Taipei Medical University Institutional Repository:Item 987654321/4223
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(2) 目錄 中文摘要………………………………………………1 英文摘要………………………………………………3 縮寫表…………………………………………………5 一. 緒論 1-1 研究背景…………………………………… 8 1-2 研究動機……………………………………29 1-3 研究範圍……………………………………30 二. 實驗材料與方法 2-1 實驗材料……………………………………31 2-2 實驗方法……………………………………36 2-3 數據分析……………………………………47 三. 結果 ……………………………………………48 四. 討論及未來展望 ………………………………58 五. 結論 ……………………………………………68 六. 表 ………………………………………………69 七. 圖 ………………………………………………70 八. 參考文獻 ………………………………………92. 2.
(3) 中文摘要. 黃腐醇(xanthohumol)是啤酒花(Humulus lupulus)的類黃酮類成分 之一，由目前的研究指出 xanthohumol 有神經鎮定、抗癌、抗氧化、 抗菌以及腸胃道反應等藥理作用；而 xanthohumol 可以有效抑制細胞 啟始(initiation)和增生(proliferation)，目前的研究都集中在其抗癌和抗 氧化方面的活性，然而 xanthohumol 在血小板上的藥理學功效尚未明 確，因此我們有意探討 xanthohumol 在血小板活化過程中，對於訊息 傳遞方面的抑制作用。 研究結果顯示，xanthohumol隨著濃度的增加(0.5-10 μM)，能有 效抑制collagen (1 μg/ml)、arachidonic acid (60 μM)所引發的血小板凝 集反應；xanthohumol (1.5和3 μM)可顯著抑制collagen (1 μg/ml)引起的 細胞內鈣離子移動和ATP釋放反應。Xanthohumol (1.5和3 μM)會抑制 collagen (1 μg/ml)誘發的PLCγ2蛋白磷酸化反應。Collagen (1 μg/ml)和 PDBu (150 nM)可以誘發細胞內protein kinase C的活化，並且將47 kDa 位置的蛋白磷酸化，實驗發現xanthohumol (1.5和3 μM)只可抑制 collagen (1 μg/ml)引起的p47 protein的磷酸化，對於PDBu (150 nM)所 引起的p47 protein磷酸化則沒有抑制作用。另外xanthohumol (1.5和3 μM) 可 抑 制 collagen (1 μg/ml) 引 起 的 mitogen-activated protein.
(4) kinases，如p38、ERK與JNK protein的磷酸化以及Akt的蛋白磷酸化。 Xanthohumol (1.5和3 μM)可抑制collagen (1 μg/ml)所引起的自由基產 生。此外，xanthohumol (1.5和3 μM)並不會增加細胞內nitric oxide產 生量，也不會透過vasodilator-stimulated phosphoprotein(VASP)磷酸化 反應而抑制血小板凝集反應。 實驗結果證實，xanthohumol抑制血小板活化的作用可能涉及以 下路徑：xanthohumol會抑制PLCγ2與protein kinase C的活性及47 kDa protein 的 磷 酸 化 。 Xanthohumol 會 抑 制 mitogen-activated protein kinases，如p38、ERK與JNK protein的磷酸化；xanthohumol會抑制Akt 的蛋白磷酸化。同時，xanthohumol可有效抑制血小板活化時產生的 hydroxyl radical。以上這些結果會導致xanthohumol抑制血小板細胞內 鈣離子的移動以及濃度的增加，最後抑制血小板的凝集反應。此研究 意味著xanthohumol的研究可應用在治療與血小板過度活化相關之疾 病。. 2.
(5) Abstract. Xanthohumol is one of the major constituents of Humulus lupulus. Xanthohumol has been reported to have sedative property, estrogenic activity, cancer-related bioactivities, antioxidant activity, stomachic effect, antibacterial and antifungal effects in recent studies. However, the pharmacological functions of xanthohumol on platelets were not yet understood, we are interested in investigating the inhibitory effects of xanthohumol on cellular signal transduction during the process of platelet activation. In this study, xanthohumol concentration-dependently (0.5-10 μM) inhibited collagen (1 μg/ml)- and arachidonic acid (60 μM)-induce platelet aggregation in washed human platelets. In addition, xanthohumol (1.5 and 3 μM) markedly inhibited collagen (1 μg/ml)-induce intracellular Ca2+ mobilization and ATP release. Phosphorylation of p47, a marker of protein kinase C activation, was triggered by collagen (1 μg/ml) and PDBu (150 nM). In our experiments, xanthohumol (1.5 and 3 μM) significantly inhibited phosphorylation of p47 stimulated by collagen (1 μg/ml) but not by PDBu (150nM). In addition, xanthohumol 3.
(6) (1.5 and 3 μM) reduced phosphorylation of MAPK and Akt stimulated by collagen (1 μg/ml) in human platelets. On the other hand, xanthohumol (1.5 and 3 μM) also inhibited collagen (1 μg/ml)-induced hydroxy radicals in human platelets. Neither nitric oxide formation nor vasodilator-stimulated phosphoprotein was induced by xanthohumol in platelets. In conclusion, our study suggested that the possible pathways of anti-platelet activity of xanthohumol may involve in the following： xanthohumol may regulate the PLCγ2-PKC pathway and inhibit the MAPK and Akt protein phosphorylation. Xanthohumol may inhibit hydroxyl radicals induced by collagen (1 μg/mL). Taken together, xanthohumol regulated these pathways to inhibit the intracellular Ca2+ mobilization and platelet aggregation. Therefore, xanthohumol may be used as an effective tool in treating pathological disorder associated with platelet hyperaggregability.. 4.
(7) 縮寫表. AA：arachidonic acid AC：adenylate cyclase A.C.D.：citric acid / sodium citrate / glucose ADP：adenosine 5‘-diphosphate ATP：adenosine 5‘-triphosphate BSA：bovine serum albumin cyclic AMP：cyclic 3’, 5’-adenosine monophosphate cyclic GMP：cyclic 3’, 5’-guanylate monophosphate COX：cyclooxygenase cPLA2：cytosolic phospholipase A2 CYP450 3A4：cytochrome P450 3A4 DAG：1, 2-diacylglycerol DPH：diphenylhexatriene EDTA：ethylenediamine tetraacetic acid ERK：extracellular signal regulated kinase FITC：fluorescein iso-thiocyanate Fura 2-AM：Fura 2-acetoxymethyl ester. 5.
(8) GC：guanylate cyclase IP3：inositol 1,4,5-trisphosphate JNK：c-Jun-NH2-terminal kinase LDL：low-density lipoprotein MAPK：mitogen actived protein kinase PAF：platelet-activating factor PAGE：polyacrylamide gel electrophoresis PC：phosphatidylcholine PDBu：phorbol-12,13-dibutyrate PDE：phosphodiesterases PE：phosphatidylethanolamine PGD2：prostaglandin D2 PGE1：prostaglandin E1 PGE2：prostaglandin E2 PGH2：prostaglandin H2 PGI2：prostaglandin I2 PKC：protein kinase C PLC：phospholipase C PPP：platelet-poor plasma. 6.
(9) PRP：platelet-rich plasma PS：platelet suspension SDS：sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE：sodium sulfate-polyacylamide gel electrophoresis TxA2：thromboxane A2 TxB2：thromboxane B2 U46619：9,11-dideoxy-9 α,11α-methanoepoxy PGF2a VASP：vasodilator-stimulated phosphoprotein vWF：von Willebrand factor. 7.
(10) 一. 緒論. 1-1 研究背景 啤酒花(Humulus lupulus) 啤酒之生產，可追溯到四千年前埃及的古文明，是一種具長遠歷 史而廣為接受的一種飲料。啤酒的主要原料是大麥芽、啤酒花、酵母、 水。適度飲酒對心血管的保護作用已經被許多研究證實(Rayo Llerena and Marin Huerta, 1998; Samanek, 2000)，抗粥狀動脈硬化與提加高密 度脂蛋白(HDL)被認為是飲用酒類可保護冠狀動脈硬化的最可能機 轉。其他可能的機轉還有抑制血小板的活性，包含抑制凝血功能和血 栓形成，以達心血管的保護作用(Constant, 1997; de Gaetano et al., 2003)。 啤酒花(Hop)，又名忽布子，學名為 Humulus lupulus，是一種蔓 藤性植物，啤酒花的雌株花序在製造啤酒的過程中是必備的成分，用 來 增 加 啤 酒 的 風 味 和 穩 定 製 程 中 的 泡 沫 產 生 (Vanhoecke et al., 2005)。在啤酒的製程中，啤酒花與麥汁混合物被煮沸以吸取啤酒花 的味道，其所含的軟性樹脂和精油能賦予啤酒特殊的芳香和苦味，再 起色和消毒。在煮沸後，加入啤酒花的麥汁被泵入迴旋沉澱槽以去除 不需要的啤酒花剩餘物和不溶性的蛋白質。. 8.
(11) 啤酒花的成分由一群複合物組成，苦味由苦味質(bitter acid; soft resin)：α-acid (hunulones：C21H30O5)及 β-acid (lupulone：C26H38O4)及 其多種異構物所構成。香味則由啤酒花之精油(essence oil)主要含 (C5H8)n 之 terpene 成 份 如 ： myrcene(C10H16) 、 linalool(C10H18O) 、 humulene(C15H24)，酮類成分如：luparone(C13H22O)與醇類成分如： curcumol(C15H24O2)與 luparol(C16H26O2)等多種化合物所組成。 啤酒花曾用作中草藥治療睡眠障礙、當作輕微鎮定劑或健胃劑。 在過去的十年間有許多的藥理研究都想藉由 in vitro 或 in vivo 的方法 找出傳統醫療中使用啤酒花的科學證據。目前研究 Humulus lupulus 的藥理作用有神經鎮定、類雌性素活性、抗癌、抗菌以及腸胃道反應 等方面。隨著啤酒花的研究，啤酒花的成分中研究最多的莫過於 xanthohumol 和 8-prenylnaringenin，xanthohumol 具有廣效的抗癌效果 (Zanoli and Zavatti, 2008)和抗氧化作用(Yamaguchi et al., 2009)，而 8-prenylnaringenin 被認為是最強效的植物雌激素(phytoestrogen)。. 黃腐醇(Xanthohumol) 啤酒花的成分中除了提供苦味和香味的苦味質(bitter acid)和精 油(essence oil)之外，尚有一群異戊二烯類黃酮(phenylflavonoids)的化 合物，其中最重要的成分便是xanthohumol，占有乾燥啤酒花成分的. 9.
