Xanthohumol 大量存在啤酒花(Humulus lupulus)植物中，並且獨 特地只存在啤酒花當中，xanthohumol 是啤酒花當中含量最多的異戊 二烯類黃酮(prenylflavonoid)化合物，占乾燥重量的 0.1-1%。因此，
啤酒是人類攝取xanthohumol 及其相關化合物的主要來源。由富含類 黃酮的啤酒花其生化特性推測啤酒花萃取物可以有效應用在癌症和 停經後婦女的熱潮紅和骨質疏鬆，有研究指出在啤酒製程中提高 xanthohumol 的含量可能可應用在醫藥方面的療效。(Stevens and Page, 2004)。
2003根據美國USDA(US Department of Agriculture, Economic Research Service)的統計，平均每個成年人每天會飲用225 mL的啤 酒，等同吸收了0.14 mg的異戊二烯類黃酮(prenylflavonoid)，雖然在 啤酒花天然生藥中含量最多的異戊二烯類黃酮成分是xanthohumol，
但在啤酒製程中的熱處理會將有抗氧化能力的xanthohumol結構轉成 沒有抗氧化能力isoxanthohumol(Stevens et al., 1999a; Miranda et al., 2000)，因此嘗試提高啤酒中的xanthohmol含量或是飲用以低溫膜過濾 技術製成的生啤酒(draft beer)會比高溫殺菌製成的熟啤酒(beer)獲得 較多的xanthohmol。
自由基會啟始多元不飽和脂肪酸、蛋白質與核酸的衍生作用 (modification)，這和動脈硬化、癌症形成和神經退化疾病的早期發展 有相關性(Evans and Halliwell, 1999)。啤酒內含有的抗氧化物質有許 多種，比起225 ml含有0.14 mg的異戊二烯類黃酮(prenylflavonoid)，啤 酒中含有的多酚類(polyphenols)抗氧化物質含量更多，有42 mg之多 (Vinson et al., 2003)，從總量看起來似乎啤酒具有抗氧化能力是多酚 類(polyphenols)的貢獻較高，然而異戊二烯類黃酮(prenylflavonoid)的 結構比多酚類(polyphenols)有更大親脂性，因此雖然含量較少，可是 在細胞膜表面與低密度脂蛋白上可能會是更有效的抗氧化劑(Stevens et al., 2003)。
以不同刺激劑誘發HL-60人類前骨髓細胞(human promyelocytic leukemia cells)產生superoxide anion自由基，發現xanthohmol抑制的 IC50是2.6 μM，而isoxanthohumol並沒有抑制自由基的作用(Gerhauser et al., 2002)，在本實驗中xanthohmol抑制血小板凝集的IC50是1.5 μM，
Max concentration 是 3 μM，都可以抑制collagen刺激下所釋放之 hydroxy radical (OH
.
