1-1 研究背景
啤酒花(Humulus lupulus)
啤酒之生產，可追溯到四千年前埃及的古文明，是一種具長遠歷 史而廣為接受的一種飲料。啤酒的主要原料是大麥芽、啤酒花、酵母、
水。適度飲酒對心血管的保護作用已經被許多研究證實(Rayo Llerena and Marin Huerta, 1998; Samanek, 2000)，抗粥狀動脈硬化與提加高密 度脂蛋白(HDL)被認為是飲用酒類可保護冠狀動脈硬化的最可能機 轉。其他可能的機轉還有抑制血小板的活性，包含抑制凝血功能和血 栓形成，以達心血管的保護作用(Constant, 1997; de Gaetano et al., 2003)。
啤酒花(Hop)，又名忽布子，學名為 Humulus lupulus，是一種蔓 藤性植物，啤酒花的雌株花序在製造啤酒的過程中是必備的成分，用 來 增 加 啤 酒 的 風 味 和 穩 定 製 程 中 的 泡 沫 產 生(Vanhoecke et al., 2005)。在啤酒的製程中，啤酒花與麥汁混合物被煮沸以吸取啤酒花 的味道，其所含的軟性樹脂和精油能賦予啤酒特殊的芳香和苦味，再 起色和消毒。在煮沸後，加入啤酒花的麥汁被泵入迴旋沉澱槽以去除 不需要的啤酒花剩餘物和不溶性的蛋白質。
啤酒花的成分由一群複合物組成，苦味由苦味質(bitter acid; soft resin)：α-acid (hunulones：C21H30O5)及 β-acid (lupulone：C26H38O4)及 其多種異構物所構成。香味則由啤酒花之精油(essence oil)主要含 (C5H8)n 之 terpene 成 份 如 ： myrcene(C10H16) 、 linalool(C10H18O) 、 humulene(C15H24)，酮類成分如：luparone(C13H22O)與醇類成分如：
curcumol(C15H24O2)與 luparol(C16H26O2)等多種化合物所組成。
啤酒花曾用作中草藥治療睡眠障礙、當作輕微鎮定劑或健胃劑。
在過去的十年間有許多的藥理研究都想藉由 in vitro 或 in vivo 的方法 找出傳統醫療中使用啤酒花的科學證據。目前研究 Humulus lupulus 的藥理作用有神經鎮定、類雌性素活性、抗癌、抗菌以及腸胃道反應 等方面。隨著啤酒花的研究，啤酒花的成分中研究最多的莫過於 xanthohumol 和 8-prenylnaringenin，xanthohumol 具有廣效的抗癌效果 (Zanoli and Zavatti, 2008)和抗氧化作用(Yamaguchi et al., 2009)，而 8-prenylnaringenin 被認為是最強效的植物雌激素(phytoestrogen)。
黃腐醇(Xanthohumol)
啤酒花的成分中除了提供苦味和香味的苦味質(bitter acid)和精 油(essence oil)之外，尚有一群異戊二烯類黃酮(phenylflavonoids)的化 合物，其中最重要的成分便是xanthohumol，占有乾燥啤酒花成分的
1 %，比其他類似結構化合物多了10~100倍(Stevens et al., 1999b)。
xanthohumol 在 適 當 加 熱 與 提 高 pH 的 環 境 下 會 轉 變 成 isoxanthohumol(異黃腐醇)，因此黃腐醇和異黃腐醇是啤酒中最主要 的異戊二烯類黃酮類化合物，而在人類的小腸微生物群(intestinal microflora)(Possemiers et al., 2006)或肝臟細胞色素(cytochrome P450 enzymes)(Guo et al., 2006) 作 用 下 isoxanthohumol 會 再 轉 變 成 8-prenylnaringenin。因此，沒有類雌性素活性的xanthohumol可轉變成 有 類 雌 性 素 活 性 的isoxanthohumol 和 8-prenylnaringenin(Zanoli and Zavatti, 2008)。