(12) 1 %，比其他類似結構化合物多了10~100倍(Stevens et al., 1999b)。 xanthohumol 在 適 當 加 熱 與 提 高 pH 的 環 境 下 會 轉 變 成 isoxanthohumol(異黃腐醇)，因此黃腐醇和異黃腐醇是啤酒中最主要 的異戊二烯類黃酮類化合物，而在人類的小腸微生物群(intestinal microflora)(Possemiers et al., 2006)或肝臟細胞色素(cytochrome P450 enzymes)(Guo et al., 2006) 作 用 下 isoxanthohumol 會 再 轉 變 成 8-prenylnaringenin。因此，沒有類雌性素活性的xanthohumol可轉變成 有 類 雌 性 素 活 性 的 isoxanthohumol 和 8-prenylnaringenin(Zanoli and Zavatti, 2008)。 Xanthohumol (3'-[3,3-dimethylallyl]-2',4',4-trihydroxy-6'-methoxychalcone)(Figure.1)，啤酒花的類黃酮類成分之一，化學式為C21H22O5， 分子量354.40，是黃色的偏酸性粉末，可溶於所有的有機溶劑。過去 十年來的研究都集中在其抗癌方面的活性，因為xanthohumol可有效 抑制啟始(initiation)和增生(prolifreation)，抑制癌細胞的發展歷程和表 現(Colgate et al., 2007)，在目前的研究中，xanthohumol (2-200μM)可 以抑制老鼠的血管增生(angiogenesis);在治療xanthohumol (20 μM)二 十天後，可有效抑制KS-IMM tumors(Kaposi’s sarcoma cell line)的生長 速率。目前的研究顯示xanthohumol與抗癌和抗氧化有關，但只限於 實驗室內的研究，尚未應用到臨床上。. 10.
(13) 黃腐醇和它的相關化合物為了鑑定它的細胞毒性使用 sulforhodamine B assay 分 析 方 法 和 四 種 不 同 的 人 類 癌 細 胞 株 ： A549(肺細胞)、SK-OV-3(卵巢細胞)、SK-MEL-2(黑色素細胞瘤)和 HCT-15( 結 腸 細 胞 ) 。 在 xanthohumol 、 Isoxanthohumol 、 8-prenylnaringenin 、 xanthohumol 4'-O-beta-D-glucopyranoside 和 (2S)-5-methoxy-8-prenyl naringenin 7-O-beta-D-glucopyranoside 之中， xanthohumol 有最強的細胞毒性，也在抗癌方面是最有研究價值的。 Xanthohumol 具有抑制 DNA topoisomerase I 的活性，此外 drug efflux genes 也被研究來預測抗藥性，實驗結果證實 xanthohumol 具有抑制 topoisomerase I 的抗癌效果，也可與其他抗癌藥併用，藉由抑制 efflux drug transporters 來減少抗藥性(Lee et al., 2007)。 巨噬細胞是ㄧ級免疫作用中主要反應的細胞，它們可以被葛蘭氏 陰性菌所產生的 lipopolysaccharide(LPS)或宿主免疫細胞的干擾素 interferon-gamma 所 活 化 ， 研 究 顯 示 xanthohumol 可 有 效 抑 制 IL-1beta、TNF-alpha 以及 iNOS 等發炎因子引起的巨噬細胞，猜測 xanthohumol 可能透過許多訊息路徑調控發炎訊息(Zhao et al., 2003; Cho et al., 2008)。由研究顯示從啤酒花萃取之類黃酮成分化合物有抑 制 peroxynitrite 引起的氧化作用，人類攝食類黃酮大多透過啤酒，每 公升的啤酒含有四毫克的類黃酮化合物，啤酒中含有的 xanthohumol. 11.
(14) 具有抑制 peroxynitrite 引起的氧化作用(Yamaguchi et al., 2009)，意外 地發現 xanthohumol 經熱度和酸度轉換的化合物 isoxanthohumol 則不 具有抗氧化作用(Stevens et al., 2003)。因此，xanthohumol 是啤酒中含 量最多的類黃酮類抗氧化物質。. 血小板(platelet) 血小板在循環系統中扮演很重要的生理角色，主要是參與凝血反 應。有許多不同物質都可以造成血小板的活化，當血小板和這些物質 接觸幾秒之內就可以發揮活化反應。血小板在 in vitro 的環境中利用 血小板凝集器可以觀察到許多不同的反應，例如：吸附(adhesion)、 外 型 改 變 (shape change) 、 凝 集 反 應 (aggregation) 以 及 分 泌 作 用 (secretion)，這些現象與 in vivo 環境下所發生的凝血反應都很類似， 因此我們可以藉由離體實驗預測藥物在人體的作用效果。一般生理狀 態下血小板的活化指的是細胞外的刺激訊息與血小板表面的受體 (receptor)結合，這些訊息透過細胞膜上 GTP-binding proteins 轉換成 另 一 種 型 式 繼 續 傳 遞 到 細 胞 膜 內 側 動 器 (effector) 並 活 化 特 異 性 effector system，例如：ion channels 或 phospholipase C-induced inositol phospholipids hydrolysis ， 接 著 調 控 二 次 訊 息 的 強 弱 ， 包 括 ： IP3 (inositol-1,4,5-trisphosphate)、Ca2+、DAG、cAMP 與 cGMP，藉由蛋. 12.
(15) 白質磷酸化、酵素活化以及蛋白質結構的改變來引發多變的機轉路 徑。每一個受體活化所引起的訊息傳遞都有一定的前後順序並且每個 路徑之間都有複雜的交互反應。. 血小板在生理和病理情況下扮演的角色 血小板在止血(haemostasis)過程中扮演非常重要的角色，當人體 受傷時會自動啟動血小板活化路徑，在幾分鐘之內達到凝血的止血保 護效果，血小板功能不全的疾病，如: glanzmann thrombasthenia 是一 種先天性凝血異常疾病，患者受傷時血液無法正常凝結，血流不止會 有生命危險。 當血管壁受傷時，內皮下層(subendothelium)會暴露出 collagen， 當血小板與 collagen 結合後就會引發血小板活化反應，血小板活化後 使細胞內分泌型胞器：Dense granules、α granules 釋放 ADP 和 thromboxane A2，促使血小板活化加劇，最後在受傷的地方形成血栓， 而達止血效果。 另一方面，血小板過度地活化可能是造成許多血栓和栓塞現象 (thrombo-embolic phenomena)的原因，尤其是在動脈部位，不正常的 血小板活化可能導致心肌梗塞和中風的危險。血小板的凝集反應 (aggregation)可 以 使 用 抗 血 小 板 藥 物 來 預 防 ， 例 如 ： aspirin(acetyl. 13.
(16) salicylic acid)是一個使用最久，運用最廣的藥物。Aspirin 目前當作是 腦血管病變(cerebrovascular accident)及心肌梗塞(myocardial infarction) 的預防用藥。短暫性缺血的發作(transient ischaemic attacks)、心絞痛 (angina pectoris)與跛行(claudication)這些急性栓塞的併發症都可藉由 規律地服用 aspirin 來改善。抗血小板療法可有效的降低不穩定型心 絞痛、急性心肌梗塞與短暫局部缺血發作的死亡率(Cavallari and Momary, 2009)。. 血小板的超顯微結構 正常血液循環中的血小板是圓盤狀無核的細胞，源自於骨髓內的 巨核細胞(megakaryocyte)，寬約 3 μm，厚約 1 μm，是人體最小的 血液細胞，細胞膜由兩層磷脂質構成，上面佈滿連結細胞內部細管系 統(canalicular system)的通道(channel)，帶負電的 PI(phosphotidyl)和 PS(phosphotidylsereine) 位 在 膜 上 靠 近 細 胞 質 的 一 側 ， 作 為 phospholipase 的 受 質 (substrates) ， 雙 層 磷 脂 質 上 鑲 嵌 有 許 多 glycoproteins，如:GP Ia/IIa、GP Ib、GP IIb/IIIa 與 GP IV，並且突出細 胞膜外作為活化劑或抑制劑的受體。他們位在細胞質的一端會與血小 板 的 內 縮 系 統 (contractile system) 的 成 分 連 接 ， 例 如 GP Ib 會 和 actin-binding protein 連接(Fox, 1985)；而 GP IIb/IIIa 則與 actin filaments. 14.
(17) 連接(Painter et al., 1985)。 血小板的細胞骨架主要由 actin 組成，約占全部血小板的 15~20 %。Actin filaments 主要是由 tropomysin、α-actin 與 actin-binding protein 組 成 。 當 血 小 板 活 化 ， myosin 會 和 actin 結 合 以 提 供 granule centralization 所需的張力(Fox and Phillips, 1982)。另外，血小板另有 一些細胞膜骨架，由 short actin filament 與 actin-binding protein 組成， 連接到細胞膜上的 GP Ia/IIa 與 GP Ib，主要功能是穩定細胞膜以及調 整細胞膜的形狀。除此之外，細胞膜下方還存在由 tubulin 組成之 microtubular coil，用來維持未受刺激之血小板成圓盤狀(Maxwell et al., 2006)。 Dense tubular system 和其他種類細胞內的平滑內質網(smooth endoplasmic reticulum)相同，用來儲存鈣離子以及合成 prostaglandin 所需要的酵素，它們的位置接近 open canalicular system channel 並形 成 membrane complex。 血小板細胞質內有許多胞器，包括：粒線體(mitochondriae)、醣 原 顆 粒 (glycogen particles) 、 溶 媒 體 (lysosomes) 與 過 氧 化 體 (peroxisomes)。α granules 和 dense granules 內含有大部分的蛋白質， 例如：platelet factor 4、β-thromboglobulin、platelet derived growth factor、fibrinogen、fibronectin、thrombospondin、plasminogen activator、. 15.
(18) inhibitor-1 與 vWF。Dense granules 則富含 serotonin、ADP (adenosine diphosphate) 與 鈣 離 子 。 α granules 內 尚 存 在 著 很 少 量 的 抗 原 ： α2-antiplasmin(Plow and Collen, 1981)。 當血小板活化時，會改變原本的圓盤狀，變得相當圓而延長且伸 出偽足。所有的胞器會集中並且被 microtubules 與 microfilaments 剛 形成之環狀結構圈在細胞中央。最後分泌型胞器的內容物會釋放出 來。在分泌的過程中，granule membrane 會連接到 canalicular systen 的開口處，並且和 internal granular membrane proteins，例如：P-selectin 一起融入細胞膜內。很容易就可以引起 dense granules secretion，但α granules secretion 必須受到高濃度的致效劑刺激才會釋放出內容物； 而 且 只 有 在 受 到 thrombin 或 高 濃 度 collagen 刺 激 下 才 會 引 起 lysosomal granules secretion。此外，血小板受到強的致效劑刺激時也 會產生並釋放出 TxA2(thromboxane A2)與 PAF (platelet activation factor) 作為一種 positive feedback 的機制。. 血小板活化的機轉 Platelet receptor 血小板可藉由生理性(thrombin、TxA2、collagen、ADP、PAF、 serotonin 及 epinephrine 等)及藥理性(calcium、ionophores 及 cyclic. 16.
