4-1-1. 以微陣列分析銀杏萃取物的差異表達基因及其調控路徑
為了研究 EGb 761 對額葉皮質基因表達的影響，將 EGb 761 連續 7 天餵食小白鼠，基因表達的整體影響以寡核苷酸微陣列來分析，微陣列 分析所得的資料再以 Gene Expression Pattern Analysis Suite 軟體進一步 分析差異表現基因，在我們分析的 29,922 個基因中，EGb 761 改變了 2,209 個轉錄子的表現，包括 1,097 個被上調與 1,112 被下調。KEGG 路 徑分析 EGb 761 改變的基因，發現在額葉皮質的基因表現有 10 個路徑 與 口 服 EGb 761 有 統 計 上 的 差 異 (p < 0.05) ， 其 中 neuroactive ligand-receptor interaction 路徑在 EGb 761 組與對照組的比較是統計上最 有意義的(p = 4.13×10-6) (表 4-1)。在這 10 個 EGb 761 改變的路徑中，
neuroactive ligand-receptor interaction 路 徑 、 axon guidance 路 徑 及 long-term potentiation 路徑在生理功能上與神經系統有關係(207, 208, 209)。這 些被 EGb 761 改變的路徑在大腦紋狀體及腎臟都沒有明顯的變化(表 4-1)，表示 EGb 761 在大腦皮質改變表達基因有其特異性，與其它器官 組織不同。
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表 4-1. 銀杏萃取物在額葉皮質、紋狀體及腎臟所調控的 KEGG 路徑
KEGG pathway Frontal cortex Striatum Kidney
Observed (Total) pa Observed (Total) pa Observed (Total) pa Neuroactive ligand-receptor interaction 53 (257) 4.13×10-6 14 (257) URc 12 (257) 5.36×10-1 Gap junction 19 (91) 7.50×10-4 7 (91) 2.55×10-1 6 (91) 8.70×10-1 Cell Communication 21 (132) 1.62×10-3 11 (132) 4.96×10-2 10 (132) 3.34×10-1 Focal adhesion 29 (190) 1.23×10-2 21 (190) 4.03×10-3 24 (190) 1.44×10-2 Calcium signaling pathway 27 (174) 1.66×10-2 10 (174) UR 10 (174) 7.12×10-1 Axon guidance 20 (128) 1.97×10-2 10 (128) 1.96×10-1 12 (128) 2.73×10-1 Tight junction 18 (118) 3.79×10-2 9 (118) 2.48×10-1 16 (118) 2.03×10-2 ECM-receptor interation 14 (84) 3.28×10-2 9 (84) 5.49×10-2 10 (84) 1.12×10-1 TGF-beta signaling pathway 14 (89) 3.28×10-2 7 (89) 2.17×10-1 11 (89) 6.07×10-2 Long-term potentiation 12 (65) 3.34×10-2 3 (65) UR 5 (65) 9.32×10-1
a使用 WebGestalt 網頁(http://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/login.php)上 hypergeometric test 計算 p 值
b給藥組與對照組各使用小白鼠 3 隻
b每條路徑先計算是否為 over-representated 的路徑後才計算 p 值，under-represented 路徑以 UR 表示
在 neuroactive ligand-receptor interaction 路徑中的 257 個基因裏，有 53 個基因明顯地被 EGb 761 改變(p < 0.01) (附錄 1)，為了減少偽陽性的 誤判，只選擇其中改變倍率大於 1.5 倍的 44 個基因(26 個受體與 18 個配 基)來分析，我們分析這 26 個受體的表現被 EGb 761 調控的情形。根據 KEGG 的分類，這些 neuroactive ligand-receptor interaction 路徑的受體在 KEGG 網站上分成 4 類，即 A 類 (rhodopsin-like), B 類 (secretin-like), C 類 (metabotropic glutamate/pheromone), 和 channels/other receptors (http://www.genome.jp/dbget-bin/get_pathway?org_name=mmu&mapno=04 080)，將上述 26 個 EGb 761 調控的基因分類之後，發現 EGb 761 調控 A 類、B 類與 channels/other receptors 這三類受體的基因表現，並不調控 C 類受體，這 26 個基因中有 8 個基因屬於 amine receptor 亞類(A 類的其 中一個亞類)，這 8 個基因分別是 adrenergic receptors (Adr), dopamine receptors (Drd), histamine receptors H (Hrh), and 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptors (Htr)的基因，上述基因全部都是被 EGb 761 上調 (圖 4-1).