Xanthohumol (3'-[3,3-dimethylallyl]-2',4',4-trihydroxy-6'-methoxy- chalcone)(Figure.1)，啤酒花的類黃酮類成分之一，化學式為C21H22O5， 分子量354.40，是黃色的偏酸性粉末，可溶於所有的有機溶劑。過去 十年來的研究都集中在其抗癌方面的活性，因為xanthohumol可有效 抑制啟始(initiation)和增生(prolifreation)，抑制癌細胞的發展歷程和表 現(Colgate et al., 2007)，在目前的研究中，xanthohumol (2-200μM)可 以抑制老鼠的血管增生(angiogenesis);在治療xanthohumol (20 μM)二 十天後，可有效抑制KS-IMM tumors(Kaposi’s sarcoma cell line)的生長 速率。目前的研究顯示xanthohumol與抗癌和抗氧化有關，但只限於 實驗室內的研究，尚未應用到臨床上。
黃 腐 醇 和 它 的 相 關 化 合 物 為 了 鑑 定 它 的 細 胞 毒 性 使 用 sulforhodamine B assay 分析方法和四種不同的人類癌細胞株：
A549(肺細胞)、SK-OV-3(卵巢細胞)、SK-MEL-2(黑色素細胞瘤)和 HCT-15( 結 腸 細 胞 ) 。 在 xanthohumol 、 Isoxanthohumol 、 8-prenylnaringenin 、 xanthohumol 4'-O-beta-D-glucopyranoside 和 (2S)-5-methoxy-8-prenyl naringenin 7-O-beta-D-glucopyranoside 之中，
xanthohumol 有最強的細胞毒性，也在抗癌方面是最有研究價值的。
Xanthohumol 具有抑制 DNA topoisomerase I 的活性，此外 drug efflux genes 也被研究來預測抗藥性，實驗結果證實 xanthohumol 具有抑制 topoisomerase I 的抗癌效果，也可與其他抗癌藥併用，藉由抑制 efflux drug transporters 來減少抗藥性(Lee et al., 2007)。
巨噬細胞是ㄧ級免疫作用中主要反應的細胞，它們可以被葛蘭氏 陰性菌所產生的 lipopolysaccharide(LPS)或宿主免疫細胞的干擾素 interferon-gamma 所 活 化 ， 研 究 顯 示 xanthohumol 可 有 效 抑 制 IL-1beta、TNF-alpha 以及 iNOS 等發炎因子引起的巨噬細胞，猜測 xanthohumol 可能透過許多訊息路徑調控發炎訊息(Zhao et al., 2003;
Cho et al., 2008)。由研究顯示從啤酒花萃取之類黃酮成分化合物有抑 制peroxynitrite 引起的氧化作用，人類攝食類黃酮大多透過啤酒，每 公升的啤酒含有四毫克的類黃酮化合物，啤酒中含有的 xanthohumol
具有抑制peroxynitrite 引起的氧化作用(Yamaguchi et al., 2009)，意外 地發現xanthohumol 經熱度和酸度轉換的化合物 isoxanthohumol 則不 具有抗氧化作用(Stevens et al., 2003)。因此，xanthohumol 是啤酒中含 量最多的類黃酮類抗氧化物質。
血小板(platelet)
血小板在循環系統中扮演很重要的生理角色，主要是參與凝血反 應。有許多不同物質都可以造成血小板的活化，當血小板和這些物質 接觸幾秒之內就可以發揮活化反應。血小板在 in vitro 的環境中利用 血小板凝集器可以觀察到許多不同的反應，例如：吸附(adhesion)、
外 型 改 變(shape change) 、 凝 集 反 應 (aggregation) 以 及 分 泌 作 用 (secretion)，這些現象與 in vivo 環境下所發生的凝血反應都很類似，
因此我們可以藉由離體實驗預測藥物在人體的作用效果。一般生理狀 態下血小板的活化指的是細胞外的刺激訊息與血小板表面的受體 (receptor)結合，這些訊息透過細胞膜上 GTP-binding proteins 轉換成 另 一 種 型 式 繼 續 傳 遞 到 細 胞 膜 內 側 動 器(effector) 並 活 化 特 異 性 effector system，例如：ion channels 或 phospholipase C-induced inositol phospholipids hydrolysis ， 接 著 調 控 二 次 訊 息 的 強 弱 ， 包 括 ： IP3
(inositol-1,4,5-trisphosphate)、Ca2+、DAG、cAMP 與 cGMP，藉由蛋
