1. Xanthohumol 對血小板凝集和 ATP 釋放反應的影響
在人類血小板懸浮液中，xanthohumol (0.5-10 μM)與人類血小板 懸浮液溫浴三分鐘後，會隨著濃度的增加，能有效抑制 collagen (1 μg/ml)所引發的血小板凝集反應，其 IC50和max concentration 分別是 1.5 和 3 μM；xanthohumol 也會隨著濃度的增加，能有效抑制 arachidonic acid (60 μM)所引發的血小板凝集反應，其 IC50 和 max concentration 分別是 3.5 和 5 μM；但是 xanthohumol (0.5-10 μM)對於 U46619 (1 μM)、thrombin (0.05 U/ml)引起的血小板凝集則沒有抑制 作用(Figure. 2 與 3)。Xanthohumol 對於 collagen (1 μg/ml)的抑制效用
較強且對其所引發的 ATP 釋放反應也是呈現濃度相關的抑制作用
(Figure. 4)。Xanthohumol (3 μM)與 platelet-rich plasma 溫浴三分鐘後，
對於collagen (1 μg/ml)所引發的血小板凝集反應不會有抑制作用，但 加大xanthohumol 濃度到 35-70 μM 後，對於 collagen (1 μg/ml)所引發 的血小板凝集反應則會有抑制作用(Figure. 5)。
2. Xanthohumol 對血小板細胞內鈣離子濃度變化的改變
當血小板受到活化劑刺激後，可藉由鈣離子內流(influx)以及移動
(mobilization)而使細胞內鈣離子濃度增加。Collagen 是一種很強的血 小板活化劑，即具有上述之作用進而增加血小板細胞內鈣離子的濃 度 。 因 此 本 實 驗 以 collagen (1 μg/ml) 作 為 血 小 板 活 化 劑 ， 當 xanthohumol 以 1.5 和 3 μM 與預先經由 Fura 2-AM 處理的血小板懸浮 液溫浴三分鐘後，再投以collagen (1 μg/ml)刺激，均可發現細胞內鈣 離子的增加濃度受到抑制(Figure. 6)，xanthohumol (1.5 和 3 μM)的抑
制程度分別為50.82 ± 9.51 %和 66.49 ± 9.64 %(Figure. 7)。由此可知，
xanthohumol 會抑制 collagen 所引起的血小板細胞內鈣離子濃度的增 加。
3. Xanthohumol 對 FITC-triflavin 與血小板 glycoprotein IIb/IIIa complex 結合的影響
Triflavin 為日本屬龜殼花(Trimeresurus flavoviridis)的蛇毒原液中
純化出來的蛋白，其結構中包含一段 RGD 序列，能與血小板上
glycoprotein IIb/IIIa complex 結合的(Sheu et al., 1992b)。將 triflavin 以 FITC 標定，使用 flow cytometer 測量 FITC-triflavin 發出的螢光強度 來評估xanthohumol 對 triflavin 結合到 glycoprotein IIb/IIIa complex 的 影響，結果顯示為刺激的血小板所測得 FITC-triflavin 之螢光值為 26.84 ± 0.5 (Figure. 8A)；當加入 EDTA 徹底影響 glycoprotein IIb/IIIa
complex 構型後，所測得螢光值為 9.68 ± 0.51 (Figure. 8B) ；分別加 入不同濃度的xanthohumol (1.5 和 3 μM) 所測得 FITC-triflavin 結合 到glycoprotein IIb/IIIa complex 之螢光值分別為 26.78 ± 0.58 與 27.96
± 0.65 (Figure. 8C 與 D)，表示 xanthohumol 無法有意義的抑制或干擾 FITC-triflavin 與血小板上 glycoprotein IIb/IIIa complex 的結合，代表 xanthohumol 抑 制 血 小 板 凝 集 的 作 用 並 非 經 由 活 化 glycoprotein IIb/IIIa complex。
4. Xanthohumol 對 PLCγ2 磷酸化的影響
利用western blotting 的技術，以及利用抗體認出 PLCγ2 磷酸化 的情形。由實驗結果顯示(Figure. 9)，在血小板未刺激的情況下只有 少許PLCγ2 磷酸化的發生(lane 1)；若加入 collagen (1 μg/ml)可明顯地 看到 PLCγ2 磷酸化(lane 2)；若是分別加入 xanthohumol (1.5 和 3 μM)
可觀察到PLCγ2 磷酸化明顯的受到抑制(lane 3 與 4)，且呈現與濃度 相關的抑制情形。
5. Xanthohumol 對 47 kDa 蛋白質磷酸化(47 kDa protein phosphorylation)的影響
當 protein kinaase C(PKC)被活化後，能使其受質(47 kDa protein)
