一、 Cell proliferation assay
目前許多中草藥開發成為抗癌藥物之研究，其初步大量篩選皆是利用此方法。
以細胞體外培養的方式，可以簡便的篩選藥物對腫瘤細胞具毒性的物質。首先將
細胞種植在96 孔盤，不含槲皮素的培養液當作控制組，在含有各濃度的槲皮素的
培養液培養24、48、72 小時，讓細胞生長並用顯微鏡觀察。利用 AlamarBlue 試劑 在570nm 量測吸光值，以評估細胞的存活度。從結果可以發現槲皮素能有效抑制 細胞的增殖，並呈現劑量依賴性。我們將讀取的吸光值做統計分析，各個劑量的 的數據均表示成mean±SD，並與控制組作 t-test，P<0.05 視為有顯著意義(*代表 P<0.05；**代表 P<0.001)。
Fig. 9 (A)、Fig. 10 (A)分別代表 Hep3B、Huh7 在槲皮素各濃度(0、10、50、100、
200、500μM)培養 48 小時顯微鏡下(10X)的情形。從照片中可以很明顯看出槲皮濃 度越高，Hep3B 和 Huh7 的細胞增殖抑制效果越明顯。Fig. 9 (B)、Fig. 10 (B)分別 代表槲皮素濃度與Hep3B、Huh7 細胞存活度的關係圖。從圖中可以發現兩株細胞 的存活度都與槲皮素劑量呈現依賴性的關係，濃度越高，細胞存活度越低。Hep3B 在槲皮素濃度200μM、72hr 開始有顯著效果(存活度 86.9%)，濃度 500μM 時，在 三個時間點24、48、72hr 皆有明顯效果(存活度 72.7、57.13、46.8%)，尤其在 72hr 效果最為顯著。而Huh7 在槲皮素濃度 50μM、24 及 48hr 即開始有顯著效果(存活 度87.9、80.9%)，濃度在 100、200、500μM 時，在三個時間點(24、48、72hr)皆有 明顯效果(100μM 三個時間點存活度分別為 82.6、73.9、96.4%；200μM 三個時間 點存活度分別為75.9、72.9、86.9%；500μM 三個時間點存活度分別為 72.6、54.9、
46.8%)，尤其在 200μM，48、72hr 以及 500μM，24、48、72hr 效果最為顯著。相 較之下，槲皮素對Huh7 的細胞增殖整體抑制效果較 Hep3B 佳。
32
二、 Colony formation assay
在此方法中，目的是在研究槲皮素對人類肝癌細胞株colony 形成的能力。首 先將細胞種植在六孔盤，不含槲皮素的培養液當作控制組，在含有各槲皮素濃度 的培養液中生長十天，使細胞菌落發展。發現槲皮素能有效抑制細胞的菌落生長，
並呈現劑量依賴性。我們將Colony 的數目做量化統計分析，各個劑量的的數據均 表示成mean±SD，並與控制組作 t-test，P<0.05 視為有顯著意義(*代表 P<0.05；**
代表P<0.001)。
Fig. 11 (A)、Fig. 12 (A)分別代表 Hep3B、Huh7 在槲皮素各濃度(0、1、5、10、
50、100μM)，被 Crystal violet 所染色的 Colny 影像圖。從圖中可以看出槲皮素濃 度越高，兩株細胞形成的colony 數目就明顯越少。而 Fig. 11 (B)、Fig. 12 (B)分別 代表Hep3B、Huh7 的 colony 數目與槲皮素濃度的關係圖。從圖中可以發現，藥物 濃度越高，Hep3B 及 Huh7 的 colony 的數目就越少，表示藥物槲皮素的濃度跟形 成colony 的數目呈現一定依賴性的關係。濃度在 0、1、5、10、50、100μM 時 colony 數分別為302、296、288、283、224、129 個。而 Hep3B 在藥物濃度 50μM 時有顯 著抑制細胞colony 的形成效果(占控制組 74.1%)，藥物濃度為 100μM 時最為顯著(占 控制組42.7%)，對控制組而言減少一半以上的 colony 形成。而 Huh7 效果較 Hep3B 好，濃度在0、1、5、10、50、100μM 時 colony 數分別為 246、237、234、214、
190、76 個。在 10、50μM 即有顯著效果(占控制組 86.9、77.2%)，一樣在藥物濃度 為100μM 時最為顯著(占控制組 30.8%)，跟控制組相比，只剩下三分之一不到的 colony 形成。
三、 Wound-healing assay
此方法簡單，便宜，是最直接研究體外細胞移動的方式。這種方法模擬體內 傷口癒合中的細胞移動情形。目的是在研究槲皮素對人類肝癌細胞株migration 的
33
能力。首先將細胞種植在六孔盤，等待其長滿後，用tip 的尖端在單層細胞上建立 一個傷口，加入各濃度的槲皮素，並在細胞移動過程中定期觀察照相，並比較圖 像，量化細胞移動速率做統計分析。數據均表示成mean±SD，實驗組(100μM)與 控制組作t-test，P<0.05 視為有顯著意義(*代表 P<0.05；**代表 P<0.001)。
Fig. 13 (A)、 Fig. 14 (A) 分別代表 Hep3B、Huh7 在槲皮素濃度 100μM 與控制 組傷口寬度與時間(0、24、48hr)的影像圖。從圖中可以發現，Hep3B 及 Huh7 在 48 小時候，控制組與實驗組在傷口的寬度上都有些微差距，但 Huh7 較為明顯，
表示槲皮素對兩株細胞均有抑制細胞移動之效果，而且對Huh7 抑制效果較好。Fig.