(19) endoperoxide analogues 等)的刺激而活化。這些致效劑可透過血小板 細胞膜上專一性的受體發揮作用，所有致效劑的受體都會和 quanine-nucleotide binding regulatory protein 或 G protein 產生交互作 用。這些蛋白由三個部分的單鏈聚胜肽(single polypeptide)所組成：細 胞外作為 activator-binding domain 的 N-terminal domain；七個疏水性 的 transmembrane domains ； 細 胞 內 連 接 產 生 二 次 訊 息 酵 素 的 C-terminal domain。致效劑引起的初期反應通常藉由 arachidonic acid 分解後的 TxA2 和 ADP 的釋放作用來引起的二次反應以加強血小板凝 集。. vWF receptor vWF 由巨核細胞合成，存在血小板的α granule、血漿及內皮組織 下層中。成熟的 vWF 分子量為 260 kDa，並且會組成分子量 500-10,000 的多聚體(multimers)。最大的多聚體通常存在內皮下層，也最能引發 血小板凝集 (aggregation)與吸附反應 (adhesion) (Meyer and Girma, 1993)。當血小板吸附到內皮下層上的 type VI collagen 時，vWF 會產 生結構上的改變以致於能夠和血小板上的 GP Ib 結合。在 in vitro 的 環境中，外加 ristocetin 或 botrocetin 可引起 vWF 的結構改變；在 in vivo 的環境中，高度的剪應力(shear forces)是 vWF 結構改變所必須的。. 17.
(20) vWF 和 thrombin 在 GP Ib 上的結合位置位在α chain 的 N-terminal， 並且在細胞質內之β chain 的尾端可發生磷酸化。vWF 和 GP Ib 發生 作用後，會產生一個 GP IIb/IIIa 活化所需要的訊息，當 GP IIb/IIIa 活 化後會回過頭來與 vWF C-terminal 上的 RGD (arginine-glycine-aspartic acid)序列結合，造成血小板不可逆的吸附在血管壁上藉以抵抗血流的 高切應力，並且造成凝集反應。. Thrombin Receptor Thrombin 是很強的血小板的刺激劑，它可以造成血小板形狀改 變(shape change)、凝集反應、以及 dense granules、α granules 與 lysosomal granules secretion。每個血小板細胞上約有 1,700-1,800 個 thrombin 受 體 ， 主 要 由 N-terminal、 transmembrane 與 C-terminal domains 構成。Thrombin 將受體 N-terminal 上 arginine 41 與 serine 42 之間的位置切斷，形成一段新的 tethered ligand，藉此活化 thrombin 受體(Vu et al., 1991)。受到 thrombin 活化後，thrombin 受體會發生去 敏感化(desensitization)及內在化(internalization)，並且由 endosomes 將其送至 lysosomes 被降解。去敏感化的發生主要是透過 protein kinase C、β-adrenergic receptor 或是 cAMP-dependent protein kinase 將 serine 和 threonine 磷酸化(Brass et al., 1993)。當 thrombin 受體活化後. 18.
(21) 會造成 G protein couple receptor 的磷酸化以及 phospholipase C 的活 化。Thrombin 對於 GP Ib 有很高的親和力，但除了加速血小板活化外 並沒有其他功能(Yamamoto et al., 1991)。. Collagen Receptor 血小板受到 collagen 刺激後會發生形狀改變及 dense granules release。Collagen 的四級結構是由三條聚胜肽形成一個 helix 單體，這 些單體再聚合成纖維，而此一結構對於血小板的活化是很重要的。血 小板吸附在 collagen 上的作用可藉由 magnesium、vWF 或 fibronectin 來加強。當血管受傷時，血小板換藉由許多物質與血管產生吸附作 用，其中最主要的媒介就是 collagen 與 vWF，血小板的 GP Ia/IIa、 GP IV 和 GP VI 都是 collagen 的受體，因此 collagen 可以作用在血小 板表面上許多的位置，吸附上的血小板會活化細胞內訊息傳遞以及最 終的 GP αIIbβIII，導致血小板的凝集(Kralisz and Stasiak, 2007)。其中 collagen 受體的活化和 phospholipase C 的活化與細胞內鈣離子的增加 非常相關。。. ADP Receptor 血小板中的 ADP 受體主要有兩個：P2Y1 與 P2Y12 (P2TAC)。P2Y1 19.
(22) 屬於 Gq-couple receptor，它能活化 phospholipase C，造成細胞內鈣離 子濃度增加；P2Y12 屬於 Gi-coupled receptor，它能夠抑制 adenylate cyclase，降低細胞內 cAMP 的含量。分別活化各個 ADP 受體都可引 起血小板內不同的反應，但若要引起血小板凝集反應則必須同時活化 P2Y1 與 P2Y12 受體(Jin et al., 2002)。. TxA2 and Cyclic Endoperoxide Receptor 血小板受到較強的活化劑刺激，例如：thrombin 和 collagen，或 在發生凝集反應的過程中，會活化 phospholipase A2 ，接著便會將 arachidonic acid 自細胞質上的磷脂質分解出來，再進一步的被合成為 prostaglandin endoperoxides：PGG2 與 PGH2，最後再轉變為較強力的 TxA2。PGG2 的半衰期約為五分鐘；而 TxA2 約為一分鐘，就會再轉 變為不具活性的 TxB2。TxA2 會藉由活化細胞膜上 G protein couple receptor 活化 phospholipase C，接著引起血小板形狀改變、granule 釋 放以及凝集反應(Hirata et al., 1991)。. 受體的活化和二次訊息的產生 Guanine Nucleotide Binding Regulatory Proteins and Effectors 血小板上有許多致效劑和拮抗劑的受體都經由鳥嘌呤核苷酸調. 20.
(23) 節蛋白(guanine nucleotide regulatory proteins)或 G proteins 連接到產生 二次訊息的酵素，這些酵素包括：adenylate cyclase (AC)、phospholipase C (PLC)、phospholipase A2 (PLA2)。G proteins 通常由三個次單元組 成：α subunit，是一個鳥嘌呤核苷酸的結合位置，負責受體(receptor) 與動器(effector)之間的相互作用；β subunit 和γ subunit 形成一個異質 二聚體(heterodimer)，主要是幫助 G proteins 固定在細胞膜上，離子 通道和 PLA2 的活化以及 AC 的抑制也受到β-γ subunit 的調控。每個 G protein 都具有特異性的α subunit，而β-γ subunit 則大多相似，目前已 知有二十二種 Gα、四種 Gβ及七種 G γ，互相搭配產生數以百計的 G proteins (Brass et al., 1993)。當 GTP 分子結合到 G proteins 時，β-γ subunit 會和α subunit 分離，使得二次訊息產生酵素被α-GTP subunit 活化，接著α-GTP subunit 內生性的 GTPase 活性會終止這個相互作 用，轉變回α-GTP subunit 並且再次與β-γ subunit 連結在一起(Spiegel, 1987)。 AC 可將 ATP 轉變成 cAMP，它可藉由 adenosine、PGI2、PGD2 或 PGE1 刺激 Gs 而被活化，增加 cAMP 的濃度；β-γ subunit 似乎調節 著許多由α2-adrenergic 致效劑所導致抑制 AC 的作用(Spiegel, 1987)。 Gs 和 Gi 也可以調節離子通道的活性；Gs 可以抑制 Na+ channels 與刺 激 dihydropyridine-sensitive Ca2+ channels；Gi 可以抑制 Na+ channels. 21.
(24) 與刺激 K+ channels (Manning and Brass, 1991)。 PLCβ 可 受 到 Gq 的 刺 激 ， 將 PIP2 [phosphotidylinositol (4,5) bisphosphate]分解成 IP3 與 DAG。而 cAMP 和 cGMP 都可藉由影響 G proteins 而抑制 PLCβ的活性。 當細胞內鈣離子受到由 PLC 產生的 IP3 刺激而濃度增加時，或是 直接受到 G proteins β-γ subunit 刺激，會活化並且將細胞膜與 dense tubular system 內的 AA 釋放出來，而 AA 會再被合成 TxA2。. Second Messangers Involved in Platelet Activation and Inhibition (1) IP3 與 Ca2+ TxA2 和 thrombin 的受體經由 G proteins 連接到 PLCβ，再將 PIP2 水解成 IP3 與 DAG，在其他種類細胞中 PLCγ1 可直接被 tyrosine kinase-linked receptor，例如：platelet growth factor receptor 活化，不 需經由 G proteins 的作用(Berridge, 1993)。PLCγ1 也曾發現存在於細 胞質中(Banno et al., 1992)。IP3 可作用在其受體上造成內鈣離子的移 動以及外鈣離子的流入(Irvine, 1990)。位在 dense tubular system 上的 IP3 受 體 在 C-terminal 的 部 分 具 有 典 型 的 membrane-spanning domains，可將受體固定在膜上，並且在四個次單元體結合形成一個. 22.
(25) IP3-sensitive Ca2+ channel；其 N-terminal 則游離在細胞質中成為與 IP3 結合的位置(Mignery and Sudhof, 1990)。位在血小板外膜上的鈣離子 通道可受 IP3 與 IP4 一起調節。 鈣離子的移動可導致 PLA2 活化和 TxA2 產生，而鈣離子的移動 (Siffert and Akkerman, 1987)與 PLA2 的活化(Sweatt et al., 1985)，都需 要鈉鈣離子交換所導致細胞內 pH 值增加才能發生。ADP 所引發的外 鈣離子流入，主要是經由其受體操控的鈣離子通道來完成(Sage et al., 1989)。. (2) DAG (diacylglycerol) DAG 會促使 PKC (protein kinase C)由細胞質移動到細胞膜上並 且活化，PKC 的大小約是 80 kDa，它能在 phosphotidylserine 與鈣離 子在的情況下將 ATP 上的磷酸轉移到受體蛋白上 serine 或 threonine 的位置(Nishizuka, 1984)。DAG 可引起凝集反應與 serotonin 釋放，但 只能稍稍引起血小板形狀改變。PKC 主要受質的分子量約 47,000 Da 的蛋白質，稱為 p47 或 pleckstrin (Sano et al., 1983)，目前認為它和血 小板的分泌作用有關(Haslam and Lynham, 1977)。另一個被 PKC 磷酸 化的蛋白質就是分子量 20 kDa 的 myosin light chain，但它主要還是鈣 離 子 與 calmodulin-regulated myosin light chain kinase 的 受 質. 23.