)，證實xanthohmol確實有抗氧化的能力。有鑑於 適度飲酒有助心血管疾病的預防，啤酒花成分中的xanthohmol有抗氧 化的能力，但在血小板細胞中的研究與機轉上未明確，因此本實驗想 進一步探討xanthohmol是否有抑制血小板凝集的作用。
結果顯示xanthohmol (0.5-10 μM)可有效抑制由collagen (1 μg/ml) 及arachidonic acid (60 μM)引起的血小板凝集，但此濃度範圍內對於 U46619 (1 μM)、thrombin (0.05 U/ml)引起的血小板凝集則沒有抑制反 應。此外，xanthohmol也明顯抑制collagen (1 μg/ml)引起的ATP釋放反 應。由此可知，xanthohmol確實可抑制血小板的活性。接著便進一步 探 討 抑 制 凝 集 的 機 轉 ， 使 用collagen當刺激劑，因為1.5-3 μM的 xanthohmol便可明顯的抑制collagen引起的血小板凝集。而且在人體 血液中，血管受傷時釋放出來的細胞外基質也是以collagen最多，血 管壁另外還釋放了fibronectin和laminin等adhesion proteins，使血管中
流動的血小板吸附到受傷的血管壁上，然後在藉collagen活化血小
板，活化的血小板會接著釋放TxA2、ADP與serotonin等物質(Dorsam et al., 2002)，造成血小板活化的放大反應，吸引了更多血小板的活化和 聚集，而達到止血與修補傷口的功能。
血小板受到活化劑的刺激而造成凝集的過程中，會發生血小板形 狀改變(shape change)、細胞骨架重新排列(cytoskeleton rearrangement) 以及granules 分泌作用，這些現象與細胞內蛋白質的磷酸化有很大關 連，位在細胞膜下方的 protein kinase C(PKC)及其下游的受質 p47 protein 磷酸化亦有參與(Siess, 1989)。我們想了解 xanthohmol 抑制 collagen 引起的血小板凝集反應是否經由 PKC pathway。PDBu 是一
種 PKC 的活化劑，可直接作用在 PKC 的 regulatory site，活化 PKC 後又可繼續活化其下游的受質p47 protein(Nishizuka, 1984)，於是我們 使用PDBu 當作活化劑，觀察血小板凝集的反應以及 p47 蛋白磷酸化 的情形。由figure. 12 得知，xanthohumol (1.5-3 μM)不會抑制 150 nM PDBu 引起的血小板凝集，由 Figure. 11 得知，xanthohumol (1.5-3 μM) 不會抑制 150 nM PDBu 引起的 p47 蛋白磷酸化表現，但可以抑制 collagen (1 μg/mL) 引 起 p47 蛋 白 磷 酸 化 表 現 (Figure. 10) ， 代 表 xanthohumol 不會直接作用在細胞膜上而是藉由其他訊息活化 PKC 及 其下游受質p47 protein。
PLCγ的活化會使細胞膜上的 PIP2水解成 IP3和 DAG，被認為是
參與血小板活化後最初和最重要的路徑，PLCγ活化後產生的 IP3會使 血小板細胞內鈣離子的移動顯著地增加(Berridge, 1983)，DAG 則會促 使 PKC 活化接著 p47 protein 蛋白質磷酸化，由 Figure. 9 得知，
xanthohumol (1.5-3 μM)可以抑制 collagen (1 μg/mL)引起 PLCγ2蛋白 磷酸化表現。
有研究指出，血小板受到collagen 活化的過程當中會促使 hydroxy radical(OH
.
)自由基的產生，接著會刺激並活化 PLA2與COX，目的是 放大血小板活化反應(Pignatelli et al., 1998)，由於 xanthohmol (2.6 μM) 抗氧化與抑制自由基的作用(Gerhauser et al., 2002)，於是我們便想觀
察xanthohmol (1.5-3 μM) 是否可以抑制 collagen (1 μg/ml)造成血小 板或化過程中產生的hydroxy radical (OH
.
)自由基。由實驗結果(Figure.
18)發現 xanthohmol (1.5-3 μM)可有效抑制 hydroxy radical(OH
.