Amine
Peptide
Hormone protein
Prostanoid
Nucleotide like
Lysophinglipid/LPA
Class A: Phodopsin like Class B: Secretin
Channels/other receptors
圖 4-1. 銀 杏 萃 取 物 在 額 葉 皮 質 對 於 Neuroactive ligand-receptor interaction 路徑中基因調控的情形
此路徑的受體分成 4 類，圖中顯示 EGb 761 顯著調控(p < 0.01)且倍率大 於 1.5 倍以上的基因，上調基因以紅色表示，下調基因以綠色表示。
4-1-2. 銀杏萃取物對多巴胺受體之基因表達的影響
五個多巴胺受體的改變倍率列在表 4-2¸ 這 5 個巴胺受體在額葉皮 質的平均上調倍率是 2.09 倍，其中多巴胺受體 Drd1a 被上調 5.07 倍 (p = 4.062×10-07) ， 是 在 EGb 761 在 額 葉 大 腦 皮 質 基 因 中 的 neuroactive ligand-receptor interaction 路徑裏最顯著且倍率最高的上調基因，這 5 個 多巴胺受體在腎臟的表現並沒有因為 EGb 761 的給予而有改變。
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表 4-2. 銀杏萃取物在額葉皮質與腎臟對多巴胺受體的調控
Gene description
Frontal cortex Kidney
FCa p valueb FCa p valueb
Dopamine receptor d5 -1.734 ± 0.435 0.043 -1.203 ±0.503 0.476 Dopamine receptor d4 1.566 ± 0.655 0.165 -1.316 ±0.559 0.357 Dopamine receptor d2 2.756 ±0.626 2.192×10-4 1.633 ±0.870 0.213 Dopamine receptor d3 2.774 ±1.179 0.025 -1.183 ±0.595 0.615 Dopamine receptor d1a 5.069 ±0.342 4.062×10-7 1.024 ±0.200 0.848
aFC 為 fold change，數值表示法為 3 次獨立試驗的平均值 ± 標準差
b統計分析使用 Gene Expression Pattern Analysis Suite v3.1 t-statistics 網站(http://gepas3.bioinfo.cipf.es/)上 Differential Expression (T-Rex)工具中的 t-statistics 來計算
4-1-3. 以即時定量聚合酵素鏈反應確認銀杏萃取物誘發多巴胺受體 基因的 mRNA 表現
為了確認 EGb 761 會上調 Drd1a 的基因表現，在餵予小白鼠 7 日之後，將 RNA 從額葉皮質及腎臟萃取出來進行即時定量聚合酵素 鏈反應，結果發現在未餵予 EGb 761 的小鼠體內，Drd1a 在額葉的表 現為腎臟的 660 倍(表 4-3)，而無論是腎臟或額葉皮質，Drd1a 的表現 均因 EGb 761 的餵予而上升，以未餵予 EGb 761 小鼠腎臟表現為 1 時，Drd1a 在餵予 EGb 761 小鼠的腎臟表現上升至 1.7 倍，而在額葉 皮質則由 660 倍上升至 750 倍。
4-2-4. 以免疫組織化學染色確認銀杏萃取物誘發多巴胺受體的蛋白 質表現
為了偵測 EGb 761 是否能更進一步影響 Drd1a 的蛋白質表現，在 小鼠給予 7 日的藥物餵予之後，將整個大腦與腎臟切片以抗 Drd1a 抗 體進行免疫化學分析染色，在未處理組的小鼠，大腦皮質只有染出少 數的 Drd1a-免疫陽性細胞，此結果與前人的研究相符(210)，而在餵予 EGb 761 的小鼠，在大腦皮質有許多的 Drd1a-免疫陽性細胞(圖 4-2)，
在腎臟組織中，無論是否餵予 EGb 761，在免疫化學染色分析結果，
完全無法偵測出 Drd1a-免疫陽性細胞。
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表 4-3. 以即時定量聚合酵素鏈反應偵測銀杏萃取物對額葉皮質與腎臟表現多巴胺受體的影響
Sample Average CTof Drd1a Average CTof GAPDH ΔCTa ΔΔCTb Relative ratio Frontal cortex
EGb 761 21.40 ± 0.03 16.09 ± 0.03 5.30 ± 0.05 -9.55 ± 0.05 750 Mock 21.58 ± 0.13 16.09 ± 0.04 5.49 ± 0.14 -9.36 ± 0.14 660 Kidney