13 (B)、Fig. 14 (B) 分別代表 Hep3B、Huh7 在槲皮素各濃度(0、10、50、100μM) 與時間(0、12、24、36、48hr)與寬度的關係圖。從關係圖中可以發現，濃度 100μM，
Hep3B 在四個時間點與控制組的距離為 12、27.8、24.78、22.9%；Huh7 為 13.1、
16.3、30、34.9%。槲皮素對兩株細胞同樣在濃度 100μM、12 小時即有顯著抑制細 胞移動效果，36 及 48 小時候效果最為顯著。
四、 Flow cytometry assay
Propidium iodide(PI)是核酸染劑，若單一細胞中核酸含量愈高，則與此類螢光 物質結合的量也愈高，因而受雷射激發後產生的螢光強度也就愈強。此實驗目的 就是利用此性質，用螢光強度來決定核酸量因凋零死亡時核酸量減少的變化，來 判斷細胞是否正處於細胞凋亡狀態，以及了解槲皮素對整個細胞週期調控的影響。
首先將Huh7 種植在六孔盤，加入各濃度槲皮素(0、10、50、100μM)，培養 48 小 時候將細胞打下，用Cold Ethanol fix overnight，在加入 PI 染劑，用流式細胞儀分 析。數據均表示成mean±SD，並將實驗組與控制組作 t-test，P<0.05 視為有顯著意 義(*代表 P<0.05；**代表 P<0.001)。
Fig. 15 (A)、Fig. 16 (A)分別為槲皮素對 Hep3B、Huh7 經流氏細胞儀分析後各 phase 的分佈圖。其中 Pre-G0 phase 代表細胞正處於細胞凋亡狀態。槲皮素濃度 0、
34
10、50、100μM 時，Hep3B 在 Pre-G0 phase 分別為 1.4%、1.68%、2.88%、5.02%，
Huh7 為 9.37%、28.06%、60.93%、67.69%。在 G1 phase 方面，槲皮素濃度 0、10、
50、100μM 時，Hep3B 分別為 61.44%、56.7%、56.05%、53.14%；Huh7 為 44.13%、
30.06%、11.77%、11.22%。在 S phase 方面，槲皮素濃度 0、10、50、100μM 時，
Hep3B 分別為 14.86%、14%、14.03%、13.81%；Huh7 為 16.87%、10.87%、6.15%、
5.63%。在 G2/M phase 方面，槲皮素濃度 0、10、50、100μM 時，Hep3B 分別為 23.4%、28.53%、28.07%、29.69%；Huh7 為 29.63%、31.39%、21.63%、15.99%。
整體來看，槲皮素的濃度提高會造成Pre-G0 phase 的上升，G1、S phase 的減少，
表示槲皮素對兩株細胞均有濃度與凋亡率、G1 phase、S phase 的依賴關係。由 Fig.
15(B)、Fig. 16(B) 可得知槲皮素對 Hep3B 在濃度 50μM 開始有促進細胞凋亡顯著 效果，在100μM 有抑制 G1 phase 效果。而 Huh7 在濃度 10μM 時就有細胞凋亡顯 著效果，50、100μM 的效果更好，以及在濃度 10μM 以上可顯著抑制 G1 phase，
在濃度50μM 以上可顯著抑制 S phase。
五、 Microarray analysis
基因晶片，是近年來生命科學研究的一大利器。它可經由一次實驗，得到生物 體所有基因表現量的數據。本實驗目的在於，由基因表現的觀點來探討槲皮素對 人體肝癌細胞的基因變化，瞭解槲皮素對人類肝癌細胞能有效抑制背後的藥理機 轉。首先先將人類肝癌細胞株Huh7 種植在 10cm dish，加入濃度 50μM 的槲皮素 培養48 小時(濃度 0μM 當作控制組)，在將細胞打下加入 Trizol 後送至賽亞基因科 技公司作RNA 萃取及微陣列分析。
Fig. 17 為控制組與實驗組萃取出來的 RNA 電泳圖。圖中 18S 與 28S RNA 的 band 清晰明顯。而且在 Fig. 18 圖中控制組與實驗組的 RIN(RNA Integrity Number ) 值高達9.8 及 9.5(10 為 RNA 完整性最好、.0 為最差)，表示萃取出來的 RNA 的品
35
質很高，完整性佳。Fig. 19 為Labeled aRNA 的 Quality 檢測，控制組於實驗組 OD 260/280 值分別為 1.95、1.97(需介於 1.8─2.0)，濃度分別為 1.5463μg/μl、1.3198μg/μl。
Fig. 20 及 Fig. 21 分別為控制組(Huh7-0)與實驗組(Huh7-50)雜交完後微陣列的影 像。
