材料與方法
五、 各組實驗組別與流程 (一) 實驗一
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五、 各組實驗組別與流程 (一) 實驗一
1. 目的:
探討當給予 Ang IV 後所產生 inflammatory hyperalgesia 減 輕之效果與 oxytocin 以及 IRAP 之可能的關聯性
2. 藥物:
(1) Ang IV: IRAP inhibitor, 25.8 nmole
(2) atosiban: oxytocin antagonist, 0.5 nmole 3. 行為實驗: 腳底板疼痛試驗 (plantar test) 4. 組別:
(1) control 組: saline, 20 μl
(2) Ang IV (25.8 nmole, 10 μl) 以及 saline (10 μl)
(3) atosiban (0.5 nmole, 10 μl) 以及 saline (10 μl)
(4) Ang IV 和 atosiban (各為 25.8 nmole, 0.5 nmole,共10 μl )以 及 saline (10 μl)
5. 流程:
(1) 所有組別隻大白鼠都先進行脊髓內注射之埋管手術 (intrathecal catheter implantation) 。
(2) 接受行為測試的前一天將手術成功之大白鼠置於行為測試的
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(3) 打入 carrageenan (1.5 % w/v in saline) 之前一小時，先測量 腳掌受熱抬起之 basal 值，時間點標示為-1 hr。
(4) 以 26 號針頭注射 0.1 ml 的 carrageenan (1.5 % w/v in saline) 至大白鼠之左腳底板的皮下。
(5) 不同實驗組別分別抽取 saline (10 μl) 、 Ang IV (25.8 nmole, 10 μl) 、atosiban (0.5 nmole, 10 μl) 以及 Ang IV 和 atosiban
(各為 25.8 nmole, 0.5 nmole,共10 μl ) 經由 PE 10 catheter 注射入脊髓中，隨即再抽取 saline (10 μl) 經由 PE 10 catheter 注射入脊髓中，以確保藥物完全入脊髓中。
(6) 在打入 carrageenan (1.5 % w/v in saline)，並完成給予不同實 驗組別之脊髓內注射給藥後，測量腳掌受熱源刺激並記錄實驗 動物將腳移開的反應時間，時間點為 0.25 hr (注射與給藥約花 費 15 分鐘)。
(7) 之後分別在在打入 Carrageenan (1.5 % w/v in saline)後 1 hr, 2 hr, 3hr, 4 hr, 4.5 hr, 5 hr, 5.5 hr, 6 hr, 7 hr, 24 hr 及 31 hr 時 將實驗動物置於 plantar test chamber 中，給予熱源刺激並記 錄實驗動物將腳移開的反應時間。
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(二) 實驗二 1. 目的:
以脊髓注射方式 (intrathecal injection; i.t.) 給予 oxytocin，
來探討 oxytocin 在 plantar test 中所產生的抗疼痛過敏化是否會 因為同時給予 Ang IV 而加強或延長其效果。
2. 藥物:
(1) Ang IV: IRAP inhibitor, 25.8 nmole (2) oxytocin: 0.125 or 0. 0416 nmole 3. 行為實驗: 腳底板疼痛試驗 (plantar test) 4. 組別:
(1) control 組: saline, 20 μl
(2) oxytocin (0.125 nmole, 10 μl) 以及 saline (10 μl)
(3) Ang IV 和 oxytocin (各為 25.8 nmole, 0.125 nmole,共 10 μl ) 以及 saline (10 μl)
(4) oxytocin (0.0416 nmole, 10 μl) 以及 saline (10 μl)
(5) Ang IV 和 oxytocin (各為 25.8 nmole, 0.0416 nmole,共10 μl ) 以及 saline (10 μl)
5. 流程:
(1) 所有組別之大白鼠都先進行脊髓內注射之埋管手術
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(2) 接受行為測試的前一天將手術成功之大白鼠進行置於測試的 環境適應。
(3) 腳掌注射 carrageenan (1.5 % w/v in saline) 之前一小時，先 測量腳掌受熱抬起的抬起之 basal 值，時間點標示為-1 hr。
(4) 以 26 號針頭注射 0.1 ml 的 carrageenan (1.5 % w/v in saline) 至大白鼠之左腳底板的皮下。
(5) 不同實驗組別分別抽取 saline (10 μl) 、oxytocin (0.125 or 0.0416 nmole, 10 μl) 以及 Ang IV 和 oxytocin (各為 25.8 nmole, 0.125 or 0.0416 nmole,共 10 μl ) 經由 PE 10 catheter 注射入脊髓中，隨即再抽取 saline (10 μl) 經由 PE 10 catheter 注射入脊髓中，以確保藥物完全入脊髓中。
(6) 在打入 carrageenan (1.5 % w/v in saline)，並完成給予不同實 驗組別之脊髓內注射給藥後，測量腳掌受熱源刺激並記錄實驗 動物將腳移開的反應時間，時間點為 0.25 hr。
(7) 之後分別在在打入 carrageenan (1.5 % w/v in saline)後 1 hr, 2 hr, 3hr, 4 hr, 4.5 hr, 5 hr, 5.5 hr, 6 hr, 7 hr, 24 hr 及 31 hr 時將 實驗動物置於 plantar test chamber 中，給予熱源刺激並記錄 實驗動物將腳移開的反應時間。
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(三) 實驗三 1. 目的:
利用電刺激 PVN 產生內生性的 oxytocin ，並觀察其所產生 抗發炎性疼痛之效果是否會受到 Ang IV 調控。
2. 藥物:
(1) Ang IV: IRAP inhibitor, 25.8 nmole
(2) atosiban: oxytocin antagonist, 0.5 nmole 3. 手術:
(1) 脊髓內 (i.t.) 注射之埋管手術
(2) 下視丘室旁核 (PVN) 電極外套導管埋管手術 4. 行為實驗:
(1) 閃尾試驗 (tail-flick test)