EGb 761 30.01 ± 0.00 16.04 ± 0.01 13.97 ± 0.01 -0.88 ± 0.01 1.7 Mock 30.70 ± 0.17 15.84 ± 0.09 14.85 ± 0.20 0.00 ± 0.20 1.0
aΔCT的計算由目標基因的 CT值減去 GAPDH 的 CT值而得來
bΔΔCT值為 ΔCT相減而得。
cEGb 761 組與 Mock 組均使用小白鼠 3 隻，抽取總量核糖核酸後混合進行即時定量聚合酵素鏈反應。
圖 4-2. 以免疫組織化學分析偵測腦組織中多巴胺受體蛋白質的表現 Mock 組及 EGb 761 組的小白鼠連續 7 日分別餵食 PBS 或 EGb 761，
腦切平以 anti-Drd1a 單株抗體染色，照片為前額皮質區域的腦組織，
Drd1a 免疫陽性細胞以箭號指出(放大 400 倍)。
4-2. 丹皮酚之神經保護機轉研究
4-2-1. 利用 H2O2誘發人類神經母細胞之 NF-κB活化
H2O2在人類神經母細胞中誘發的 NF-κB活性以冷光酶活性試驗 來測定，為了找出能夠誘發最大 NF-κB活性的 H2O2劑量，SH-SY5Y 細胞暴露在不同濃度的 H2O2中 24 小時，操作上，每一個 H2O2劑量 加入兩個培養盤的細胞，一盤用來進行 MTT 分析，一盤進行冷光酶 活性測定。從圖 4-3 結果顯示，在 0.1 μM - 5μM 的 H2O2濃度之間冷 光酶活性的增加與濃度相關，在這濃度區間內，細胞存活率仍維持在
100%。在 H2O2為 5 μM 時，冷光酶活性可達到未處理細胞的 1.5 倍。
當 H2O2的濃度繼續增加到 10 μM 以上，冷光酶活性開始下降，在 50 μM 的高濃度之下，細胞的存活率也開始下降，H2O2在 SH-SY5Y 的 TC50約為68 μM。
H
2O
2concentration (μM)
NFκB induction rate Cell survival
圖 4-3. 以 H2O2在 SH-SY5Y / NF-κB細胞誘發 NF-κB活化情形
SH-SY5Y / NF-κB細胞以不同濃度的 H2O2處理 24 小時，NF-κB活性 以冷光酶活性試驗測量而細胞存活率以 MTT 法測量，**：p < 0.01 與***：p < 0.001 為各組與 0 μM 組比較結果，數值為 3 次獨立試驗 結果所得之平均值 ± 標準差。
4-2-2. 丹皮酚對 H2O2誘發的 NF-κB 細胞核轉位及 IκB磷酸化的影響 丹皮酚對 NF-κB 蛋白質的細胞核轉位及IκB磷酸化影響以西方點 墨法分析，SH-SY5Y 細胞經過丹皮酚前處理 1 小時接著 H2O2暴露 4 小時，細胞核蛋白質萃取物(nuclear protein extract)與細胞質蛋白質萃 取物(cytoplasmic protein extract)分別進行西方點墨分析，NF-κB在細 胞核與細胞質的蛋白質水平(protein level)以抗 NF-κB p50抗體來偵 測，p50 為 NF-κB蛋白質中最常見的成員之一，I-κB與被磷酸化 I-κB 蛋白質水平分別以抗 I-κB與抗 phospho-I-κB的抗體來偵測。結果顯 示 H2O2的暴露會使細胞核內的 NF-κB蛋白質增加 (圖 4-4，lane 2)，
並增加 I-κB磷酸化的程度，若細胞在暴露前先加入丹皮酚，會使核 內 NF-κB 濃度降低(圖 4-4，lane 3-5)，且細胞質中被磷酸化的 I-κB 隨之減少，這暗示丹皮酚會抑制 H2O2造成的 I-κB磷酸化及 NF-κB 蛋 白的核轉位，顯示丹皮酚可以抑制 NF-κB路徑的活化。
圖 4-4. 丹皮酚對 H2O2所誘發 IκB磷酸化以及 NF-κB核轉移的抑制 數值為 3 次獨立試驗結果所得之平均值 ± 標準差，p65 (n)底端的百 分率為相對於未處理細胞的細胞核內 p65 蛋白質相對量，phospho-IκB 底端的百分率為相對於未處理細胞的 phospho-IκB蛋白質相對量。*：
p < 0.05 表示與 H2O2處理細胞比較的結果。
4-2-3. 丹皮酚對 H2O2誘發 NF-κB活化的影響
第 一 個 測 量 NF-κB 活 性 的 方 法 是 冷 光 酶 活 性 試 驗 ， SH-SY5Y/NF-κB 細胞經丹皮酚前處理 1 小時之後暴露在 H2O2中，24 小時後測定相對冷光值。如圖 4-5 (A)所示，丹皮酚(0.4 mM)能夠減少 H2O2誘發的冷光酶活性至與未暴露細胞相當，而 0.4 mM 丹皮酚濃度
測量 NF-κB 活性的第二個方法是以 EMSA 測量 NF-κB 的核酸結 合能力(DNA binding activity)，將生物素標定的 NF-κB結合序列與細 胞核萃取物反應，結果顯示暴露 H2O24 小時後 SH-SY5Y 的核萃取物 中與 NF-κB 結合共有序列的核酸結合能力增加，處理丹皮酚的細胞 則可降低 H2O2誘發的核酸結合能力。(圖 4-5 (B), lane 4-6)
