低，ACO mRNA 表現增加(35)，降低脂肪組織及抑制 rodents
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肥胖(36)；細胞實驗證據有 Hsu 等學者利用豬隻皮下脂肪作初代脂肪細胞 培養，投予PUFA 包括有 arachidonic acid (AA)、c9,t11 conjugated linoleic acid (CLA)、Docosahexaenoic acid (DHA；C22:6)，發現都會增加 FAS、ADD1 mRNA 降解，降低 FAS、ADD1 mRNA 以及促進 ACO mRNA 表現，其中 又以DHA 100μM 效果最強(37)。另外以 DHA 50-200μM 處理 3T3-L1，
發現會抑制3T3-L1 分化，增加脂解作用(38)，同樣的若給予 t10,c12 CLA 也會抑制3T3-L1 分化(39)(40)。
2、 特殊脂肪酸 (Uncommon fatty acid) (1) Conjugated linolenic acid
conjugated linolenic acid (CLN) 為 18 個碳含有 3 個共軛雙鍵的不飽和 脂肪酸(結構請見表 2-1)，存在於特殊種籽油中，如苦瓜 (karela oil) 及桐 油 (tung oil)中含有 60-70％ c9,t11,t13 CLN (α-eleostearic acid) ，石榴油 (pomegranate seed oil) 中含 72％ c9,t11,c13 CLN ( punicic acid )，樟樹籽油 (Catalpa seed oil) 含 31％ t9,t11,c13 CLN ( catalpic acid )、金盞花籽油 ( pot marigold seed oil ) 含 33％ t8,t10,c12 CLN ( calendic acid )(41)。
c9,t11,c13 CLN 為苦瓜中主要且特殊的脂肪酸，在生理方面已證實具 有抗癌、降血糖、降體脂等功能。在抗癌方面證據包括，Kohno 等學者給 予 AOM (azoxymethane) 誘導大腸癌之大鼠富含 CLN 苦瓜籽油，發現 0.01-0.1％苦瓜籽油可以增加大腸粘膜上的 PPARγ protein，並且抑制 colon carcinogenesis(42, 43)；Yasui 等學者也證實苦瓜中 CLN 可以誘導人類 大腸癌 Caco-2 細胞凋亡(41)。不只苦瓜中 CLN，石榴中的 CLN 也顯示抗 癌功能，如 Kohno 等學者以 AOM 誘發大鼠大腸癌再給予富含 CLN 的石 榴油萃製物 (Pomegranate seed oil ; PGO)，發現 PGO 0.01％-0.1％可抑制腫 瘤數量及抑制adenocarcinoma 發生(44)。
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c9,t11,c13-CLN 降體脂之間接證據包括將苦瓜汁添加於飼料中，發現 可透過增加肝及肌肉 CPT-1 (carnitine palmitoyltransferase 1) 和 acyl-CoA dehydrogenase 活性來增加脂肪酸氧化來降低體脂(45)，另外苦瓜具有降低 高糖血症(46, 47)，Koba 等學者利用動物模式將 CLN 複合物 (conjugated diene 及 triene) 添加於飲食中，發現 CLN 可降低白色脂肪組織含量(48)。 處理3T3-L1 脂肪細胞，發現 200μM 會誘導 3T3-L1 preadipocyte 細胞凋亡 (51)。
(2) Phytanic acid
Phytanic acid (3,7,11,15-tetramethyl hexadocanoic acid；C20H40O2) 為具 有4 個甲基的支鏈飽和脂肪酸 (結構請見表 2-1)，綠色植物中富含大量的 chlorophyll，含有 phytol ( 3,7,11,15-tetramethylhexadec-2-en-1-ol ) 側鏈，經
由反芻類動物瘤胃中之微生物可將葉綠素中一半的phytol 釋出，並且代謝
成 phytanic acid。因為人體無法將葉綠素中 phytol 釋出，經由放射性標定 chlorophyll 在人類及大鼠的消化道中消化程度實驗，發現食入的 chlorophyll 有95％以上會排出體外(52, 53)，所以透過外源性之飲食來源，如反芻類動 物脂肪、魚類及乳製品，人類可能攝取到 phytanic acid，或者富含葉綠素 食物經加工 (如鹼處理) 可能會使葉綠素之酯鍵斷裂釋出 phytol，人吃入此 類食品後經過體內氧化還原酶之作用轉成phytanic acid ( PA ) (54)。
PA 經飲食進入體內必須經由過氧化小體進行 α-oxidation 生成 pristanic
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acid (2,6,10,14-tetramethlpentadecanoic acid；C19H38O2)，再行 β-oxidation 生 成propionyl-CoA；phytanoyl-CoA hydroxylase (PAHX 或 PhyH) 是 phytanic acid 進行 α-oxidation 第一個酵素，患有 Refsum、過氧化小體合成缺陷、
rhizomelic chondrodysplasia punctata type I 及 Zellweger syndrome (ZS) 的病 人都缺乏此一酵素，造成PA 累積(55)(56, 57)。
已知PA 為 PPAR α 活化劑，會增加大鼠初代肝細胞中 GLUT1、GLUT2 mRNA 表現，增加 glucose uptake(58)。另外在脂肪細胞方面，pristanic acid 及PA 二者，只有 PA 可促進 UCP-1 (uncoupling protein-1) gene 轉錄，促進 棕色脂肪細胞分化(59)，並且共同作用誘導棕色脂肪細胞分化特定 gene 表 現，如aP2 (adipocyte lipid-binding protein)、LPL、GLUT4、cytochrome c oxidase subunit II 等(60)，活化 BAT (brown adipose tissue) 生熱作用。
