討論

由這個研究利用微陣列技術來探討銀杏及牡丹皮萃取物的神經保 護作用在轉錄層次的實質，讓中藥神經保護作用的分子機轉更加被了 解，不止可提供臨床使用的理論依據，也可以做為往後新藥開發臨床試 驗的起始點。

在研究銀杏抽取物的作用機轉上，分析了EGb 761餵食健康小白鼠 之後基因改變的整體情形。以前的學者藉著無論是傳統分子生物學的方 法或是微陣列分析的方法都曾提出EGb 761具有抗氧化及抗凋亡的作用

(214, 215, 216)，前人利用微陣列的體內研究也顯示EGb 761可調控抗氧化、

抗凋亡、生長因子、離子通道、訊號傳遞及細胞骨架的基因表現⁽⁵⁾，然 而，這些研究結果與EGb 761的神經功能的促進及它的臨床使用並沒有 直接的相關，而在此研究中，我們使用的工具全基因體寡核苷酸微陣 列，在EGb 761對基因轉錄上的影響提供了整體的評估，尤其是在腦部 與其它器官的基因調控的比較上，更能凸顯EGb 761在腦部調控基因的 特殊性。

EGb 761在額葉皮質主要可以調控3個與神經功能相關的路徑。第 一，axon guidance路徑包含軸突引導的斥性分子與吸引分子，在神經系 統發育的過程中它們調控軸突的再生與神經網路的形成^{(217, 218)}；第二，

long-term potentiation路徑的功能為參與神經可塑性，像是學習與記憶的

功能⁽²¹⁹⁾；第三，在neuroactive ligand-receptor interaction路徑的基因為一 群位於細胞膜上的受體與配基的集合，這些受體與配基大多是負責將細 胞外的環境訊號傳遞到細胞內的蛋白質⁽²⁰⁸⁾。

在我們的研究中，neuroactive ligand-receptor interaction路徑是EGb 761調控的最顯著基因群，根據受體的結構與種類，這個路徑分成4類：

A 類 (rhodopsin-like), B 類 (secretin-like), C 類 (metabotropic glutamate/pheromone),和channels/other receptors。EGb 761並不能調控C 類的基因表現，包括metabotropic glutamate (GRM) 受體和γ-aminobutyric acid B (GABBR)受體，這個結果暗示EGb 761無法改變GRM與GABBR 下 游 神 經 傳 遞 訊 號 像 是 下 視 丘 因 子 (substance P, GABA, α-melanocyte-stimulating hormone, and corticotropin-releasing hormone)和腦 下垂體前葉荷爾蒙(prolactin and growth hormone)的分泌^{(220, 221)}。EGb 761 明顯上調A類受體中的諸多amine亞類受體，包括Adra2b, Adra2c, Hrh3, Htr1d, Htr1f, Htr2a, Drd1a, 與Drd2。Adra2b和Adra2c受體在記憶、學習、

強化、睡眠-覺醒週期調節、感情、精神及侵略性的神經功能中伴演重要

的角色^{(222, 223)}，過去對銀杏的研究中，曾有報導指出，銀杏的另一個萃

取物GK 501在大鼠皮質及海馬區會增加Adr的表現濃度⁽¹³⁶⁾；Hrh3是 G-protein-coupled histamine受體中最晚被發現的，Hrh3的配基功能有校 正睡眠-覺醒障礙、嗜睡及進食障礙^{(224, 225)}，Htr1d和Htr1f 則在不同的神

經精神疾病，像是憂鬱、精神分裂症、偏頭痛與藥癮伴演重要的角色⁽²²⁶⁾； Drd1與Drd2則是在調節執行運動過程中的重要受體⁽²²⁷⁾，Drd1的基因剔 除小鼠表現出許多異常的行為，像是整體運動伴隨局部運動的增加^(228,

229)，Drd1也在肌肉的微調上展現它的功能⁽²³⁰⁾，Drd2基因剔除小鼠則表 現出不同程度的動作和姿勢的異常⁽²²⁹⁾，另外，若提高Drd2的訊號會減 少巴金森氏症模型的大鼠表現出顫抖、運動不能和僵硬的症狀⁽²³¹⁾。

在中樞與周邊神經系統，多巴胺神經元是靠著多巴胺這個兒茶胺酚 類分子多刺激巴胺受體達到訊號傳遞的目的⁽²³²⁾。對於中樞多巴胺的研究 大多與巴金森氏症相關，一但腦部失去製造多巴胺的細胞會造成巴金森 氏症的典型症狀⁽²³³⁾，因此，傳統上常使用多巴胺受體的致效劑常用被來 治療巴金森氏症，其中最常用的就是levodopa，然而，levadopa有許多運 動障礙的副作用，而且它的效力會隨著疾病的進展而下降^{(234, 235)}。而銀 杏的萃取物，特別是EGb 761，在大鼠模型中能夠減少巴金森氏症的異 常局部運動(143, 236, 237)，我們的研究結果提出了EGb 761治療異常運動的 可能新穎機轉，即EGb 761促進前葉皮質中多巴胺受體的表現，並可能 因此增加多巴胺在腦部的效力。但是EGb 761對5個多巴胺受體的調控情 形各不同，EGb 761可以上調DrD1a、Drd2、Drd3，但會下調Drd5的表 現，哺乳類的多巴胺受體共有5種，依據結構及受體的親和度可分為2大 類，即D1類(包括Drd1和Drd5)與D2類(包括Drd2、Drd3、Drd4)⁽²²⁹⁾， 其