白質磷酸化、酵素活化以及蛋白質結構的改變來引發多變的機轉路 徑。每一個受體活化所引起的訊息傳遞都有一定的前後順序並且每個 路徑之間都有複雜的交互反應。
血小板在生理和病理情況下扮演的角色
血小板在止血(haemostasis)過程中扮演非常重要的角色，當人體 受傷時會自動啟動血小板活化路徑，在幾分鐘之內達到凝血的止血保 護效果，血小板功能不全的疾病，如: glanzmann thrombasthenia 是一 種先天性凝血異常疾病，患者受傷時血液無法正常凝結，血流不止會 有生命危險。
當血管壁受傷時，內皮下層(subendothelium)會暴露出 collagen，
當血小板與collagen 結合後就會引發血小板活化反應，血小板活化後 使細胞內分泌型胞器：Dense granules、α granules 釋放 ADP 和 thromboxane A2，促使血小板活化加劇，最後在受傷的地方形成血栓，
而達止血效果。
另一方面，血小板過度地活化可能是造成許多血栓和栓塞現象 (thrombo-embolic phenomena)的原因，尤其是在動脈部位，不正常的 血小板活化可能導致心肌梗塞和中風的危險。血小板的凝集反應 (aggregation)可以使用抗血小板藥物來預防，例如：aspirin(acetyl
salicylic acid)是一個使用最久，運用最廣的藥物。Aspirin 目前當作是 腦血管病變(cerebrovascular accident)及心肌梗塞(myocardial infarction) 的預防用藥。短暫性缺血的發作(transient ischaemic attacks)、心絞痛 (angina pectoris)與跛行(claudication)這些急性栓塞的併發症都可藉由 規律地服用 aspirin 來改善。抗血小板療法可有效的降低不穩定型心 絞痛、急性心肌梗塞與短暫局部缺血發作的死亡率(Cavallari and Momary, 2009)。
血小板的超顯微結構
正常血液循環中的血小板是圓盤狀無核的細胞，源自於骨髓內的 巨核細胞(megakaryocyte)，寬約 3 μm，厚約 1 μm，是人體最小的
血液細胞，細胞膜由兩層磷脂質構成，上面佈滿連結細胞內部細管系 統(canalicular system)的通道(channel)，帶負電的 PI(phosphotidyl)和 PS(phosphotidylsereine) 位 在 膜 上 靠 近 細 胞 質 的 一 側 ， 作 為 phospholipase 的 受 質 (substrates) ， 雙 層 磷 脂 質 上 鑲 嵌 有 許 多 glycoproteins，如:GP Ia/IIa、GP Ib、GP IIb/IIIa 與 GP IV，並且突出細 胞膜外作為活化劑或抑制劑的受體。他們位在細胞質的一端會與血小 板 的 內 縮 系 統(contractile system)的成分連接，例如 GP Ib 會和 actin-binding protein 連接(Fox, 1985)；而 GP IIb/IIIa 則與 actin filaments
連接(Painter et al., 1985)。
血小板的細胞骨架主要由 actin 組成，約占全部血小板的 15~20
%。Actin filaments 主要是由 tropomysin、α-actin 與 actin-binding protein 組 成 。 當 血 小 板 活 化 ，myosin 會 和 actin 結 合 以 提 供 granule centralization 所需的張力(Fox and Phillips, 1982)。另外，血小板另有 一些細胞膜骨架，由 short actin filament 與 actin-binding protein 組成，
連接到細胞膜上的GP Ia/IIa 與 GP Ib，主要功能是穩定細胞膜以及調
整細胞膜的形狀。除此之外，細胞膜下方還存在由 tubulin 組成之
microtubular coil，用來維持未受刺激之血小板成圓盤狀(Maxwell et al., 2006)。
Dense tubular system 和其他種類細胞內的平滑內質網(smooth endoplasmic reticulum)相同，用來儲存鈣離子以及合成 prostaglandin 所需要的酵素，它們的位置接近open canalicular system channel 並形 成membrane complex。