Schluter 等學者使用 3T3-L1 前脂肪實驗發現，與 vehicle control 相比，PA 可促細胞分化作用(61)。
(二) 天然抗氧化物
1、 Epigallocatechin Gallate (EGCG)：
EGCG 茶中含量豐富 (結構請見表 2-2)，茶葉是來自於 Camellia ( theaflavin-3-gallate) ， TF-2b (theaflavin-3’-gallate) 、 TF-3 ( theaflavin-3,3’-digallate)，和 thearubigins。(64)。兒茶素成分分析其中 (-)-epicatechin (EC)、(-)-epigallocatechin (EGC)、(-)-epigallocatechin gallate
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(EGCG) 三種成分，在綠茶、烏龍茶含量高於紅茶和普耳茶(65)。
EGCG 生 理 功 能 相 關 研 究 包 括 有 ， 綠 茶 兒 茶 素 為 polyphenolic flavonoids 過去曾被稱為維生素 P，其特殊結構於 1952 年由 Roberts 等學者
發現，是未醱酵茶中主要的成分，綠茶中兒茶素以EGCG 為主要活性成分，
已被證實具有抗癌、抗氧化(66)、抗脂質過氧化能力(67, 68)，降低體重及 體脂(69)(70)(71)，增加肝臟β-oxidation 活性增加脂質代謝(72)。
人體試驗方面 Nakagawa 等學者給予健康受試者綠茶萃取物錠(內含
525mg EGCG、17.5mgEGC)90 分鐘後，發現血漿 EGCG 及 ECG 濃度分別 為4.3、0.3μM(73)，另外口服綠茶萃取物 20mg / kg body weight 溶於 200mL 溫水，約1 到 2 小時後，血中 EGCG、EGC、EC 濃度分別是 0.17μM、0.5
PI3K/Akt 及 JNK (c-Jun N-terminal Kinase) 路徑來抑制 FAS mRNA 及其蛋 白質(75)；另外 Waltner 學者同樣使用肝細胞 H4ΠEC3，投予 EGCG 發現 會 抑 制 insulin 誘導的 IR (insulin receptor) 及 IRS-1 (insulin receptor substrate-1) 磷酸化作用(78)；除此之外也有學者將烏龍茶萃取物投予脂肪
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細胞，發現茶中 caffeine 會增強脂肪細胞正腎上腺素作用，促進脂肪細胞
脂解作用(79)；
此外EGCG 會抑制 3T3-L1 細胞增生(80)，EGCG 100μM 會透過活化 AMPK (AMP-activated protein kinase) (81)和向下調節 resistin mRNA 表現來 抑制3T3-L1 adipocyte 分化(82) (83)，並且誘導成熟 3T3-L1 細胞之細胞凋 亡(84)。
2、 Procyanidins
原花青素 (Procyanidins) 廣泛地存於紅酒、葡萄、可可、蘋果中，是 flavonoids 的一種，由許多的 catechin 聚合形成 oligomeric form(結構請見表 2-2) ，具有抗心血管疾病功能，近來也有和抗肥胖的相關研究。
其生理功能之動物實驗包括﹕給予大鼠口服procyanidins 200 mg / kg BW，約 1 小時後在血中及肝臟中就可以偵測到體內 procyanidins 達最大濃 度14 mg / L(85)，而葡萄籽中的 procyanidins 可以改善糖尿病的氧化狀態 (86-89)，由於 procyanidins 具有 insulinomimetic 活性，可經由 PI3K 及 p38MAPK 路徑並且增加 GLUT4 (glucose transporter-4) 轉位到膜上，促進 葡萄糖汲取並傾向 glycerol 合成(90)，降低以 STZ 誘發糖尿病大鼠血糖，
具有抗高血糖症功能(90)。
在細胞實驗證據包括有，Procyanidins 具有類似 TNF-α的功能，會向 下調控 adipocyte marker 如 glycerol-3-phsphate dehydrogenase (G3PDH)、
hormone sensitive lipase (HSL) 活性及 PPSRγmRNA 表現(91)，抑制脂肪 細胞分化(92)，另外也會增加 3T3-L1 脂肪細胞脂解速率(93)。
3、 Curcumin
微黃色，常見薑科植物之薑黃 (Curcuma longa L.) 中 (結構請見表 2-2) ，在亞洲地區屬於傳統醫療，用於治療發炎及其他疾病，市面薑黃粉
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末每 100g 含有 2.71-5.18g curcuminoids，市售咖哩粉末每 100g 約含有 0.34-0.47g 薑黃粉末(94)。
在生理方面curcumin 具有抗氧化(95, 96)、抗癌(97, 98)等功能，Asai 等學者於飼料中添加1% curcumin 複合物給予 SD 大鼠，可降低體脂、肝 脂、增加肝臟ACO 活性，(99)，Nishiyama 等學者，給多 type2 DM KK-Ay mice 0.1-0.5 g / 100 g diet 薑黃萃製物 4 週後可以降低血糖，薑黃酒精萃製 物可促進人類脂肪細胞分化，另外在GAL4-PPARγ chimera assay 中發現 薑黃萃製物5 μg / mL (約為 13.5μM ) 為 PPARγligand(100)。
4、 Naringenin
常見於柑橘類水果及葡萄柚中 (結構請見表 2-2) ，在動物實驗方面 Lee 等學者以 naringenin (0.1％，wt/wt) 合併高脂飲食餵食大鼠，發現可降 低餵食高脂飲食之大鼠血液及肝臟膽固醇(101)。
根據1997 年美國農業部調查，個人每日柑橘類攝取量約為 68 g，而其
根據1997 年美國農業部調查，個人每日柑橘類攝取量約為 68 g，而其