中D1類與刺激adenyl cycliase有關而D2類與抑制cAMP的產生有關⁽²³⁸⁾， Drd1為中樞神經系統中分布最廣泛的多巴胺受體，在大腦皮質中D1類的 含量約為D2類的10 - 20倍⁽²³⁹⁾，也分布於腹側與背側紋狀體、大腦皮質、

下視丘與與邊緣系統等，但是黑質、entopeduncular核及蒼白球(globus pallidus)卻無分布，而海馬中也只有Drd2而無Drd1分布⁽²⁴⁰⁾，Drd3和Drd4 在藥理與結構上與Drd2類似，Drd4分布在腦部各個區域，但是在紋狀體 的水平比Drd2低很多⁽²⁴¹⁾，Drd5在結構與藥理的相似度類似Drd1但是分 布區域較為狹隘，它只見於海馬、乳突核(lateral mammilary nucleus)、下 視丘的旁束核(parafascicular nucleus)⁽²⁴²⁾。這些多巴胺受體與疾病的關係 包括，D1類多巴胺受體除了暗示與人類精神分裂症有關⁽²⁴³⁾之外，在海 馬的prefrontal cortex區的軸突發生long-term potentiation是必須的⁽²⁴⁴⁾， Drd2可有兩面作作，可產生或是緩解焦慮⁽²⁴⁵⁾，Drd3與藥物上癮有關係

(246)，Drd5可能參與調節認知功能⁽²³⁸⁾。

由本研究結果顯示，EGb 761只有在腦部會高度上調Drd1a的表現，

在腎臟EGb 761並沒有改變Drd1a的表現，雖然過去大多的研究的進行都 是針對EGb 761在腦部及神經系統的益處，而也有少數研究是探討EGb 761在不同器官多面向的影響，例如，EGb 761減少細胞凋亡造成的睪丸 及腸子的傷害，及減少放射性碘對Grave氏症患者的基因損傷^{(247, 248,}

249)，然而，這些都是針對單一器官或組織來做研究。在我們的研究中，

腎臟的分析是為了當大腦的對照，我們並發現EGb 761在額葉皮質的基 因調控有其專一性，在腦部受EGb 761高度調控的路徑，在腎臟及紋狀 體並不會被改變，這個結果暗示EGb 761在大腦皮質有其特殊的作用。

藥用植物銀杏樹入藥的部分有銀杏葉及銀杏果，銀杏葉萃取物為本 研究的材料，而銀杏果又稱白果，是中藥裏常用的藥材之一，經研究發 現，白果的主要成分為terpene (包括ginkgolides A、 B、C、J、M和 bilobalide)，另含有ginkgolic acid，銀杏果外種皮亦含有黃酮類化合物 (ginkgetin 、 isoginkgetin 、 sciadopitysin)⁽²⁵⁰⁾ ， 並 含 有 抗 黴 菌 蛋 白 ginkbilobin-2⁽²⁵¹⁾及Co²⁺敏感的α-mannosidase⁽²⁵²⁾，由此推測白果中除了含 有部分銀杏葉的主要成分之外，並具有蛋白質類的化合物，這可能是白 果與銀杏葉具有不同功能的原因，在中藥書藉中白果並不使用在腦部疾 病，而是用於咳嗽、氣喘及腹瀉⁽¹¹⁶⁾。

在丹皮酚的研究中，我們利用操作一個在腦部廣泛存在且會活化 NF-κB的氧化傷害H2O2來研究丹皮酚的神經保護機轉⁽²⁵³⁾，在此研究中，

H2O2在低劑量濃度範圍內 (1-10 μM)會活化NF-κB，此劑量的H2O2並不 具細胞毒殺效果。在不同的細胞株中，不同濃度的 H2O2會誘發 NF-κB 活性，在人類T47D細胞株中，致死劑量(250 μM)的H2O2可誘發NF-κB活