(26) (Hathaway and Adelstein, 1979)。PKC 的活化與鈣離子的增加必須同時 發 生 才 能 達 成 理 想 的 血 小 板 活 化 反 應 。 而 PKC 的 活 化 可 阻 斷 epinephrine 所抑制的 AC 活性(Katada et al., 1985)。此外 PKC 對於血 小板也存著一些抑制性的功能，因此建立一套負回饋系統(negative feedback system) 。. (3) Prostaglandins 與 TxA2 PLA2 會以 phosphotidylcholine 和 phosphotidylethanolamine 作為受 質，分解出 AA (McKean et al., 1981)。IP3 所引起的細胞內鈣離子增加 或透過與 G proteins 直接作用的 Ca2+-independent 的機轉接可活化 PLA2。AA 可被 cyclooxygenase 轉變成不穩定的 prostaglandin，PGG2 與 PGH2，它們皆可引起血小板的凝集反應。接著迅速地 thromboxane synthase 合成 TxA2。PGH2 和 TxA2 在二次凝集反應與分泌作用中扮演 非常重要的角色，並且也是放大凝集反應機轉的一部分。 PGH2 可以轉變成抑制性的 PGD2 、抑制性較弱或沒有活性的 PGF2α或是 PGI2 (Armstrong et al., 1985)。PGE2 也會由血管上的細胞釋 放出來(Gimbrone and Alexander, 1975; Dumonde et al., 1977)，或是在 一些病理狀態下護過度的產生，例如：糖尿病及血栓(Schafer et al., 1984)。. 24.
(27) (4) cAMP 增加 cAMP 的濃度可以阻止鈣離子的移動並且將之隔離在 dense tubular system 內，並且可以逆轉凝集反應。此外，增加 cAMP 也可 以影響 PLC，抑制 PIP2 水解形成 IP3。cAMP-dependent kinase 可將 PLC 磷酸化，使其不再受到血小板致效劑的刺激(Lapetina, 1990)。AC 可 被 Gs 所刺激，被 Gi 所抑制。降低 cAMP 的濃度並不足以直接造成 血小板發生凝集反應。cAMP 會被 PDE(phosphodiesterase)分解為不具 活性的 AMP。. (5) cGMP cGMP 抑制血小板活化的作用被視為一種回饋性的抑制。內皮細 包含有的以及一些血管擴張劑產生的 NO(nitric oxide)可刺激 cGMP 產生。cGMP 也會被 PDE(phosphodiesterase)分解為不具活性的 GMP。. 血小板內重要的訊息傳遞 血小板上有許多agonists與antagonists的受體都經由鳥嘌呤核苷 酸調節蛋白(guanine nucleotide regulatory proteins)或G proteins連結到 產生二次訊息的酵素，血小板要發生凝集反應會涉及PLC、PKC與. 25.
(28) MAPKs等訊息傳遞路徑：. Phospholipase C (PLC)/PKC PLC受到Gq的刺激，將細胞膜上的PIP2轉變成DAG和IP3。DAG會 促使PKC由細胞質移動到細胞膜上並活化之。DAG可引起凝集反應和 serotonin的釋放，但只能稍稍造成血小板的形狀改變。PKC主要的受 質是分子量47,000 Da的蛋白質，稱為p47或pleckstrin(Sano et al., 1983)，被認為和血小板的分泌作用有關(Haslam and Lynham, 1977)。 PKC的活化和細胞內鈣離子的流動增加具有非常密切的相關性，進而 造成血小板的活化反應。IP3可作用在其受體上造成內鈣離子的移動 和外鈣離子的流入(Irvine, 1990)。另外，促使PIP2轉變成IP3的cAMP 和使於血小板活化的回饋型抑制劑cGMP(Haslam et al., 1978)都可藉 由影響G proteins而抑制PLC的活性。. Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) Mitogen-activated protein kinases (MAPKs)為細胞對外界刺激反 應作用後的重要訊息介質，在體內訊息傳遞的路徑中扮演很重要的角 色。血小板內的MAPKs包括p38 MAPK、ERK、JNK三種(Papkoff et al., 1994; Nadal et al., 1997; Bugaud et al., 1999)。 (1) p38 MAPK. 26.
(29) 它分為α、β、γ、δ四種類型，分子量為43 kDa，p38 MAPK會因 為許多種的刺激而活化，包括內分泌、壓力和cytokines，並且會參與 發炎反應和apoptosis(New and Han, 1998)。在人類血小板中p38 MAPK 以 α 類 型 存 在 (Kramer et al., 1995)。 血 小 板 中 的 p38 MAPK 會 因 thrombin 、 collagen 、 U46619 、 LDL 和 vWF 的 刺 激 而 產 生 (Borsch-Haubold et al., 1995; Kramer et al., 1995; Saklatvala et al.,1996; Hackeng et al., 1999)。目前發現p38 MAPK在血小板內主要的功能是 將cPLA2上的Ser505位置磷酸化(Borsch-Haubold et al.,1997)。然後進入 cPLA2-AA-TxA2 pathway。使用p38 MAPK的抑制劑SB203580可以抑 制collagen引起的血小板凝集(Saklatvala et al., 1996)。代表collagen 會 透過p38 MAPK的路徑活化血小板。. (2) ERK 它可分為ERK1 和ERK2，分子量分別為44和42 kDa。其主要的 功能是細胞的增生(proliferation)和分化(differentiation) (Wilkinson and Millar, 2000)。在人類血小板中ERK1和ERK2均會出現，其中ERK2較 為 顯 著 (Bugaud et al., 1999) 。 ERKs 會 因 collagen 的 刺 激 而 產 生 (Borsch-Haubold et al., 1995) 並 且 可 調 控 血 小 板 內 鈣 離 子 的 流 入 (Rosado and Sage, 2001)。另外，ERKs也會因為thrombin、vasopressin、. 27.
(30) collagen、pokeweedmitogen agglutinin (PMA)、TxA2 以及vWF的刺激 而 產 生 (Papkoff et al., 1994; Borsch-Haubold et al., 1995; Borsch-Haubold et al., 1997) 。. (3) JNK 有JNK1和JNK2兩種類型，分子量分別在46和54 kDa。而JNK又 稱為stress-activated protein kinases，會因為壓力、幅射以及grownth factors 等因素而活化(Kyriakis et al., 1994)。在一般細胞中JNK的主要 功能是將DNA-binding domain c-Jun 磷酸化，進而對apoptosis 造成影 響(Tournier et al., 2000)。在人類血小板細胞中JNK1會受到collagen的 刺激而產生，進而影響血栓的形成(Kauskot et al., 2007)。另外，JNK1 也會受到thrombin、vasopressin和vWF的刺激而產生(Borsch-Haubold et al., 1995)。. Phosphoinositide 3'-kinase (PI3K)/Akt Phosphoinositide 3'-kinase(PI3K)/Akt 訊息路徑調控了許多細胞 功能，例如：細胞凋亡(apoptosis)或細胞增生(proliferation)(Jiang and Liu, 2008)。熱休克(heat shock)和自由基(reactive oxygen species)等壓 力的刺激都會活化 PI3K/Akt cascade(Barthel et al., 2007)。Akt family. 28.
(31) 有三種已知的型式：Akt1、Akt2、和 Akt3 (Lawlor and Alessi, 2001)。 其中 Akt1、Akt2 是出現在人類和老鼠的血小板中(Kroner et al., 2000)，會影響 GP Ib-IX 調節的血小板活化反應，經由實驗可以證明 GP Ib-IX 活化的訊息會向下調控細胞表面組合蛋白(integrin) ，接著 活化 PI3K/Akt 訊息路徑(Yin et al., 2008)。有研究指出 Akt1 和 Akt2 在 G protein-coupled receptors 和 collagen receptors 誘發的血小板凝集 反應終扮演著很重要的角色(Woulfe et al., 2004)。. 1-2 研究動機 前文提到有文獻證明啤酒中含有的 xanthohumol 具有抗氧化的作 用(Yamaguchi et al., 2009)。目前有許多抗氧化方面的研究指出，類黃 酮(flavonoids)的抗氧化結構，具有降低低密度脂蛋白氧化和抑制血小 板 凝 集 的 能 力 (Kwasniewska et al., 2000; Pignatelli et al., 2000; Freedman et al., 2001; Han, 2005; Leifert and Abeywardena, 2008)。但對 於 xanthohumol 抑制血小板凝集的路徑機轉尚未明確，因此本實驗想 進一步探討 xanthohumol 抑制血小板活性的作用和機轉，以提供藥理 或臨床應用之依據。. 29.
(32) 1-3 研究範圍 本研究主要是探討在in vitro的環境下，xanthohumol抑制血小板活 化過程中所扮演的角色以及其參與的作用機轉。首先巨觀的看外加 xanthohumol是否會抑制collagen、thrombin、U46619和arachidonic acid 所活化的血小板凝集程度，接著再細步探討xanthohumol在血小板活 化過程中對細胞內訊息傳遞的影響，了解xanthohumol和血小板之間 的作用機轉。. 30.
(33) 二.實驗材料與方法. 2-1實驗材料(Materials) 實驗藥物試劑 xanthohumol購自Sigma Chem. Co. USA公司. 實驗藥品 1. 以下藥品購自Sigma Chem. Co. USA 公司 Acrylamide Ammonium formate Bovine serum albumin (BSA) Bromophenol blue Collagen (Type I, bovine achilles tendon) Commassie brilliant blue Dimethyl sulfoxide (DMSO) Diphenylhexatriene (DPH) Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA, disodium salt) Glucose Heparin. 31.
(34) Luciferin-luciferase Phorbol-12, 13-dibutyrate (PDBu) SQ22536 Sodium citrate Sodium formate Sodium pyruvate Thrombin Tris-HCl U46619 (9, 11-dideoxy-9 α, 11 α -methanoepoxy PGF2 α). 2. 以下藥品為 Amersham, UK 之產品 Protein molecular weight markers (Prestain markers). 3. 以下藥品為Bio-rad公司之產品 Ammonium persulfate (APS) Protein assay dye reagent concentrate. 4. 以下藥品為Amerdamlife Science公司之產品 Glycerin Sodium dodecylsulfate (SDS). 32.
(35) Tris (hydroxymethyl)-aminomethane (Tris-base) Triton X-100. 5. 以下藥品為Pharmacia Biotech.公司之產品 Glyerol Polyoxyethylenesorbitan monolaurate (Tween 20) N,N,N,N,-Tetramethylethylethylenediamine (TEMED). 6. 以下藥品為日本Wako公司之產品 Acetic acid Calcium chloride, Dihydrate Ethanol Methanol Sodium Hydrogen Carbonate Sodium Hydroxide. 7. 以下藥品為MDBio Inc.公司之產品 40% Acrylamide / Bis solution. 33.
(36) 8. 以下藥品為其他公司之產品 99.5% Alcohol, absolute (工研院). 抗體 Anti-mouse Ig horseradish perioxidase linked whole antibody (Amersham, UK) Anti-rabbit IgG horseradish perioxidase linked whole antibody (Amersham, UK) Phospho-p38 MAP kinase(Thr180/Tyr182) antibody(Cell signaling technology) p38 MAP Kinase mouse monoclonal antibody(Cell signaling technology) Phospho-p44/42 MAP kinase (T202/Y204) E10 monoclonal antibody (Cell signaling technology) P44/42 MAP kinase monoclonal antibody (Cell signaling technology) Phospho-(Ser) PKC substrate antibody (Cell signaling technology) Phospho-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185) (G9) mouse monoclonal antibody (Cell signaling technology) SAPK/JNK antibody(Cell signaling technology) Phospho-PLCγ2 (Tyr759) rabbit polyclonal antibody (Cell signaling 34.