磷酸化，本實驗即利用 Western blot 來測定 xanthohumol 對 47 kDa protein phosphorylation 抑制的情形。由 Figure. 10 可知，未活化的血 小板明顯可見在 47 kDa 的位置只有微量的蛋白質磷酸化發生(lane 1)；若以 collagen (1 μg/ml)當作刺激劑活化 PKC，明顯可見在 47 kDa 的位置上有蛋白質磷酸化的情形(lane 2)；當投與 xanthohumol (1.5 和 3 μM)與血小板懸浮液溫浴三分鐘後，再加入 collagen (1 μg/ml)刺激 劑，可發現47 kDa protein phosphorylation 明顯的受到抑制(lane 3 和 4)，且呈現與濃度相關的抑制情形。
6. Xanthohumol 對 protein kinaase C 活化劑(PDBu)所引起 的 47 kDa 蛋白質磷酸化與血小板凝集反應的影響
PDBu是protein kinase C的活化劑，亦可引起血小板凝集反應 (Kraft and Anderson, 1983; Niedel et al., 1983; Siess and Lapetina, 1989)。本實驗中，預先在人類血小板懸浮液中加入xanthohumol (1.5 和3 μM)溫浴三分鐘，再給予PDBu (150 nM)作為刺激，藉此觀察 xanthohumol是否會抑制PDBu誘發的凝集反應。結果由Figure. 11表 示，在未活化的血小板懸浮液中，在47 kDa的位置只有微量的蛋白質 磷酸化發生(lane 1)；若以PDBu (150 nM)當作刺激劑活化PKC，明顯 可見在47 kDa的位置上有蛋白質磷酸化的情形(lane 2)；若投與
xanthohumol (1.5和3 μM)與血小板懸浮液溫浴三分鐘後，再加入PDBu (150 nM)刺激劑，可發現47 kDa protein phosphorylation不會受到抑制 (lane 3和4)。另外利用PDBu (150 nM)為刺激劑所誘發的血小板凝集反 應的結果發現，xanthohumol無法抑制PDBu所誘發的血小板凝集反 應，結果由Figure. 12表示，同時也驗證了Figure. 11的結果。
7. Xanthohumol 對 MAPKs family 磷酸化的影響
Mitogen-activated protein kinases(MAPKs)為細胞對外界刺激反應 作用後之重要訊息介質，在體內訊息傳遞中扮演相當重要的角色。
Collagen 可以引起 mitogen-activated protein kinases(MAPKs)的活化 (Borsch-Haubold et al., 1995)，血小板內的 MAPKs 包括 p38 MAPK、
the extracellular signal-regulated kinase(ERKs)與 Jun N-terminal kinase (JNK)(Papkoff et al., 1994; Nadal et al., 1997; Bugaud et al., 1999)。本實 驗以西方墨點法(western blotting)的技術，以及利用抗體認出 p38 MAPK、ERKs 和 JNK 的位置來評估 MAPKs family 磷酸化的情形。
由Figure. 13 顯示實驗結果 ，在血小板未刺激的情況下只有少許 p38 MAPK 磷酸化的發生(lane 1)；若加入 collagen (1 μg/ml)可明顯地看 到p38 MAPK 磷酸化(lane 2)；若是分別加入 xanthohumol (1.5 和 3 μM) 溫浴三分鐘後再加入collagen (1 μg/ml)，可發現 p38 MAPK 磷酸化明
顯的受到抑制(lane 3 與 4)。由 Figure. 14 顯示，在血小板未刺激的情 況下只有少許ERKs 磷酸化的發生(lane 1)；若加入 collagen (1 μg/ml) 可明顯地看ERKs 磷酸化(lane 2)；若是分別加入 xanthohumol (1.5 和 3 μM)之後用 collagen (1 μg/ml)作刺激，可觀察到 ERKs 磷酸化明顯的 受到抑制(lane 3 與 4)。由 Figure. 15 顯示，在血小板未刺激的情況下 只有少許JNK 磷酸化的發生(lane 1)；若加入 collagen (1 μg/ml)可明顯 地看JNK 磷酸化(lane 2)；若是分別加入 xanthohumol (1.5 和 3 μM)之 後用collagen (1 μg/ml)作刺激，可觀察到 JNK 磷酸化明顯的受到抑制 (lane 3 與 4)，且呈現與濃度相關的抑制情形。
8. Xanthohumol 對 Akt 磷酸化的影響
利用 western blotting 的技術，以及利用抗體認出 Akt 磷酸化的情 形。由實驗結果顯示(Figure. 16)，在血小板未刺激的情況下只有少許 Akt 磷酸化的發生(lane 1)；若加入 collagen (1 μg/ml)可明顯地看到 Akt 磷酸化(lane 2)；若是分別加入 xanthohumol (1.5 和 3 μM)可觀察到 Akt 磷酸化明顯的受到抑制(lane 3 與 4)，且呈現與濃度相關的抑制情形。
9. Xanthohumol 對 血 小 板 細 胞 內 vasodilator-stimulated
phosphoprotein 的影響