(2) 腳底板疼痛試驗 (plantar test) 6. 組別:
(1) PVN control + i.t. saline 組 (2) PVN stimulation + i.t. saline 組 (3) PVN control + i.t. Ang IV 組 (4) PVN stimulation + i.t. Ang IV 組 (5) PVN stimulation + i.t. atosiban 組
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(intrathecal catheter implantation) 以及下視丘室旁核電極外 套導管埋管手術。 stimulation of the paraventricular hypothalamic nucleus) (5) 將實驗動物置於紅外線閃尾測定儀上，給予熱源刺激‧ 國
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(10) 打入 carrageenan (1.5 % w/v in saline) 後 5 小時，不同組別 分別抽取 saline 10 μl 、Ang IV (25.8 nmole, 10 μl) 或 atosiban ( 0.5 nmole, 10 μl) 後經由 PE 10 catheter 注射入脊 髓中，隨即再抽取 saline (10 μl) 經由 PE 10 catheter 注射入 脊髓中，以確保藥物完全進入脊髓中。
(11) 在打入 carrageenan (1.5 % w/v in saline) 5 小時後，並完成給 予不同實驗組別之脊髓內注射給藥後，依照不同組別分別給予 下視丘室旁核電刺激。
(12) 測量後並記錄腳掌受熱源刺激實驗動物將腳移開的反應時 間，時間點為 5.25 hr。
(13) 之後分別在打入 carrageenan (1.5 % w/v in saline) 5.5 小時 後將實驗動物置於 plantar test chamber 中，給予熱源刺激並 記錄實驗動物將腳移開的反應時間。
(四) 實驗四 1. 目的:
由於 IRAP 可以降解部分發炎相關之物質，所以利用腳掌注 射 carrageenan 的同時局部給予 Ang IV ，來探討在發炎產生之 局部位置給予 Ang IV 是否對於腳掌發炎腫脹有所影響。
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(1) 接受行為測試的前一天將手術成功之大白鼠進行行為測試的 環境適應。
(2) 腳掌注射 carrageenan (1.5 % w/v in saline) 或 angiotensin IV (IRAP inhibitor, 200 μg) 合併 carrageenan (1.5 % w/v in saline) 之前一小時，先測量腳掌受熱後抬起時間之 basal 值，並將實驗動物腳掌置於浮腫儀中，記錄實驗動物腳掌體積 的 basal 值，時間點標示為-1 hr。
(3) 以 26 號針頭注射 0.1 ml 的 carrageenan (1.5 % w/v in saline) 或 angiotensin IV (IRAP inhibitor, 200 μg) 合併 carrageenan (1.5 % w/v in saline) 至大白鼠之左腳底板的皮下。
(4) 在打入 carrageenan (1.5 % w/v in saline) 或 angiotensin IV (IRAP inhibitor, 200 μg) 合併 carrageenan (1.5 % w/v in saline) 後，測量腳掌受熱源刺激並記錄實驗動物將腳移開的 反應時間，時間點為 0.25 hr。
(5) 之後分別在注射 carrageenan (1.5 % w/v in saline) 後 1 hr, 2 hr, 3hr, 4 hr, 4.5 hr, 5 hr, 5.5 hr, 6 hr, 7 hr, 24 hr 及 31 hr 時將 實驗動物置於 plantar test chamber 中，給予熱源刺激並記錄 實驗動物將腳移開的反應時間，之後將實驗動物腳掌置於浮腫 儀中，記錄實驗動物腳掌體積的變化程度。
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六、其他設備
：
1. - 80 ℃冷凍冰櫃 (Forma 8600 Series Upright Freezers, Thermo Fisher Scientific, U.S.A.)
2. - 20 ℃冷凍冰櫃 (Whirlpool, U.S.A ) 3. 4 ℃冷藏櫃 (Whirlpool, U.S.A )
4. 天秤 (BL 150S, Sartorious, Germany)
5. pH 偵測儀 (pH vision 6071, Microcomputer, Taiwan) 6. 磁石攪拌器 (Taiwan)
7. 快速高壓消毒器（TOMIN, TM-321D, Taiwan）
七、數據統計方法
所有的實驗數據皆以平均值 ± 標準誤差 (mean ± S.E.M.) 來表 示；實驗數值的比較，所用的統計方法主要以 Two-way ANOVA 來做 組間差異之比較，只有兩組比較者，則用 Student’s t test 做統計分析，
若 P < 0.05 則認為有顯著之統計意義。
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Ang IV 25.8 nmole (n=9) Atosiban 0.5 nmole (n=9) Atosiban + Ang IV (n=8)
*** *
* * *** *** *****
** ***** *** ************** **
Time after intraplantar carrageenan injection (hour)
Paw withdrawal latency (sec)
圖 3-1: The effect and possible mechanism of intrathecal Ang IV on carrageenan-induced hyperalgesia determined by plantar test.
Two-way ANOVA followed by Newman-keuls test, *P<0.05,
**P<0.01, ***P<0.001 (Ang IV vs. saline; atosiban vs. saline;
atosiban + Ang IV vs. saline )
(一) control 組: saline, 20 μl
當在大白鼠左後腳掌注入 carrageenan 0.1 ml (15 mg / ml) 後，paw withdrawal latency 會逐漸從注入前一小時的基礎值 12.37
± 0.28 秒開始減少，第 1 個小時後減少到 6.63 ± 0.58 秒，第 2 個