(37) technology) PLCγ2 (Tyr759) rabbit polyclonal antibody (Cell signaling technology) Phospho-Akt(Ser473) antibody(Cell signaling technology) Tubulin alpha Ab-2 (DMIA) monoclonal antibody (Sigma, USA) ECL Anti-mouse IgG peroxidase-linked species-specific whole antibody (from sheep) (Amersham, UK). 套組試劑 (Kit) Enhanced chemiluminescence (ECL) Western blotting detection Reagent. 耗材 Blotting paper (Amersham, UK) Cassette (Okamoto, Japan) Developer and replenisher (Kodak, USA) Fixer and replenisher (Kodak, USA) Polyvinylidene fluoride microporous membrane (PVDF；Hybond-P, Amersham, UK ) Scientific Imaging film (Kodak, USA). 35.
(38) 2-2 實驗方法(Methods) 1. 人類血小板懸浮液(platelet suspensions, PS)的製備 主要是依據 Mustard 等人和 Kornecki 等人的方法(Mustard et al., 1972; Kornecki et al., 1981)。將抗凝血劑 citric acid / sodium citrate / glucose(A.C.D.)與健康志願者之全血以 1：9 (v/v)的比例混合，在室溫 下，立即以 1000 g 離心 10 分鐘，取上層富含血小板血漿，加入 heparin (6.4 IU/ml)、EDTA (2 mM)混合後，於 37℃下溫浴 5 分鐘；再進一步 用 2700 g 離心 8 分鐘，除去上層血漿，下層即為血小板顆粒(platelet pellet)，用 5 ml 的 tyrode 溶液 [NaCl (11.9 mM)、KCl (2.7 mM)、MgCl2 (2.1 mM)、NaH2PO4 (0.4 mM)、NaHCO3 (11.9 mM)、glucose (11.1 mM)、BSA (3.5 mg/ml)，pH 7.28]將血小板顆粒打散，使均勻分佈在 tyrode 溶液中，加入 heparin (6.4 IU/ml)、EDTA (2 mM)，於 37℃下溫 浴 8 分鐘，再以 2100 g 離心 8 分鐘，除去上層液，再用 tyrode 溶液 將血小板顆粒打散，加入 EDTA (2 mM)，於 37℃下溫浴 10 分鐘，接 著以 1300 g 離心 5 分鐘，清除上層液，最後用 tyrode 溶液配製成血 小板懸浮液，再以 coulter counter (COULTER Ac.T)計數，使血小板懸 浮液的濃度約為每毫升含 3.5 × 108 個血小板。此時，血小板懸浮液中 鈣離子濃度調整為 1 mM。. 36.
(39) 2. 血小板凝集與 ATP 釋放反應的測定 根據 O’Brien 等人和 Born 等人(O'Brien J, 1962; Born and Cross, 1963)之混濁測定法，以 Lumi-aggregometer (Payton, Canda)測之。將 製備好的人類血小板懸浮液 400 μ1 置入經 silicone 包衣的小玻璃管 中，並以小磁棒做每分鐘 1000 轉的攪拌。人類血小板懸浮液中加入 xanthohumol(1.5 和 3 μM)溫浴 3 分鐘後再加入各種血小板活化劑並觀 察其凝集的情形。凝集程度的計算，是以 PRP 或 PS 的吸光度做為 0 % 的血小板凝集，以 PPP 或 Tyrode 溶液的吸光度作做為 100 %的血小 板凝集，使用下列公式計算: 凝集(%) = (加凝集劑前的吸光度－加凝集劑後的吸光度) × 100 % 加凝集劑前的吸光度－Tyrode’s solution (或 PPP)的吸光度 Xanthohumol 抑 制 血 小 板 凝 集 程 度 的 表 示 法 係 在 加 入 xanthohumol 後的凝集程度和未加入 xanthohumol (對照組)的凝集程 度的相對百分比。 ATP 釋放反應的測定，則是根據 DeLuca 等人的方法(DeLuca and McElroy, 1974)。以 10 μl 的 luciferase/luciferin 混合物和 ATP 反應後 所產生的冷光，來測定血小板釋放反應的大小，其程度以相對值表示。. 37.
(40) 3. 血小板內鈣離子濃度的測定 參照 Grynkiewicz 等人的方法(Grynkiewicz et al., 1985)，以 A.C.D.為抗凝劑與健康人血以 1：9 (v/v)之比例混合，在室溫下立即 以 1000 g 離心 10 分鐘，所得上層液，加入 heparin (6.4 IU/ml)、EDTA (2 mM)混合後，於 37℃下溫浴 5 分鐘，再以 2700 g 離心 8 分鐘，而 後，除去上清液，將下層的血小板以 Tyrode 溶液懸浮之，並加入 Fura 2-AM (5 μM)、heparin (6.4 IU/ml)、EDTA (2 mM)，於 37℃下避光溫 浴 60 分鐘後，再依照製備血小板懸浮液的方法製備懸浮液。 經 Fura 2-AM 處理過之血小板懸浮液，在加入凝集劑後與鈣離 子作用所產生的螢光以螢光分光儀(CAF-110 Intracellular Ion Analyzer, JASCO, Japan)記錄之 excitation wavelength(339 和 380 nm)及 emission wavelength(505 nm)，然後利用 Grynkiewictz 等人(1985)及 Sato 等人 (1988)之方法(Grynkiewicz et al., 1985; Sato et al., 1988)，計算細胞內鈣 離子濃度。 [Ca2+]cyt =. Kd × s × (F339 / F380－F339 min / F380 min) (F339 max / F380 max－F339 / F380). = Kd × s × (R－Rmin) / (Rmax－R) Kd = 224 nM，即 Fura 2 之解離常數(Kd) F339 為 excitation 339 nm 時，細胞外存在 1 mM Ca2+時所測之值 F380 為 excitation 380 nm 時， 38.
(41) 細胞外存在 1 mM Ca2+時所測之值，s 為一常數，即以 excitation 380 nm 偵測，溶液中不含 fura-2 時的值/含鈣離子溶液中加入 Triton X-100 之 值，一般用 1 來代表，R 為 F339 / F380 之比值，Rmax 為血小板以 Triton X-100 溶解後，所測的螢光值，然後再加入 10 mM EDTA 所測得之螢 光值定為 Rmin (Cobbold et al., 1987)。. 4. FITC 接合到 triflavin 的方法 參考 Sheu 等人的方法(Sheu et al., 1992b)，將 triflavin (3.25 mg/ml) 溶解在 0.2 ml 的 sodium bicarbonate (0.1 M)中；另外，將 FITC (1 mg) 溶在 DMSO (0.1 ml)中，取 20 μl 的 FITC 溶液加入至 triflavin 溶液內， 在室溫下反應 1 小時，並不時地搖動，而後再加入 20 μl 現調配好的 hydroxylamin (1.5 M; pH 8.0-8.5)使反應 30 分鐘；最後將 FITC-triflavin 的濃度調整為 1 mg/ml。. 5. FITC-triflavin 與血小板上 glycoprotein IIb/IIIa complex 結合的測定 將抗凝血劑 sodium citrate 與健康志願者之全血以 1：9 (v/v)的比 例混合，在室溫下，立即以 1000 g 離心 10 分鐘，取上層富含血小板 血漿(PRP)，取 0.9 ml 的 PRP 置入試管中，分別加入不同濃度. 39.
(42) xanthohumol (1.5 和 3μM)或 EDTA (5 mM)，再以 normal saline 將最後 各管體積都調整為 1 ml，在 37℃下溫浴 3 分鐘後，避光加 FITC-triflavin (3.25 μg/ml)反應 2 分鐘後以 flow cytometer (Beckman coulter, Epics XL)測定，且每次收集 10,000 個血小板分析。. 6. 蛋白質磷酸化(protein phosphorylation)的測定 參照 Sheu 等人(2000)的方法(Sheu et al., 2000)，將人血與抗凝劑 A.C.D.以 9 : 1 (v/v)混合，在室溫下，立即以 1000 g 離心 10 分鐘，取 上層富含血小板血漿(PRP)，加入 heparin (6.4 IU/ml)、EDTA (2 mM) 混合後，於 37℃下溫浴 5 分鐘；再進一步用 2700 g 離心 8 分鐘，除 去上層血漿，下層即為血小板顆粒(platelet pellet)，把 tyrode 溶液[NaCl (11.9 mM)、KCl (2.7 mM)、MgCl2 (2.1 mM)、NaH2PO4 (0.4 mM)、 NaHCO3 (11.9 mM)、glucose (11.1 mM)、BSA (3.5 mg/ml)，pH 7.28] 將血小板顆粒打散，使均勻分佈在 tyrode 溶液中。將血小板懸浮液在 37℃下溫浴時間依實驗設計而定先與 xanthohumol(1.5 和 3 μM)反 應，而後加入 PDBu (150 nM)或 collagen (1 μg/ml)溫浴及反應時間依 實驗設計而定。 將上述處理後之血小板細胞顆粒，以外加 protease inhibitor (10 μl/ml aprotinin、10 μl/ml leupeptin、1 mM PMSF、1 M NaF 及 0.5 M. 40.
(43) Na3VO4)及 2 mM dithiothreitol (DTT)之 lysis buffer (50 mM HEPES、5 mM EDTA，50 mM NaCl 及 1 % Triton X-100)將細胞溶破，靜置冰上 40 分鐘，隨後以 4℃轉速 7000 r.p.m. 離心 5 分鐘，取上清液定量蛋 白質。蛋白質定量時，先 2 mg/ml 之 albumin bovine (BSA)以 1：1 的 體積比例與 0.2 N NaOH 充分混合，靜置 10 分鐘後。此時 BSA 的濃 度為 1 mg/ml，再以二次水分別稀釋成濃度為 0.7 mg/ml、0.5 mg/ml、 0.2 mg/ml、0.1 mg/ml，做為 standard。並取蛋白質樣品 5 μl 與二次 水 45 μl 充分混合，以 1：1 的體積比例再與 0.2 N NaOH 混勻。靜置 10 分鐘後，連同標準品全數加入 Dye reagent concentrate (Bio-Rad)充 分混合，再靜置 10 分鐘後，取 1 ml 至 cuvette 中，用 UV/VIS Spectrophotometer V530 以 595 nm 之波長來偵測樣品吸光值。所得之 吸光值以線性迴歸方式換算成濃度。測定後，樣品分裝保存於-80℃ 以備用。. 7. 蛋白質磷酸化西方墨點法(Western Blot) 將實驗處理取得之已定量的細胞內蛋白質成份以5：1的體積比 例加入6X sample loading dye (350 mM Tris-base、30 % glycerol、350 mM SDS、175 μM bromophenol blue、600 mM DTT，pH 6.8)充分混勻 後，100℃加熱10分鐘，使蛋白質denature後，快速置於冰上至少5分. 41.
