3T3F442A 及初代培養前脂肪細胞 (stromal-vascular cell；SV cell)等，而我們在此選 用了分化常用之細胞株3T3-L1 preadipocyte celline，是因為 3T3-L1 是具有高度分化 為成熟脂肪細胞潛力之前脂肪細胞株(23, 25)，因此能用來看出以測試物處理後對脂 比較，C8:0 和 C10:0 都是呈現抑制分化、抑制成熟脂肪細胞 lipogenesis；另外 Amri
等學者，使用各種不同的脂肪酸處理 ob1771 脂肪細胞，發現脂肪酸促進分化程度
- 68 - 酸 c9,t11,t13- conjugated linolenic acid (c9,t11,t13-CLN) 和 phytanic acid (PA)及其各 自的對照脂肪酸組分別是C18:3 和 C16:0。
(1) 特殊脂肪酸--c9,t11,t13-CLN 對 3T3-L1 adipogenesis 的影響
1987 年由 Blankson 等學者首次發現之 Conjugated linoleic acid (CLA) ，已 知具有降體重(129)、降體脂(130)、抗癌(131, 132)等功能，在 3T3-L1 脂肪細胞 實驗已知CLA 可增加脂肪酸氧化(133, 134)、抑制增生(135, 136)、抑制分化(137) 並且抑制C/EBPα(134)和 PPARγ(138, 139)。CLN 與 CLA 是含有共軛雙鍵的 脂肪酸；不同處為前者是18:3 後者是 18:2，相較於 CLA，有關 CLN 對體脂生 成影響所知甚少，相關研究包括動物實驗方面，Koba 等學者將 CLN 複合物 (含 conjugated diene 及 conjugated triene) 加入飼料中，餵食 SD 大鼠發現白色脂肪 組織會減少(48)，而 c9,t11,t13-CLN 為苦瓜主要的脂肪酸成分，Chan 等學者將 苦瓜汁用於動物模式中，發現苦瓜汁可透過增加肝及肌肉 CPT-1 及 acyl-CoA dehydrogenase 活性來增加脂肪酸氧化降低體脂(45)； Chuang 等學者利用 H4Ⅱ EC3 肝細胞模式加入苦瓜中萃出富含 c9,t11,t13-CLN 之區分物處理，發現可活 化 PPARα，促進 ACO 活性及其 gene 表現(50)。這些都間接證實 CLN 中的 c9,t11,t13-CLN 可能具有抗肥胖潛力，故此我們首次將純度 99％ c9,t11,t13-CLN
藥品於 3T3-L1 脂肪細胞中實驗，想了解此種特殊脂肪酸是否可以抑制脂肪細
第五章 討論 μM，不論對 preadipocyte、differentiating adipocyte 或 mature adipocyte 都不會 造成細胞數減少。
實 驗 結 果 顯 示 c9,t11,t13-CLN 與 其 對 照 C18:3 比 較 ， 在 preadipocyte proliferation 階段 c9,t11,t13-CLN 會抑制增生；在分化階段 c9,t11,t13-CLN 會抑 制細胞內 TG 堆積 (圖 4-3)、抑制細胞內 G3PDH 活性 (圖 4-4) ，加上以油紅 染色的方式觀察細胞內油滴情形，發現 c9,t11,t13-CLN 比起對照組明顯油滴數 目減少且油滴也較小 (圖 4-6)；在分化末期階段 CLN 會抑制細胞內 TG 堆積 (圖 4-9) 和抑制細胞內 G3PDH 活性 (圖 4-10)。除了成熟脂肪細胞外，
c9,t11,t13-CLN 會造成前脂肪細胞階段及分化階段脂肪細胞之細胞凋亡。
Nishimura 等學者將苦瓜中萃出 c9,t11,t13-CLN 200μM 處理 3T3-L1，發現可以 誘導前脂肪細胞細胞凋亡(51)，我們研究發現 c9,t11,t13-CLN 在 100μM 會造 成preadipocyte 及 differentiation 階段細胞凋亡 (圖 4-12) ，而劑量上比較低可 能是因為我們使用的為純度99％藥品，Nishimura 學者使用的 CLN 為萃取物。
這些結果顯示 c9,t11,t13-CLN 會抑制 3T3-L1 前脂肪細胞增生、分化，此種 抑制作用與促進細胞凋亡有關。除此外 c9,t11,t13-CLN 也會作用於成熟脂肪細 胞，抑制lipogenesis，其抗肥胖之潛力未來值得深入探討。
(2) 特殊脂肪酸-PA 對 3T3-L1 adipogenesis 的影響
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在 PA 方面曾有學者發現在白色、棕色脂肪、肝臟三種組織中，以棕色脂
肪 組 織 中 phytanoyl-CoA hydroxylase mRNA 表 現 最 高 ， 而 phytanoyl-CoA hydroxylase 與 phytanic acid 代謝有關；HIB-1B 棕色脂肪細胞株轉染 UCP1-CAT gene 也發現 5-20μM PA 會促進 UCP-1 gene 轉錄作用，促進棕色脂肪細胞分化 而活化BAT 生熱作用(59)，間接表示 PA 具有增加生熱作用，抗肥胖的潛力。
為了解PA 是否也會影響脂肪細胞 adipogenesis，所以我們將 10-200μM PA 處理 3T3-L1，發現即使在 200μM PA 也不會造成前脂肪細胞之細胞毒性，在 100μM 濃度下也不會影響分化階段和成熟脂肪細胞數目。和對照組 C16:0 相 比，在preadipocyte proliferation 階段 PA 並不影響增生，在分化階段 PA 與 C16:0