性⁽²⁵⁴⁾，在SH-SY5Y細胞中，NF-κB活性曾被報導被不同濃度的H2O2誘

發，包括接近致死劑量的亞急性劑量(100 μM) ⁽²⁵⁵⁾與小於10 μM 的低劑

量⁽²⁵⁶⁾。在我們的研究中，我們主要探討低劑量H2O2對細胞影響的原因 是 ， 非 致 死 劑 量 的 H2O2 已 被 證 實 會 活 化 一 些 訊 號 階 梯 (signal cascade)，這些訊號階梯負責傳達對外界細胞激素、荷爾蒙、物理及化 學壓力刺激的反應⁽¹⁸⁾，低劑量H2O2對NF-κB路徑其它分子的影響也曾被 證實，在活體外(in vitro)研究中，NF-κB的上游 NF-κB inducing kinase (NIK)會被低劑量H2O2 (1-10 μM)活化⁽¹⁸⁴⁾。關於使用微陣列技術來分析 H2O2影響的基因的報導指出，致死劑量的H2O2環境會誘發extracellular signal-regulated kinase (ERK)、p53及細胞凋亡相關的基因^{(257, 258)}，而非致 死劑量的H2O2濃度則會在不同細胞株誘發NF-κB活化^{(184, 255)}，也會誘發 NF-κB相關的 Akt⁽²⁵⁹⁾、hyposiainducible factor-1⁽¹⁸⁾，及內皮一氧化氮合 成酶 (endothelial epithelial nitric oxide；eNOS)⁽²⁵⁶⁾。

在脊椎動物，NF-κB家族包含五個成員：c-Rel, RelA (or p65), RelB, NF-κB1 (或 p50) 與 NF-κB2 (or p52)， 這 五 個 成 員 以 同 型 雙 倍 體 (homodimer)或異型雙倍體(heterodimer)結合，其中最常見的是p50-p65的 異型雙倍體，這些雙倍體藉著結合到標的基因(target gene)的啟動子或增 強子(enhancer)區域上的κB位置以控制標的基因的轉錄(transcript)，在大 多數的細胞，NF-κB雙體是以不活化的潛在型態(latent form)存在，即 NF-κB雙體與抑制蛋白IκB結合，這樣的潛在型態可以讓NF-κB留在細胞 質中，避免與核酸結合⁽²⁶⁰⁾。NF-κB 的活化會從IκB的磷酸化開始，磷酸

化的IκB會被calpain蛋白酶或蛋白酶體所降解(degradation)⁽²⁶¹⁾。在此研究 中，我們使用兩種技術來證實丹皮酚可以降低H2O2誘發的NF-κB 活性，

在冷光酶活性試驗結果顯示，丹皮酚減少了NF-κB標的基因的表現，

EMSA的數據顯示丹皮酚有效抑制NF-κB結合到核酸的量，此外，西方 點墨法的結果顯示，丹皮酚減少了NF-κB轉移進入細胞核的量。前人的 研究也曾報導丹皮酚除了能夠抑制由TNF-α及trinitrobenzene sulfonic acid所誘發NF-κB活性之外⁽¹⁷⁵⁾，的及高脂肪飲食所誘發的NF-κB活性 ^(197,

199, 202)，而我們的研究是第一個證明丹皮酚能夠抑制直接由氧化壓力所

誘發的NFκB 活性，我們同時也測量丹皮酚在抑制NFκB的同時，所能夠 調節的基因轉錄情形，並且經由基因組與相關網路的分析，推測丹皮酚 在抑制NFκB活性的過程中可能通過的路徑，以及其抑制NFκB活性之後 造成的後續可能效應。寡核苷酸微陣列的分析在本研究中有KEGG路徑 與基因組分析兩種，KEGG路徑能從有組織的整體代謝基因路徑中找出 差異表達的代謝路徑，而基因組分析則是繪出經修正後統計上有意義的 被藥物影響的代謝路徑⁽²⁶²⁾。經由基因組分析被H2O2調控及被丹皮酚反 向調控的基因的結果顯示，在前10名丹皮酚可以調控的基因組裏，mature T cell-up-regulated基因組丹皮酚最顯著調控的基因組，這個基因組中的 基因為專門在成熟T細胞表現的基因⁽²⁶³⁾，另外，hypoxia up-regulated與 HIF1 target這兩個基因組也明顯被丹皮酚調控，這兩個基因組中的基因

包含細胞處於氧氣不足時，細胞對缺氧狀況調節的反應基因^{(211, 212)}，其 中Hypoxia inducible factor 1 (HIF1) 是細胞接受氧化壓力像是H2O2時的

調節基因⁽²⁶⁴⁾，而且它也受到NF-κB的調控⁽²⁶⁵⁾，另外，Jun N-terminal kinase

(JNK)路徑相關基因也被丹皮酚調控，JNK是細胞內的一個重要訊號分 子，外來的氧化壓力、缺血與紫外線都可將它活化^{(266, 267)}。在前面提及 的基因組中，JNK與HIF1的活化曾被證實與NF-κB相關，JNK是NF-κB

(JNK)路徑相關基因也被丹皮酚調控，JNK是細胞內的一個重要訊號分 子，外來的氧化壓力、缺血與紫外線都可將它活化^{(266, 267)}。在前面提及 的基因組中，JNK與HIF1的活化曾被證實與NF-κB相關，JNK是NF-κB