(44) 鐘，以免回溫過程中酵素影響蛋白質，最後在4℃下以轉速10,000 r.p.m. 離心5分鐘後備用。再以10 % polyacrylamide gel於running buffer (25 mM Tris-base、192 mM glycine、0.1 % SDS, pH 8.3)下，每行分析 150-200 μg之蛋白質，並以80 V / 30 mA進行電泳分離3 ~ 4小時。隨後 將膠片置於transfer buffer (1 M Tris-base、20 % methanol、150 mM glycine, pH 8.3)中，以20 V進行電泳轉漬30分鐘，使膠片上之蛋白質 轉 移 至 polyvinylidene fluoride microporous membrane (PVDF ； Hybond-P)表面，隨後將轉漬膜浸潤於blocking buffer (5 % non-fat milk、10 mM Tris-base、100 mM NaCl、0.1 % Tween 20, pH 7.5)中， 約1小時後，以TBST (10 mM Tris-base、100 mM NaCl、0.1 %. Tween. 20, pH 7.5)清洗轉漬膜三次，每次10分鐘，之後加入一級抗體(primary antibody)，如VASP、α-tubulin、PKC(Taisuke O et al., 2003)、p38、ERK 等，於室溫中搖晃作用2小時。再用TBST清洗轉漬膜三次，每次10 分 鐘 ， 之 後 再 加 入 標 記 有 horseradish perosidase(HRP) 的 二 級 抗 體 (secondary antibody)，於室溫下反應1小時，再以TBST清洗轉漬膜三 次，每次10分鐘。最後使用冷光反應劑Enhanced chemiluminescence (ECL)Western blotting detection reagent使底片感光，以用來偵測蛋白 質含量的表現情形。最後將成像後的底片掃瞄輸入電腦，以影像分析 軟體(Bio-1D version 99)做分析處理。. 42.
(45) 8. 血小板細胞內 Phospholipase Cγ2 磷酸化的測定 根據 Keely 與 Parise 等人的方法(Keely and Parise, 1996)，將血 小板懸浮液在 37℃溫浴，並以小磁棒每分鐘 1,000 轉的攪拌，1 分鐘 後加入不同濃度 xanthohumol (1.5 和 3 μM)反應三分鐘後再加入 collagen (1 μg/ml)反應三分鐘；或是加入 collagen (1 μg/ml)反應三分 鐘；每一管之後都隨即加入 EDTA (10 mM)終止反應，最後經由離心 機 Sigma-201 M 在 7,000 r.p.m.下離心 5 分鐘，除去上清液，保留下層 沉澱的血小板細胞顆粒。將上述處理後的血小板細胞顆粒，利用「蛋 白質磷酸化」及「西方點墨法」來測定。. 9. 血小板細胞內MAPKs family磷酸化 根據 llaria Canobbio 等人(2004)的方法(Canobbio et al., 2004)，將 血小板懸浮液在 37℃溫浴，並以小磁棒每分鐘 1,000 轉的攪拌，1 分 鐘後加入不同濃度 xanthohumol (1.5 和 3 μM)反應三分鐘後再加入 collagen (1 μg/ml)反應三分鐘；或是加入 collagen (1 μg/ml)反應三分 鐘；每一管之後都隨即加入 EDTA (10 mM)終止反應，最後經由離心 機 Sigma-201 M 在 7,000 r.p.m.下離心 5 分鐘，除去上清液，保留下層 沉澱的血小板細胞顆粒。將上述處理後的血小板細胞顆粒，利用「蛋. 43.
(46) 白質磷酸化」及「西方點墨法」來測定。. 10. 血小板細胞內 Akt 蛋白磷酸化的測定 將血小板懸浮液在 37℃溫浴，並以小磁棒每分鐘 1,000 轉的攪 拌，1 分鐘後加入不同濃度 xanthohumol (1.5 和 3 μM)反應三分鐘後再 加入 collagen (1 μg/ml)反應三分鐘；或是加入 collagen (1 μg/ml)反應 三分鐘；每一管之後都隨即加入 EDTA (10 mM)終止反應，最後經由 離心機 Sigma-201 M 在 7,000 r.p.m.下離心 5 分鐘，除去上清液，保留 下層沉澱的血小板細胞顆粒。將上述處理後的血小板細胞顆粒，利用 「蛋白質磷酸化」及「西方點墨法」來測定。. 11. 血小板細胞內 vasodilator-stimulated phosphoprotein 的 測定 根據 O’Brien 和 Born 等人(O'Brien J, 1962; Born and Cross, 1963) 之 混 濁 測 定 法 ， 以 Lumi-aggregometer(Payton, Canda) 測 之 。 根 據 Barbara Coles 等人(2002)的方法，將血小板懸浮液在 37℃溫浴，並以 小磁棒每分鐘 1,000 轉的攪拌，1 分鐘後加入 xanthohumol (3μM)反應 三分鐘後再加入 collagen (1 μg/ml)反應三分鐘；或是先加入 ODQ、 SQ22536 應三分鐘後再加入 xanthohumol (3μM)三分鐘後再加入. 44.
(47) collagen (1 μg/ml) ，使用血小板凝集器觀察其凝集的情形。. 12. 血小板細胞內 NO 的含量測定 根據 Fang 等人(1998)的方法(Fang et al., 1998)，將的不同濃度 xanthohumol (1.5 和 3 μM)與血小板懸浮液反應 3 分鐘後，立即煮沸 2 分鐘，再置入冰浴中冷卻 1 小時。之後以 14,000 r.p.m.離心 8 分鐘， 取上清液 100 μl 加入兩倍體積的無水酒精，均勻搖盪攪拌，接著再冰 浴 30 分鐘，再離心 14,000 r.p.m. 8 分鐘，取上清液待測，此目的為除 去待測物中的蛋白質。取 10 μl 打入反應槽中，以 VCl3 當還原劑，將 待測物中的 nitrate、nitrite 還原成 NO，利用氦氣將 NO 帶入一氧化氮 分析儀(NO Chemiluminscence Analyzer, Model 280, Sievers Co. Ltd.) 中與臭氧反應，並偵測反應後釋出 600 nm 以上的螢光，並以 NaNO3 做 standard curve，藉此可推算待測物的濃度。 一氧化氮分析儀其原理是利用還原劑(VCl3)將 nitrate 還原成 NO，再由 O3 與 NO 反應，即： NO3- + 3V3+ + H2O → NO + 3VO2+ + 2H+ NO + O3 - → NO2 -* + O2 NO2 -* → NO2 - + light 當氣體中有一氧化氮存在時，反應式會向右進行，而得到受激. 45.
(48) 發之 NO2，由此受激發之 NO2 可放出螢光光譜，而一氧化氮分析儀 即偵測此種電流之變化。. 13. 血小板細胞內自由基釋放反應的測定 根據 Iuliano 等人(1994)的方法(Iuliano et al., 1994)，本實驗以電 子順磁共振儀(ESR)直接分析血小板受 collagen 刺激所釋放之 hydroxy. .. radical (OH )與 xanthohumol (1.5 和 3 μM)抑制血小板受 collagen 刺激. .. 所釋放之 hydroxy radical (OH )。 本實驗以 DMPO 當作電子自旋捕捉劑，DMPO (100 mM)與 3 x 10 7 platelets/ml 混合，之後加入 xanthohumol (1.5 和 3 μM)。反應後 的混合物移入 ESR 的扁平石英管(ER 161FCTM-S-Q)中，置於 Bruker EMX 電子自旋共振儀的 cavity 中測量。共振頻率是 9.76 GHz，其他 參數如下: microwave power, 20 mW; modulation frequency, 100 kHz; modulation amplitude 1G; sweep width, 100 G; time constant, 163.84 ms; conversion time, 40.96 ms; sweep time, 41.943 s; receiver gain 2 × 104; number of data points, 1024. The inhibition rate of xanthohumol is defined by the following equation: inhibition rate = 1 – [signal-height (β-estradiol－resting) / signal-height (collagen－resting)]。. 46.
(49) 14. 研究 PKC、p38 MAPK、Akt 之間蛋白質磷酸化的關係 根據 Coles 等人(2002)的方法，將血小板懸浮液在 37oC 溫浴， 並以小磁棒每分鐘 1,000 轉的速度攪拌，1 分鐘後加入不同濃度的 p38 抑制劑 SB203580 (10 μM)、PKC 抑制劑 Ro318220 (2 μM)以及 PI3K 抑制劑 Ly294002 (10 μM)反應 3 分鐘後，再加入 collagen (1 μg/ml)反 應 3 分鐘；或加入 collagen (1 μg/ml)反應 3 分鐘；之後每一管都隨即 加入 EDTA (10 mM)終止反應，最後經由離心機 Sigma-201M 在 7,000 r.p.m.下離心 5 分鐘，除去上清液，保留下層沉澱的血小板細胞顆粒。 將上述處理後之血小板細胞顆粒，利用「蛋白質磷酸化」及「西方點 墨法」來測定。. 2-3 數據分析 實驗數據皆以平均值±標準誤差(mean ± S.E.M.)表示，控制組 與xanthohumol組之間的比較以one-way ANOVA作統計分析。若P < 0.05則表示有意義的差別。. 47.
(50) 三.結果. 1. Xanthohumol 對血小板凝集和 ATP 釋放反應的影響 在人類血小板懸浮液中，xanthohumol (0.5-10 μM)與人類血小板 懸浮液溫浴三分鐘後，會隨著濃度的增加，能有效抑制 collagen (1 μg/ml)所引發的血小板凝集反應，其 IC50 和 max concentration 分別是 1.5 和 3 μM ； xanthohumol 也 會 隨 著 濃 度 的 增 加 ， 能 有 效 抑 制 arachidonic acid (60 μM)所引發的血小板凝集反應，其 IC50 和 max concentration 分別是 3.5 和 5 μM；但是 xanthohumol (0.5-10 μM)對於 U46619 (1 μM)、thrombin (0.05 U/ml)引起的血小板凝集則沒有抑制 作用(Figure. 2 與 3)。Xanthohumol 對於 collagen (1 μg/ml)的抑制效用 較強且對其所引發的 ATP 釋放反應也是呈現濃度相關的抑制作用 (Figure. 4)。Xanthohumol (3 μM)與 platelet-rich plasma 溫浴三分鐘後， 對於 collagen (1 μg/ml)所引發的血小板凝集反應不會有抑制作用，但 加大 xanthohumol 濃度到 35-70 μM 後，對於 collagen (1 μg/ml)所引發 的血小板凝集反應則會有抑制作用(Figure. 5)。. 2. Xanthohumol 對血小板細胞內鈣離子濃度變化的改變 當血小板受到活化劑刺激後，可藉由鈣離子內流(influx)以及移動. 48.