)自由 基的產生，雖然機轉不明確，但猜測 xanthohmol 清除自由基的作用 可能經由phospholipase A2-cyclooxygenase pathway，抑制了 TxA2的合 成，進而抑制血小板凝集。這樣的猜測也在 xanthohmol 可以抑制 arachidonic acid (60 μM)誘發的血小板凝集反應中得到驗證，IC50和 max concentration 為 3.5 和 5 μM。當血小板受到活化劑的刺激後，會
活化 PLA2，並且將細胞膜上的磷脂質水解成 arachidonic acid，接著 藉由 cyclooxygenase 將 arachidonic acid 環化成 PGG2/PGH2，再經由 thromboxane synthetase 的作用形成 TxA2，TxA2釋放到細胞膜外與血 小板膜上的 thromboxane receptor 結合，再造成其他路徑的活化，放 大了血小板的凝集反應(Puri, 1998)。由 xanthohmol 能夠有意義的抑制 抑制arachidonic acid 誘發的血小板凝集反應可知，xanthohmol 可能透 過PLA2與COX 路徑，抑制 TxA2形成，達到抗氧化與抑制血小板凝 集的作用。
eNOS 已被研究存在於血小板之中，並且是 Ca2+-dependent 的活 化路徑，當血小板活化後細胞內鈣離子大量且快速的增加，活化了 eNOS 接著產生 NO，NO 的作用在回饋抑制血小板的凝集反應
(Radomski et al., 1990a; Radomski et al., 1990b)。NO 是體內血小板活 化的負向調控因子，在血小板活化的同時產生，可避免血小板的過度 活化，所以 NO 是一個心血管疾病的保護因子。在 Table.1 當中，溫 浴collagen (1 μg/ml)的血小板，可使血小板凝集而且 NO 的含量有意 義地增加；而當我們溫浴xanthohumol (1.5 和 3 μM)，發現 NO 的含 量沒有增加，代表 xanthohumol 不會刺激血小板細胞產生 NO，也就 是xanthohumol 不會經由 eNOS 路徑抑制血小板的凝集。值得一提的 是，有研究指出在其他的細胞中 xanthohumol 可有效抑制 iNOS 所產
生的NO，而達到抗發炎的作用，而其中可能還牽涉了許多訊息路徑
調控發炎訊息(Zhao et al., 2003; Cho et al., 2008)。
有 研 究 指 出 ，p38 MAPK 與 ERK 也 會 透 過 phospholipase A2-cyclooxygenase pathway 活化血小板(Borsch-Haubold et al., 1997)。
p38MAPK 與 ERK 皆 屬 於 MAPKs familys 。 血 小 板 中 有 表 現 的 MAPKs 包 含 p38 MAPK 、 ERK 以 及 JNK ， 由 collagen 刺 激 而 產 生 (Borsch-Haubold et al., 1995)。血小板中ERK的表現會受collagen、
TxA2 與 vWF的刺激所產生(Papkoff et al., 1994; Borsch-Haubold et al., 1995; Borsch-Haubold et al.,1997)。在collagen低濃度(10 μg/ml)以 下，本實驗中使用的collagen為(1 μg/ml)，ERK的活化主要是經由 collagen receptors(GPVI 與 α2β1) 與 Gq-coupled TxA2 的 參 與
(Borsch-Haubold et al., 1997)。並透過 PLA2-AA-TxA2路徑去活化COX pathway 然後促進血小板活化。本實驗中 xanthohumol (1.5 和 3 μM)
可以抑制 collagen 所誘發的 p38 MAPK 磷酸化，也可以抑制其他 MAPKs family：ERK 和 JNK 的磷酸化，同時在這個濃度下也可以抑 制血小板活化過程中產生的自由基。由以上結果可知，xanthohumol 可能經由抑制 p38 MAPK 的活性來調控 cytosolic phospholipase A2
(PLA2)，當 PLA2活性降低時會減少 TxA2的生成，進而影響血小板凝 集反應。
除了 PLA2 pathway 和 PLC pathway 這兩條路徑外，cAMP 和 cGMP 在血小板中也扮演著很重要的負向調控角色，cAMP 和 cGMP 的生成分別受到adenylate cyclase 和 guanylase 的調控，cAMP 和 cGMP 的分解則會受到不同型的 phosphodiesterases(PDEs)調控，cAMP 和 cGMP 平時在細胞中維持正常的含量，但當 cAMP 或 cGMP 含量增加 時會活化 cAMP-dependent protein kinase(CAK)或 cGMP-dependent protein kinase(CGK)，CAK 和 CGK 都可將 vasodilator-stimulated phosphoprotein(VASP)磷酸化(Butt et al., 1994)。VASP 是一種具抑制血