基因晶片的數據十分龐大，為減低分析的複雜度，兼顧通盤了解槲皮素對於人 類肝癌細胞的機轉，我們選擇兩倍上調與兩倍下調的基因作Ontology 分析，以 Biological process 與 Molecular function 的分組，從中挑選與 Apoptosis、Cell cycle、
Migration 有關的基因做初步探討。Table. 1 為槲皮素上調 2 倍以上 Apoptosis 相關 基因，被調控的基因分別為IGFBP3、CAV1、FOSL1、LGALS1、PMAIP1、ETS1、
C8orf4、SOX4、TNFRSF12A、EGLN3、SOS1、SERPINE1、TNFSF9、TNFRSF21、
SOCS2、PHLDA2、BCL2L11、ANGPTL4、GCLC、BEX2、IER3、SH3RF1、BIRC3、
GCLM、ADM、DUSP6、BIK、MCL1、DUSP6、BMP2、KRT20、DUSP6、MAX、
SQSTM1、ABR、AMIGO2、DDIT3、SOD2、PHLDA1、TSPO、EPHA2、FOXC1、
NR4A1、FGF2、TNFRSF10A、DFFA、F3、TGFA。Table. 2 為槲皮素上下調 2 倍 以上Apoptosis 相關基因，被調控的基因分別為 IGF2、B4GALT1、MAGED1、PRLR、
PCSK9、PLG、TNFSF10、F7、KNG1、LCN2、COL2A1、GSN、FAM3B。Table.
3 為槲皮素上調 2 倍以上 Cell cycle 相關基因，被調控的基因分別為 CYP1A1、
CDKN2B、C13orf15、FOSL1、ETS1、DST、RGS2、NEDD9、CDKN1C、BEX2、
PLK2、BMP2、DDIT3、TRNP1、FOXC1、FGF2、NOLC1。Table. 4 為槲皮素下 調2 倍以上 Cell cycle 相關基因，被調控的基因分別為 CASC5、MCM6、G0S2。
Table. 5 為槲皮素上調 2 倍以上 Cell migration 相關基因，被調控的基因分別為 IGFBP3、TNFRSF12A、SERPINE1、SERPINE2、TUBB2B、JAG1、HBEGF、CTGF、
ITGA2、VCAN、EPHA2、CEACAM1、FOXC1、FGF2、TRIB1、F3。Table. 6 為 槲皮素下調2 倍以上 Cell migration 相關基因，GAB1、AMOT、IGF2、B4GALT1、
SUN2、APOA1、F7、APOA1、VTN。
36 彙結構來描述基因的三個層面：Molecular Function、Biological Process 和 Cellular Component。Molecular Function 是以分子的角度，描述基因產物的活動，例如催化
（catalytic activity）或轉錄調控（transcription regulator activity）等；Biological process 則是描述在細胞內發生的，可以定義開始和結束的事件或行動；Cellular Component 表示細胞的某個部分或位置，該分支裡面的字彙用來描述基因在細胞的哪個位置 發揮它的功能。應用此資料庫，我們可快速的歸納基因晶片的資料，做初步機轉 探討。對於槲皮素作用於Huh7 的微陣列分析結果，我們首先採取 2 倍上調與 2 倍 下調以上的基因作ontology 分析，以 Biological process 與 Molecular function 的分 組，從中挑選與Apoptosis、Cell cycle、Migration 有關的基因做初步討論。
有關癌症與細胞凋亡的相關研究，顯示癌症的發生是由於癌細胞無法正常的 進行細胞凋亡(apoptosis)，造成漫無止境的大量增生，而妨礙到正常的細胞生理機 能，因此細胞凋亡、不受控制的增生與癌症關係成為相當熱門的研究課題。在槲 皮素影響Apoptosis 的兩倍上調基因裡，最突出的基因為 IGFBP3，上調了 8.53 倍，
其基因產物為類胰島素生長因子結合蛋白3(insulin-like growth factor binding protein 3)，Lee KW 等人發現，IGFBP3 藉由與 retinoid X receptor-alpha (RXRalpha) 結合後，RXRalpha 的結合伙伴核受體 Nur77 會迅速從細胞核易位到粒腺體啟動凋 亡級聯反應，造成caspase 的激活[82]，誘導細胞產生凋亡。另外上調7.52 倍的 CAV1 及2.23 倍的 SOD2，Trimmer C 等人發現這兩個基因在基質微環境(stormal
microenviroment)中有腫瘤抑制功能。缺乏 CAV1 的成纖維細胞會促進乳癌細胞 (MDA-MB-231)的腫瘤生長，而 SOD2 的過度表達可以抑制缺少 CAV1 的成纖維細