(51) (mobilization)而使細胞內鈣離子濃度增加。Collagen 是一種很強的血 小板活化劑，即具有上述之作用進而增加血小板細胞內鈣離子的濃 度 。 因 此 本 實 驗 以 collagen (1 μg/ml) 作 為 血 小 板 活 化 劑 ， 當 xanthohumol 以 1.5 和 3 μM 與預先經由 Fura 2-AM 處理的血小板懸浮 液溫浴三分鐘後，再投以 collagen (1 μg/ml)刺激，均可發現細胞內鈣 離子的增加濃度受到抑制(Figure. 6)，xanthohumol (1.5 和 3 μM)的抑 制程度分別為 50.82 ± 9.51 %和 66.49 ± 9.64 %(Figure. 7)。由此可知， xanthohumol 會抑制 collagen 所引起的血小板細胞內鈣離子濃度的增 加。. 3. Xanthohumol 對 FITC-triflavin 與血小板 glycoprotein IIb/IIIa complex 結合的影響 Triflavin 為日本屬龜殼花(Trimeresurus flavoviridis)的蛇毒原液中 純化出來的蛋白，其結構中包含一段 RGD 序列，能與血小板上 glycoprotein IIb/IIIa complex 結合的(Sheu et al., 1992b)。將 triflavin 以 FITC 標定，使用 flow cytometer 測量 FITC-triflavin 發出的螢光強度 來評估 xanthohumol 對 triflavin 結合到 glycoprotein IIb/IIIa complex 的 影響，結果顯示為刺激的血小板所測得 FITC-triflavin 之螢光值為 26.84 ± 0.5 (Figure. 8A)；當加入 EDTA 徹底影響 glycoprotein IIb/IIIa. 49.
(52) complex 構型後，所測得螢光值為 9.68 ± 0.51 (Figure. 8B) ；分別加 入不同濃度的 xanthohumol (1.5 和 3 μM) 所測得 FITC-triflavin 結合 到 glycoprotein IIb/IIIa complex 之螢光值分別為 26.78 ± 0.58 與 27.96 ± 0.65 (Figure. 8C 與 D)，表示 xanthohumol 無法有意義的抑制或干擾 FITC-triflavin 與血小板上 glycoprotein IIb/IIIa complex 的結合，代表 xanthohumol 抑 制 血 小 板 凝 集 的 作 用 並 非 經 由 活 化 glycoprotein IIb/IIIa complex。. 4. Xanthohumol 對 PLCγ2 磷酸化的影響 利用 western blotting 的技術，以及利用抗體認出 PLCγ2 磷酸化 的情形。由實驗結果顯示(Figure. 9)，在血小板未刺激的情況下只有 少許 PLCγ2 磷酸化的發生(lane 1)；若加入 collagen (1 μg/ml)可明顯地 看到 PLCγ2 磷酸化(lane 2)；若是分別加入 xanthohumol (1.5 和 3 μM) 可觀察到 PLCγ2 磷酸化明顯的受到抑制(lane 3 與 4)，且呈現與濃度 相關的抑制情形。. 5. Xanthohumol 對 47 kDa 蛋白質磷酸化(47 kDa protein phosphorylation)的影響 當 protein kinaase C(PKC)被活化後，能使其受質(47 kDa protein). 50.
(53) 磷酸化，本實驗即利用 Western blot 來測定 xanthohumol 對 47 kDa protein phosphorylation 抑制的情形。由 Figure. 10 可知，未活化的血 小板明顯可見在 47 kDa 的位置只有微量的蛋白質磷酸化發生(lane 1)；若以 collagen (1 μg/ml)當作刺激劑活化 PKC，明顯可見在 47 kDa 的位置上有蛋白質磷酸化的情形(lane 2)；當投與 xanthohumol (1.5 和 3 μM)與血小板懸浮液溫浴三分鐘後，再加入 collagen (1 μg/ml)刺激 劑，可發現 47 kDa protein phosphorylation 明顯的受到抑制(lane 3 和 4)，且呈現與濃度相關的抑制情形。. 6. Xanthohumol 對 protein kinaase C 活化劑(PDBu)所引起 的 47 kDa 蛋白質磷酸化與血小板凝集反應的影響 PDBu是protein kinase C的活化劑，亦可引起血小板凝集反應 (Kraft and Anderson, 1983; Niedel et al., 1983; Siess and Lapetina, 1989)。本實驗中，預先在人類血小板懸浮液中加入xanthohumol (1.5 和3 μM)溫浴三分鐘，再給予PDBu (150 nM)作為刺激，藉此觀察 xanthohumol是否會抑制PDBu誘發的凝集反應。結果由Figure. 11表 示，在未活化的血小板懸浮液中，在47 kDa的位置只有微量的蛋白質 磷酸化發生(lane 1)；若以PDBu (150 nM)當作刺激劑活化PKC，明顯 可見在47 kDa的位置上有蛋白質磷酸化的情形(lane 2)；若投與. 51.
(54) xanthohumol (1.5和3 μM)與血小板懸浮液溫浴三分鐘後，再加入PDBu (150 nM)刺激劑，可發現47 kDa protein phosphorylation不會受到抑制 (lane 3和4)。另外利用PDBu (150 nM)為刺激劑所誘發的血小板凝集反 應的結果發現，xanthohumol無法抑制PDBu所誘發的血小板凝集反 應，結果由Figure. 12表示，同時也驗證了Figure. 11的結果。. 7. Xanthohumol 對 MAPKs family 磷酸化的影響 Mitogen-activated protein kinases(MAPKs)為細胞對外界刺激反應 作用後之重要訊息介質，在體內訊息傳遞中扮演相當重要的角色。 Collagen 可以引起 mitogen-activated protein kinases(MAPKs)的活化 (Borsch-Haubold et al., 1995)，血小板內的 MAPKs 包括 p38 MAPK、 the extracellular signal-regulated kinase(ERKs)與 Jun N-terminal kinase (JNK)(Papkoff et al., 1994; Nadal et al., 1997; Bugaud et al., 1999)。本實 驗以西方墨點法(western blotting)的技術，以及利用抗體認出 p38 MAPK、ERKs 和 JNK 的位置來評估 MAPKs family 磷酸化的情形。 由 Figure. 13 顯示實驗結果 ，在血小板未刺激的情況下只有少許 p38 MAPK 磷酸化的發生(lane 1)；若加入 collagen (1 μg/ml)可明顯地看 到 p38 MAPK 磷酸化(lane 2)；若是分別加入 xanthohumol (1.5 和 3 μM) 溫浴三分鐘後再加入 collagen (1 μg/ml)，可發現 p38 MAPK 磷酸化明. 52.
(55) 顯的受到抑制(lane 3 與 4)。由 Figure. 14 顯示，在血小板未刺激的情 況下只有少許 ERKs 磷酸化的發生(lane 1)；若加入 collagen (1 μg/ml) 可明顯地看 ERKs 磷酸化(lane 2)；若是分別加入 xanthohumol (1.5 和 3 μM)之後用 collagen (1 μg/ml)作刺激，可觀察到 ERKs 磷酸化明顯的 受到抑制(lane 3 與 4)。由 Figure. 15 顯示，在血小板未刺激的情況下 只有少許 JNK 磷酸化的發生(lane 1)；若加入 collagen (1 μg/ml)可明顯 地看 JNK 磷酸化(lane 2)；若是分別加入 xanthohumol (1.5 和 3 μM)之 後用 collagen (1 μg/ml)作刺激，可觀察到 JNK 磷酸化明顯的受到抑制 (lane 3 與 4)，且呈現與濃度相關的抑制情形。. 8. Xanthohumol 對 Akt 磷酸化的影響 利用 western blotting 的技術，以及利用抗體認出 Akt 磷酸化的情 形。由實驗結果顯示(Figure. 16)，在血小板未刺激的情況下只有少許 Akt 磷酸化的發生(lane 1)；若加入 collagen (1 μg/ml)可明顯地看到 Akt 磷酸化(lane 2)；若是分別加入 xanthohumol (1.5 和 3 μM)可觀察到 Akt 磷酸化明顯的受到抑制(lane 3 與 4)，且呈現與濃度相關的抑制情形。. 9. Xanthohumol 對 血 小 板 細 胞 內 vasodilator-stimulated phosphoprotein 的影響 53.
(56) VASP(vasodilator-stimulated phosphoprotein)是一種具有調節性 抑制血小板活化作用的內生性蛋白質，它主要的功能是防止過度的凝 集反應發生，一些強力的血小板活化劑或是 NO donor 都會造成 VASP 的活化，例如 thrombin 與 nitroglycerin(NTG)。而 VASP 的磷酸化在 血小板中主要受到 cGMP 跟 cAMP 的調控，也就是當血小板細胞內 cGMP 或 cAMP 的濃度增加時，會促使 VASP 磷酸化，進而對過度的 血小板凝集反應產生抑制作用(Li et al., 2003)。根據 O’Brien 和 Born 等 人 (O'Brien J, 1962; Born and Cross, 1963) 之 混 濁 測 定 法 ， 以 Lumi-aggregometer (Payton, Canda)測量。由結果發現，血小板懸浮液 與 xanthohumol (3 μM)溫浴三分鐘後用 collagen (1 μg/ml)作刺激，血 小板的凝集會受到抑制；若預先與 guanylate cyclase 抑制劑 ODQ (40 μM) 和 adenylate cyclase 抑制劑 SQ22536 (200 μM) 溫浴三分鐘，再 加入 xanthohumol (3 μM)溫浴三分鐘後用 collagen (1 μg/ml)作刺激， 則血小板的凝集反應沒有恢復(Figure. 17)。代表 xanthohumol 抑制血 小板凝集的機轉不經由 cGMP 和 cAMP 引起的 VASP 路徑。. 10. Xanthohumol 對血小板細胞釋放 NO 的影響 當血小板受到一些活化劑刺激後，會引起 NO 的釋放，繼而活 化了 guanylate cyclase 來調控血小板的功能，collagen 可藉由活化細. 54.
(57) 胞內的 NOS 而引起 NO 釋放之增加(Radomski et al., 1990b; Radomski et al., 1990a; Radomski et al., 1991; Chiang et al., 2001)。由結果(Table. 1)可知，collagen (1 μg/ml)作用於血小板後，可使 NO 的含量由 0.5 ± 0.1 μM 有意義地增加到 2.5 ± 0.6 μM；而當我們加入不同濃度的 xanthohumol (1.5 和 3 μM)與血小板懸浮液反應三分鐘，發現 NO 的含 量沒有增加，分別為 0.6 ± 0.02 及 0.9 ± 0.2 μM，代表 xanthohumol 不 會刺激血小板細胞產生 NO。. 11. Xanthohumol 對血小板細胞內自由基釋放反應的影響 研究指 xanthohumol 具有抑制發炎和血小板活化反應的作用，而 發炎反應與血小板活化的過程都與自由基的產生有相當大的關聯，意 味著抑制自由基的產生似乎可影響血小板的活化。本實驗就以電子順 磁共振儀(electron spin resonance, ESR)直接分析血小板受 collagen 刺. .. 激活化後所釋放之 hydroxy radical (OH )是否會被 xanthohumol 抑制。 由 Figure. 18 可知，resting 狀態下並沒有 hydroxy radical 產生(Figure. 18A)；血小板受到 collagen (1 μg/ml)刺激之後，會釋放出 hydroxy radical(Figure. 18B)。若預先分別加入 xanthohumol (1.5 和 3 μM)反應 三分鐘，再以 collagen (1 μg/ml)刺激血小板，可觀察到 hydroxy radical 的產生明顯地被 xanthohumol 抑制(Figure. 18C 與 D)。由結果發現. 55.