4-2-4. 以微陣列分析丹皮酚的差異表達基因
為了探討丹皮酚對暴露在 H2O2 下的細胞其基因表現的影響，
SH-SY5Y 細胞先以 0.4 mM 丹皮酚處理 1 小時後，再使細胞暴露在 H2O2中，24 小時後進行微陣列分析，使用 limma 包來分析只有暴露 於 H2O2的細胞與事先加入丹皮酚再暴露於 H2O2的細胞的差異表達基 因，在我們分析的 30,968 個轉錄子(transcript)中，有 2789 個轉錄子 表達被 H2O2改變倍率超過 1.8 倍，其中包括 1193 個轉錄子被上調 (up-regulated)及 1596 個轉錄子被下調(down-regulated)，在這些 H2O2
所改變的表達的轉錄子中，778 個轉錄子可被丹皮酚反向調整超過 1.8 倍。
(A)
(B)
圖 4-5. 丹皮酚對 H2O2所誘在 SH-SY5Y/NF-κB細胞誘發 NF-κB活性 的抑制情形
(A) 以 冷 光 酶 活 性 試 驗 測 量 ， (B) 以 DNA 結 合 能 力 測 量 。 SH-SY5Y/NF-κB 細胞先以丹皮酚前處理 1 小時然後暴露在 H2O2 中，數值為 3 次獨立試驗結果所得之平均值 ± 標準誤，*：p < 0.05 與***：p < 0.001 表示與 H2O2處理細胞比較的結果，#：p < 0.05 表示
4-2-5. 丹皮酚調控基因組分析與網路分析
我們使用 GSEA 來比較只有暴露於 H2O2的細胞與丹皮酚前處理 後再暴露於 H2O2的細胞的基因組(gene set)的不同，22 組基因被確認 與丹皮酚的加入相關 (p < 0.01) (表 4-4)，在這些基因組中，Hypoxia up-regulated 基因組和 HIF1 targets 基因組是與缺氧相關的基因組(211,
212)，JNK pathway 是與環境壓力(例如氧化、缺血和紫外線照射)有關
的路徑(213)。
表 4-4. 丹皮酚顯著調控的基因組
Gene set
Gene
number p valuea Mature T cell-up-regulated 106 0.0014
Fbw7 pathway 9 0.0019
Up-regulated during EMT induction 62 0.0022 Brain highest variance 45 0.0028
LIF down-regulated 29 0.0037
Hypoxia up-regulated 38 0.0037
Skp2 E2F pathway 10 0.0049
HIF1 targets 36 0.0056
Linoleic acid metabolism 31 0.0059
JNK down-regulated 33 0.0060
ap 值為將 3 次試驗抽取之總量 RNA 混合進行微陣列分析所得之差異
表達基因使用 Wilcoson 試驗分析所得
EMT: epithelial-to-mesenchymal transition; LIF: leukemia inhibitory factor; HIF1: hypoxia-inducible factor 1; JNK: c-jun N-terminal kinase
基因交互作用網路以 Genomatix Applications 軟體分析，此軟體 分析基因交互作用的相關性是以文獻、Genematix 知識庫、與啟動子 含有基因相關序列做聯結，文獻的聯結是從 PubMed 資料庫各文獻摘 要中不同基因被共同引用(co-citation)來分析基因/基因的相關。我們 針對被 H2O2改變又被丹皮酚反向調整的基因進行分析，發現 NF-κB 形成整個網路的中心，但它並不是我們輸入的基因(圖 4-6 及附錄 (2))，APP 形成網路的第二個中心點，APP 本身基因表達被 H2O2上調 1.90 倍並被丹皮酚下調 1.94 倍，在網路分析中直接與 NF-κB聯結的
基因交互作用網路以 Genomatix Applications 軟體分析，此軟體 分析基因交互作用的相關性是以文獻、Genematix 知識庫、與啟動子 含有基因相關序列做聯結，文獻的聯結是從 PubMed 資料庫各文獻摘 要中不同基因被共同引用(co-citation)來分析基因/基因的相關。我們 針對被 H2O2改變又被丹皮酚反向調整的基因進行分析，發現 NF-κB 形成整個網路的中心，但它並不是我們輸入的基因(圖 4-6 及附錄 (2))，APP 形成網路的第二個中心點，APP 本身基因表達被 H2O2上調 1.90 倍並被丹皮酚下調 1.94 倍，在網路分析中直接與 NF-κB聯結的