小板活化作用的蛋白質，功能是防止過度的凝集反應發生，當VASP
結構中的Ser157、Ser239與Thr278的位置皆可被 CAK 和 CGK 磷酸化而
活化。活化後的VASP 可和血小板細胞中的一些纖維蛋白作用以達到
抑制血小板過度活化之目的(Reinhard et al., 1992)。在實驗中使用 ODQ(GC inhibitor)與 SQ22536(AC inhibitor)去看抑制了抑制血小板過
度活化的VASP 路徑，是否發生逆轉現象而恢復血小板的凝集反應，
由 Figure. 16 中可知，xanthohumol 無法逆轉使用 ODQ 與 SQ22536 後的血小板抑制凝集反應，所以xanthohumol 抑制血小板凝集反應沒 有經過cAMP 和 cGMP 的路徑。此現象與 xanthohumol (1.5 和 3 μM) 不會產生 NO(Table. 1)相符合，因為 xanthohumol 不會經由 eNOS 產 生NO，也就不會活化 guanyl cyclase 和造成 cGMP 含量的增加。
由 Figure. 19 中，預先與 p38 抑制劑 SB203580 (2 μM)與 Akt 抑
制劑Ly294002 (10 μM)溫浴三分鐘，再用 collagen (1 μg/ml)作刺激，
PKC 的蛋白表現量和單純使用 collagen 刺激的情況下相比沒有大太 差異，代表p38 與 Akt 可能在 PKC 的下游或與 PKC 無關，所以使用 p38 抑制劑與 Akt 抑制劑並不會影響 PKC 的蛋白表現。由 Figure. 20 中， PKC 抑制劑 Ro318220 (10 μM)不會影響 p38 的蛋白表現量，代 表PKC 與 p38 沒有直接關係，而 Figure. 21 中， PKC 抑制劑 Ro318220 (10 μM)不會影響 Akt 的蛋白表現量，代表 PKC 與 Akt 沒有直接關係。
由Figure. 20 與 21 當中可知 p38 與 Akt 會互相影響蛋白磷酸化，這代 表著血小板活化過程中的訊息路徑有cross-link 的關係。
在血小板受到刺激的過程中，細胞內鈣離子的移動和濃度的增加
是血小板活化的關鍵步驟。當細胞內鈣離子濃度增加會誘發一連串活 化反應(Quinton et al., 2002a; Quinton et al., 2002b)。鈣離子也會促使 Ca2+-calmodulin dependent myosin light chain 磷酸化、肌動蛋白聚合化 (actin polymerization)及纖維絲重新組織(filament reorganization)，而造 成granule 釋放(Nishikawa et al., 1980; Brass and Joseph, 1985)，進一步 導致血小板活化。由實驗結果顯示(Figure. 6 與 7)，xanthohumol 有效 的抑制collagen 引起的細胞內鈣離子移動和濃度的增加。而血小板活 化的最終步驟就是glycoprotein IIb/IIIa 受體的活化，也就是藥物只要 能阻斷這個受體，像 triflavin 就有這個作用，就能抑制血小板的凝集 (Sheu et al., 1992b)。因為血小板之間的凝集是以 fribinogen 為中間橋 樑，fribinogen 是一個二聚物(dimer)，具有 RGD(Arg-Gly-Asp)序列，
它就是利用這個 RGD 序列結合到活化的 glycoprotein IIb/IIIa 受體，
然後將血小板連結在一起(Sheu et al., 1992a)。實驗結果顯示(Figure.
8)，xanthohumol 無法與 triflavin 競爭 glycoprotein IIb/IIIa 受體，這意 味著 xanthohumol 抑制血小板凝集的作用並不是透過 fribinogen 與 glycoprotein IIb/IIIa 受體的結合，而是經由血小板細胞內一連串的訊 息活化路徑造成凝集。
由本實驗結果可證實，在 in vitro 環境中 xanthohumol 具有抑制血 小板活性的作用。因此在未來的實驗中，還可以運用 xanthohumol 的
這些作用，例如利用fluorescin sodium 誘導腸繫膜之靜脈栓塞，以及
這些作用，例如利用fluorescin sodium 誘導腸繫膜之靜脈栓塞，以及