VASP(vasodilator-stimulated phosphoprotein)是一種具有調節性 抑制血小板活化作用的內生性蛋白質，它主要的功能是防止過度的凝 集反應發生，一些強力的血小板活化劑或是NO donor 都會造成 VASP 的活化，例如 thrombin 與 nitroglycerin(NTG)。而 VASP 的磷酸化在 血小板中主要受到 cGMP 跟 cAMP 的調控，也就是當血小板細胞內 cGMP 或 cAMP 的濃度增加時，會促使 VASP 磷酸化，進而對過度的 血小板凝集反應產生抑制作用(Li et al., 2003)。根據 O’Brien 和 Born 等 人(O'Brien J, 1962; Born and Cross, 1963) 之 混 濁 測 定 法 ， 以 Lumi-aggregometer (Payton, Canda)測量。由結果發現，血小板懸浮液 與xanthohumol (3 μM)溫浴三分鐘後用 collagen (1 μg/ml)作刺激，血 小板的凝集會受到抑制；若預先與guanylate cyclase 抑制劑 ODQ (40 μM) 和 adenylate cyclase 抑制劑 SQ22536 (200 μM) 溫浴三分鐘，再
加入xanthohumol (3 μM)溫浴三分鐘後用 collagen (1 μg/ml)作刺激，
則血小板的凝集反應沒有恢復(Figure. 17)。代表 xanthohumol 抑制血 小板凝集的機轉不經由cGMP 和 cAMP 引起的 VASP 路徑。
10. Xanthohumol 對血小板細胞釋放 NO 的影響
當血小板受到一些活化劑刺激後，會引起 NO 的釋放，繼而活 化了 guanylate cyclase 來調控血小板的功能，collagen 可藉由活化細
胞內的 NOS 而引起 NO 釋放之增加(Radomski et al., 1990b; Radomski et al., 1990a; Radomski et al., 1991; Chiang et al., 2001)。由結果(Table.
1)可知，collagen (1 μg/ml)作用於血小板後，可使 NO 的含量由 0.5 ± 0.1 μM 有意義地增加到 2.5 ± 0.6 μM；而當我們加入不同濃度的 xanthohumol (1.5 和 3 μM)與血小板懸浮液反應三分鐘，發現 NO 的含
量沒有增加，分別為0.6 ± 0.02 及 0.9 ± 0.2 μM，代表 xanthohumol 不 會刺激血小板細胞產生NO。
11. Xanthohumol 對血小板細胞內自由基釋放反應的影響
研究指xanthohumol 具有抑制發炎和血小板活化反應的作用，而 發炎反應與血小板活化的過程都與自由基的產生有相當大的關聯，意 味著抑制自由基的產生似乎可影響血小板的活化。本實驗就以電子順 磁共振儀(electron spin resonance, ESR)直接分析血小板受 collagen 刺 激活化後所釋放之hydroxy radical (OH
.
)是否會被 xanthohumol 抑制。
由Figure. 18 可知，resting 狀態下並沒有 hydroxy radical 產生(Figure.
18A)；血小板受到 collagen (1 μg/ml)刺激之後，會釋放出 hydroxy radical(Figure. 18B)。若預先分別加入 xanthohumol (1.5 和 3 μM)反應 三分鐘，再以collagen (1 μg/ml)刺激血小板，可觀察到 hydroxy radical 的產生明顯地被xanthohumol 抑制(Figure. 18C 與 D)。由結果發現
xanthohumol 具有自由基清除的抗氧化功效。
12. Collagen 引起 p38、PKC、Akt 蛋白活化的訊息路徑
我們已知當血小板活化時，分別會去活化p38、PKC、Akt 這三 個蛋白的表現量，我們想了解這三者之間的訊息路徑關係，測量方法 如＂實驗材料與方法＂中提及。由Figure. 19 可知，預先與 PKC 抑制 劑Ro318220 (10 μM)溫浴三分鐘，再用 collagen (1 μg/ml)作刺激，PKC 的蛋白表現量和單純使用collagen 刺激的情況下相比會大量減少，預 先與p38 抑制劑 SB203580 (2 μM)與 Akt 抑制劑 Ly294002 (10 μM)溫 浴三分鐘，再用 collagen (1 μg/ml)作刺激，PKC 的蛋白表現量和單純 使用collagen 刺激的情況下相比沒有大太差異；由 Figure. 20 可知，
預先與PKC 抑制劑 Ro318220 (10 μM) 溫浴三分鐘，再用 collagen (1 μg/ml)作刺激，p38 的蛋白表現量和單純使用 collagen 刺激的情況下
相比沒有大太差異，預先與p38 抑制劑 SB203580 (2 μM)與 Akt 抑制 劑Ly294002 (10 μM)溫浴三分鐘，再用 collagen (1 μg/ml)作刺激，p38 的蛋白表現量和單純使用collagen 刺激的情況下相比則會有意義的減 少；由Figure. 21 可知，預先與 PKC 抑制劑 Ro318220 (10 μM) 溫浴 三分鐘，再用collagen (1 μg/ml)作刺激，Akt 的蛋白表現量和單純使 用collagen 刺激的情況下相比沒有大太差異，預先與 p38 抑制劑
SB203580 (2 μM)與 Akt 抑制劑 Ly294002 (10 μM)溫浴三分鐘，再用 collagen (1 μg/ml)作刺激，Akt 的蛋白表現量和單純使用 collagen 刺激 的情況下相比會有意義的降低。