相較為抑制分化，在分化末期階段與其對照組相比，PA 則會抑制成熟脂肪細胞
Hung 等學者證實 EGCG 會透過 ERK 和 Cdk2 路徑，使 3T3-L1 preadipocyte 細胞數目減少(80)，而我們的研究中也發現 EGCG 抑制前脂肪細胞增生 (圖 4-17)
第五章 討論
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且有dose-response，和文獻相符合。
但是在誘導脂肪細胞分化的實驗中，Hwang 等學者發現 EGCG 與 vehicle control 相比，EGCG 透過 AMPK 路徑抑制脂肪細胞分化(81)；這和我們的結果 不同，或許是因為Hwang 學者將 3T3-L1 preadipocyte 先以 100μM EGCG 處理 30 分鐘後再換成分化 medium，而我們的實驗設計是於分化起始 (day0) 才將 活性(96)；另外也有學者以 GAL4-P PARγ chimera assay 中也發現 curcumin 為 PPARγ ligand(100)；Nishiyama 等學者給予 type2 DM KK-Ay mice 薑黃萃製 物，包括酒精萃0.2-1 g / 100g diet 及高劑量的正乙烷萃 0.5g / 100g diet，都發現
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有關測試劑量方面，發現9 種抗氧化物在 100μM 濃度下與 vehicle control 相較，均不會顯著造成細胞數目顯著減少，只除了 curcumin，curcumin 約 50 μM 即會造成 preadipocyte 細胞數明顯減少，100μM 會造成分化階段和成熟脂 肪細胞數目減少(蛋白質定量結果未示)。
與脂肪酸不同的是多酚類並不會一律促進 3T3-L1 分化，因此本實驗結果
多酚類均直接與其vehicle control 相比較。結果發現所有多酚均會抑制前脂肪細 胞之增生，尤其是curcumin 最為顯著。在 differentiation 時 curcumin 會抑制細 胞內TG 堆積 (圖 4-13) 、細胞 G3PDH 活性幾乎為零 (圖 4-14)、加上以油紅
(3) 多酚類- resveratrol、apigenin、genistein 對 3T3-L1 adipogenesis 的影響
這些多酚類與抗肥胖相關研究，證據包括50μM resveratrol 可抑制 3T3-L1 成熟脂肪細胞lipogenesis，並增加脂解作用(109)，同樣劑量也可抑制 C3H10T1/2 間葉細胞形成adipocyte(110)；apigenin 萃取物在動物實驗中可降低膽固醇、抑 制脂質吸收、增加初代副睪脂肪細胞脂解作用(113, 115)；genistein 會降低 3T3-L1 preconfluent 及 mitotic clonal expansion 時細胞數目(126)，抑制 3T3-L1 分化，促 進脂解作用(104)。
在我們的研究中發現 resveratrol、apigenin、genistein 在前脂肪細胞階段都 會使 preadipocyte 細胞數減少 (圖 4-17) 但不會造成細胞毒性 (圖 4-17) ；在
第五章 討論
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分化階段均會抑制細胞內 TG 堆積 (圖 4-13)、抑制 G3PDH 活性 (圖 4-14)、
加上油紅染色觀察細胞內油滴情形，與 vehicle control 相比油滴明顯減少 (圖 4-16)；在分化末期階段 resveratrol 及 genistein 顯著抑制成熟脂肪細胞 TG 堆積，
但apigenin 並無顯著作用。
由以上可知除了已知的 EGCG 外，本實驗發現 curcumin、resveratrol、
apigenin、genistein 均有 anti-adipogenesis 作用，不只抑制前脂肪細胞增生，並 抑制脂肪細胞分化，其中 resveratrol 與 genistein 還會抑制成熟脂肪細胞 TG 堆 積，其抗肥胖潛力值得研究。
另外由於fatty acid synthase (FAS) 為脂肪酸合成的酵素， Li 等學者發現多 酚類包括resveratrol、apigenin、genistein、flavone 等都是 FAS 的抑制劑，而這
些多酚類在結構上都具有相同之處，所以 Li 等學者推測只要具有以下 3 個條
件，包括了 1) 具有 2 個 phenyl rings (A ring 和 B ring)，2) 在每個 rings 上具有 各自的OH group，3) 具有適當的酯鍵可連接 rings，若具有以上 3 個條件就可 能抑制 FAS(140)，這或許可作為未來進一步研究多酚類 anti-adipogenesis 作為 參考。
- 74 - 制terminal differentiation 之作用和誘導細胞凋亡有關。
2、 PA 對於前脂肪細胞不會造成毒性，也不會降低細胞數目；但會抑制脂肪細胞分 細胞毒性；在分化階段3 者均會抑制分化；在分化末期階段 resveratrol 和 genistein 會抑制成熟脂肪細胞TG 堆積，但 apigenin 並無顯著作用