(58) xanthohumol 具有自由基清除的抗氧化功效。. 12. Collagen 引起 p38、PKC、Akt 蛋白活化的訊息路徑 我們已知當血小板活化時，分別會去活化 p38、PKC、Akt 這三 個蛋白的表現量，我們想了解這三者之間的訊息路徑關係，測量方法 如＂實驗材料與方法＂中提及。由 Figure. 19 可知，預先與 PKC 抑制 劑 Ro318220 (10 μM)溫浴三分鐘，再用 collagen (1 μg/ml)作刺激，PKC 的蛋白表現量和單純使用 collagen 刺激的情況下相比會大量減少，預 先與 p38 抑制劑 SB203580 (2 μM)與 Akt 抑制劑 Ly294002 (10 μM)溫 浴三分鐘，再用 collagen (1 μg/ml)作刺激，PKC 的蛋白表現量和單純 使用 collagen 刺激的情況下相比沒有大太差異；由 Figure. 20 可知， 預先與 PKC 抑制劑 Ro318220 (10 μM) 溫浴三分鐘，再用 collagen (1 μg/ml)作刺激，p38 的蛋白表現量和單純使用 collagen 刺激的情況下 相比沒有大太差異，預先與 p38 抑制劑 SB203580 (2 μM)與 Akt 抑制 劑 Ly294002 (10 μM)溫浴三分鐘，再用 collagen (1 μg/ml)作刺激，p38 的蛋白表現量和單純使用 collagen 刺激的情況下相比則會有意義的減 少；由 Figure. 21 可知，預先與 PKC 抑制劑 Ro318220 (10 μM) 溫浴 三分鐘，再用 collagen (1 μg/ml)作刺激，Akt 的蛋白表現量和單純使 用 collagen 刺激的情況下相比沒有大太差異，預先與 p38 抑制劑. 56.
(59) SB203580 (2 μM)與 Akt 抑制劑 Ly294002 (10 μM)溫浴三分鐘，再用 collagen (1 μg/ml)作刺激，Akt 的蛋白表現量和單純使用 collagen 刺激 的情況下相比會有意義的降低。. 57.
(60) 四.討論及未來展望. Xanthohumol 大量存在啤酒花(Humulus lupulus)植物中，並且獨 特地只存在啤酒花當中，xanthohumol 是啤酒花當中含量最多的異戊 二烯類黃酮(prenylflavonoid)化合物，占乾燥重量的 0.1-1%。因此， 啤酒是人類攝取 xanthohumol 及其相關化合物的主要來源。由富含類 黃酮的啤酒花其生化特性推測啤酒花萃取物可以有效應用在癌症和 停經後婦女的熱潮紅和骨質疏鬆，有研究指出在啤酒製程中提高 xanthohumol 的含量可能可應用在醫藥方面的療效。(Stevens and Page, 2004)。 2003根據美國USDA(US Department of Agriculture, Economic Research Service)的統計，平均每個成年人每天會飲用225 mL的啤 酒，等同吸收了0.14 mg的異戊二烯類黃酮(prenylflavonoid)，雖然在 啤酒花天然生藥中含量最多的異戊二烯類黃酮成分是xanthohumol， 但在啤酒製程中的熱處理會將有抗氧化能力的xanthohumol結構轉成 沒有抗氧化能力isoxanthohumol(Stevens et al., 1999a; Miranda et al., 2000)，因此嘗試提高啤酒中的xanthohmol含量或是飲用以低溫膜過濾 技術製成的生啤酒(draft beer)會比高溫殺菌製成的熟啤酒(beer)獲得 較多的xanthohmol。. 58.
(61) 自由基會啟始多元不飽和脂肪酸、蛋白質與核酸的衍生作用 (modification)，這和動脈硬化、癌症形成和神經退化疾病的早期發展 有相關性(Evans and Halliwell, 1999)。啤酒內含有的抗氧化物質有許 多種，比起225 ml含有0.14 mg的異戊二烯類黃酮(prenylflavonoid)，啤 酒中含有的多酚類(polyphenols)抗氧化物質含量更多，有42 mg之多 (Vinson et al., 2003)，從總量看起來似乎啤酒具有抗氧化能力是多酚 類(polyphenols)的貢獻較高，然而異戊二烯類黃酮(prenylflavonoid)的 結構比多酚類(polyphenols)有更大親脂性，因此雖然含量較少，可是 在細胞膜表面與低密度脂蛋白上可能會是更有效的抗氧化劑(Stevens et al., 2003)。 以不同刺激劑誘發HL-60人類前骨髓細胞(human promyelocytic leukemia cells)產生superoxide anion自由基，發現xanthohmol抑制的 IC50是2.6 μM，而isoxanthohumol並沒有抑制自由基的作用(Gerhauser et al., 2002)，在本實驗中xanthohmol抑制血小板凝集的IC50是1.5 μM， Max concentration 是 3 μM ， 都 可 以 抑 制 collagen 刺 激 下 所 釋 放 之. .. hydroxy radical (OH )，證實xanthohmol確實有抗氧化的能力。有鑑於 適度飲酒有助心血管疾病的預防，啤酒花成分中的xanthohmol有抗氧 化的能力，但在血小板細胞中的研究與機轉上未明確，因此本實驗想 進一步探討xanthohmol是否有抑制血小板凝集的作用。. 59.
(62) 結果顯示xanthohmol (0.5-10 μM)可有效抑制由collagen (1 μg/ml) 及arachidonic acid (60 μM)引起的血小板凝集，但此濃度範圍內對於 U46619 (1 μM)、thrombin (0.05 U/ml)引起的血小板凝集則沒有抑制反 應。此外，xanthohmol也明顯抑制collagen (1 μg/ml)引起的ATP釋放反 應。由此可知，xanthohmol確實可抑制血小板的活性。接著便進一步 探 討 抑 制 凝 集 的 機 轉 ， 使 用 collagen 當 刺 激 劑 ， 因 為 1.5-3 μM 的 xanthohmol便可明顯的抑制collagen引起的血小板凝集。而且在人體 血液中，血管受傷時釋放出來的細胞外基質也是以collagen最多，血 管壁另外還釋放了fibronectin和laminin等adhesion proteins，使血管中 流動的血小板吸附到受傷的血管壁上，然後在藉collagen活化血小 板，活化的血小板會接著釋放TxA2、ADP與serotonin等物質(Dorsam et al., 2002)，造成血小板活化的放大反應，吸引了更多血小板的活化和 聚集，而達到止血與修補傷口的功能。 血小板受到活化劑的刺激而造成凝集的過程中，會發生血小板形 狀改變(shape change)、細胞骨架重新排列(cytoskeleton rearrangement) 以及 granules 分泌作用，這些現象與細胞內蛋白質的磷酸化有很大關 連，位在細胞膜下方的 protein kinase C(PKC)及其下游的受質 p47 protein 磷酸化亦有參與(Siess, 1989)。我們想了解 xanthohmol 抑制 collagen 引起的血小板凝集反應是否經由 PKC pathway。PDBu 是一. 60.
(63) 種 PKC 的活化劑，可直接作用在 PKC 的 regulatory site，活化 PKC 後又可繼續活化其下游的受質 p47 protein(Nishizuka, 1984)，於是我們 使用 PDBu 當作活化劑，觀察血小板凝集的反應以及 p47 蛋白磷酸化 的情形。由 figure. 12 得知，xanthohumol (1.5-3 μM)不會抑制 150 nM PDBu 引起的血小板凝集，由 Figure. 11 得知，xanthohumol (1.5-3 μM) 不會抑制 150 nM PDBu 引起的 p47 蛋白磷酸化表現，但可以抑制 collagen (1 μg/mL) 引 起 p47 蛋 白 磷 酸 化 表 現 (Figure. 10) ， 代 表 xanthohumol 不會直接作用在細胞膜上而是藉由其他訊息活化 PKC 及 其下游受質 p47 protein。 PLCγ的活化會使細胞膜上的 PIP2 水解成 IP3 和 DAG，被認為是 參與血小板活化後最初和最重要的路徑，PLCγ活化後產生的 IP3 會使 血小板細胞內鈣離子的移動顯著地增加(Berridge, 1983)，DAG 則會促 使 PKC 活化接著 p47 protein 蛋白質磷酸化，由 Figure. 9 得知， xanthohumol (1.5-3 μM)可以抑制 collagen (1 μg/mL)引起 PLCγ2蛋白 磷酸化表現。 有研究指出，血小板受到 collagen 活化的過程當中會促使 hydroxy. .. radical(OH )自由基的產生，接著會刺激並活化 PLA2 與 COX，目的是 放大血小板活化反應(Pignatelli et al., 1998)，由於 xanthohmol (2.6 μM) 抗氧化與抑制自由基的作用(Gerhauser et al., 2002)，於是我們便想觀. 61.
(64) 察 xanthohmol (1.5-3 μM) 是否可以抑制 collagen (1 μg/ml)造成血小. .. 板或化過程中產生的 hydroxy radical (OH )自由基。由實驗結果(Figure.. .. 18)發現 xanthohmol (1.5-3 μM)可有效抑制 hydroxy radical(OH )自由 基的產生，雖然機轉不明確，但猜測 xanthohmol 清除自由基的作用 可能經由 phospholipase A2-cyclooxygenase pathway，抑制了 TxA2 的合 成，進而抑制血小板凝集。這樣的猜測也在 xanthohmol 可以抑制 arachidonic acid (60 μM)誘發的血小板凝集反應中得到驗證，IC50 和 max concentration 為 3.5 和 5 μM。當血小板受到活化劑的刺激後，會 活化 PLA2，並且將細胞膜上的磷脂質水解成 arachidonic acid，接著 藉由 cyclooxygenase 將 arachidonic acid 環化成 PGG2/PGH2，再經由 thromboxane synthetase 的作用形成 TxA2，TxA2 釋放到細胞膜外與血 小板膜上的 thromboxane receptor 結合，再造成其他路徑的活化，放 大了血小板的凝集反應(Puri, 1998)。由 xanthohmol 能夠有意義的抑制 抑制 arachidonic acid 誘發的血小板凝集反應可知，xanthohmol 可能透 過 PLA2 與 COX 路徑，抑制 TxA2 形成，達到抗氧化與抑制血小板凝 集的作用。 eNOS 已被研究存在於血小板之中，並且是 Ca2+-dependent 的活 化路徑，當血小板活化後細胞內鈣離子大量且快速的增加，活化了 eNOS 接著產生 NO，NO 的作用在回饋抑制血小板的凝集反應. 62.
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