血小板細胞質內有許多胞器，包括：粒線體(mitochondriae)、醣 原 顆 粒 (glycogen particles) 、 溶 媒 體 (lysosomes) 與 過 氧 化 體 (peroxisomes)。α granules 和 dense granules 內含有大部分的蛋白質，
例如：platelet factor 4、β-thromboglobulin、platelet derived growth factor、fibrinogen、fibronectin、thrombospondin、plasminogen activator、
inhibitor-1 與 vWF。Dense granules 則富含 serotonin、ADP (adenosine diphosphate) 與 鈣 離 子 。α granules 內 尚 存 在 著 很 少 量 的 抗 原 ： α2-antiplasmin(Plow and Collen, 1981)。
當血小板活化時，會改變原本的圓盤狀，變得相當圓而延長且伸 出偽足。所有的胞器會集中並且被 microtubules 與 microfilaments 剛 形成之環狀結構圈在細胞中央。最後分泌型胞器的內容物會釋放出 來。在分泌的過程中，granule membrane 會連接到 canalicular systen 的開口處，並且和 internal granular membrane proteins，例如：P-selectin 一起融入細胞膜內。很容易就可以引起dense granules secretion，但α granules secretion 必須受到高濃度的致效劑刺激才會釋放出內容物；
而 且 只 有 在 受 到 thrombin 或 高 濃 度 collagen 刺 激 下 才 會 引 起 lysosomal granules secretion。此外，血小板受到強的致效劑刺激時也 會產生並釋放出TxA2(thromboxane A2)與 PAF (platelet activation factor)
作為一種positive feedback 的機制。
血小板活化的機轉 Platelet receptor
血小板可藉由生理性(thrombin、TxA2、collagen、ADP、PAF、
serotonin 及 epinephrine 等)及藥理性(calcium、ionophores 及 cyclic
endoperoxide analogues 等)的刺激而活化。這些致效劑可透過血小板 細 胞 膜 上 專 一 性 的 受 體 發 揮 作 用 ， 所 有 致 效 劑 的 受 體 都 會 和 quanine-nucleotide binding regulatory protein 或 G protein 產生交互作 用。這些蛋白由三個部分的單鏈聚胜肽(single polypeptide)所組成：細 胞外作為activator-binding domain 的 N-terminal domain；七個疏水性 的 transmembrane domains ； 細 胞 內 連 接 產 生 二 次 訊 息 酵 素 的 C-terminal domain。致效劑引起的初期反應通常藉由 arachidonic acid 分解後的TxA2和ADP 的釋放作用來引起的二次反應以加強血小板凝 集。
vWF receptor
vWF 由巨核細胞合成，存在血小板的α granule、血漿及內皮組織
下層中。成熟的vWF 分子量為 260 kDa，並且會組成分子量 500-10,000 的多聚體(multimers)。最大的多聚體通常存在內皮下層，也最能引發 血小板凝集(aggregation)與吸附反應(adhesion) (Meyer and Girma, 1993)。當血小板吸附到內皮下層上的 type VI collagen 時，vWF 會產 生結構上的改變以致於能夠和血小板上的GP Ib 結合。在 in vitro 的 環境中，外加ristocetin 或 botrocetin 可引起 vWF 的結構改變；在 in vivo 的環境中，高度的剪應力(shear forces)是 vWF 結構改變所必須的。
vWF 和 thrombin 在 GP Ib 上的結合位置位在α chain 的 N-terminal，
vWF 和 thrombin 在 GP Ib 上的結合位置位在α chain 的 N-terminal，