1.磁奈米對大腸桿菌 BCRC11509 的蛋白質表現沒有很大的影響，也就是磁奈米濃 度在 100μg/ml 以下時，不具有細菌毒性。
2.單獨電穿孔或與磁奈米合併使用對大腸桿菌 DH10B 的蛋白質表現沒有很大的 影響，蛋白質量的改變皆在兩倍以內。
3.本實驗支持磁奈米在低濃度下不具細菌毒性，故在未來生物醫學上可以有很大 的應用。
圖 1-3-1 實驗設計流程圖 大腸桿菌菌株培養
磁奈米的製備
加磁奈米處理
顯微鏡觀察 電穿孔
收集蛋白質及抹盤
蛋白質定量
一維及二維電泳
膠體染色與掃描
PDQuest 軟體比對 質譜分析
ExPasy 蛋白質資料庫
圖 3-3-1 磁奈米濃度效應之統計分析圖(BCRC11509)
上圖為濃度為 10-5 倍，而下圖為 10-6倍，橫坐標為磁奈米的濃度，縱座標為菌 落數量，經由三次實驗統計分析之後發現，磁奈米濃度在 0μg/ml、25μg/ml、
50μg/ml、100μg/ml 時，對 BCRC11509 大腸桿菌皆沒有顯著的的毒性。
圖 3-4-1 磁奈米濃度效應與電穿孔效應之統計分析圖 (DH10B)
由於濃度為 10-5和 10-6倍的實驗結果較為一致，故本實驗以此兩個稀釋後的濃度 作為計算菌落數量的實驗條件，用來分析大腸桿菌 DH10B 在不同磁奈米菌液濃度 及電穿孔的作用下是否具有毒性，也可比較磁奈米的濃度效應與電穿孔之間是否 有特冸的交互作用。經由五次實驗統計分析之後發現，磁奈米濃度以及電穿孔的 四種條件(濃度 0μg/ml、沒有電穿孔々濃度 0μg/ml、有電穿孔々濃度 100μg/ml、
沒有電穿孔々濃度 100μg/ml、有電穿孔)對 DH10B 大腸桿菌的菌落數量皆沒有 顯著差異。
圖 3-6-1 磁奈米對 BCRC11509 蛋白質表現的一維蛋白質電泳分析
此一維電泳圖是取一種濃度的磁奈米 BCRC11509 菌液分泌性蛋白質稀釋成五種 濃度，可發現同一種濃度的帶狀結構均相同，但是由於有五種稀釋濃度，所以有 五種不同顏色深淺的帶狀結構，顏色越深代表濃度越大，其中每一種稀釋濃度均 重複裝填兩次，越右邊的蛋白質樣品濃度越淡。
圖 3-6-2 磁奈米對 DH10B 蛋白質表現的一維蛋白質電泳分析
此實驗結果是 DH10B 四種條件的分泌性蛋白質(由左而右分冸為濃度 0μg/ml、
沒有電穿孔々濃度 0μg/ml、有電穿孔々濃度 100μg/ml、沒有電穿孔々濃度 100 μg/ml、有電穿孔)之一維電泳圖。
圖 3-7-1 PDQuest 軟體分析磁奈米對 BCRC11509 的影響
此四張圖片是由 PDQuest 軟體分冸對於磁奈米菌液的四種濃度對 BCRC11509 分泌 性蛋白質的影響作分析比對，本研究在此電泳圖中以人工方式選取四種磁奈米菌 液濃度電泳圖的同一範圍中的 8 個點做比較，看看蛋白質的濃度上發生了什麼樣 的變化。此 8 個蛋白質點由左而右分冸為 1、2、c、d、a、b、3、4。
1 2 c d
a b 3 4
1 2
c d
a b 3 4
1 2 c d a b 3 4
0 100 121 71 66 69 107 156 154 25 126 141 75 89 60 71 115 189 50 151 152 78 101 74 110 160 202 100 122 157 114 126 89 109 170 209
圖 3-7-2 PDQuest 軟體分析磁奈米對 BCRC11509 的影響
最上方的四張圖片是由 PDQuest 軟體分冸對於二維電泳膠片的某一特定範圍內 的 8 個蛋白質點進行分析比對，分冸放大成中間四個圖片，左上圖為磁奈米菌液 濃度 0μg/ml、左下圖為濃度 25μg/ml、右上圖為濃度 50μg/ml、右下圖為濃 度 100μg/ml。此 8 個蛋白質點的濃度變化如表所示，可發現最大值和最小值的 比值皆不超過 2 倍。
1 2 3 4 1 2
c d
a b 3 4
1 2
c d
a b 3 4 1 2
c d
a b 3 4
c d a b
μg/ml、右上圖為濃度 50μg/ml、右下圖為濃度 100μg/ml。此 8 個蛋白質點的 濃度變化如表所示，可發現最大值和最小值的比值大多不超過 2 倍。
9 10 11 12
0 60 94 131 135
0E 67 109 162 191
100 56 70 124 135
100E 42 63 120 112
圖 3-7-4 PDQuest 軟體分析四種測詴條件對 DH10B 的影響
上方的四張圖片是由 PDQuest 軟體分冸對於二維電泳膠片的某一特定範圍內的 4 個蛋白質點進行分析比對，左上圖為濃度 0μg/ml、無電穿孔、左下圖為濃度 0 μg/ml、有電穿孔、右上圖為濃度 100μg/ml、無電穿孔、右下圖為濃度濃度 100 μg/ml、有電穿孔。此 4 個蛋白質點由左而右分冸為 9、10、11、12。此 4 個蛋 白質點的濃度變化如表所示，可發現最大值和最小值的比值不超過 2 倍。
9 10 9 10
11 12 11 12
9 10 11 12
圖 3-8-1 大腸桿菌的二維電泳標準圖譜
在本研究中所選取的 20 個大腸桿菌的蛋白質點，藉由 PDQuest 軟體和網頁上 (http://www.expasy.org/swiss-2dpage/viewer?map=ECOLI&ac=all)的二維電泳標準 圖譜進行比對後，可初步確認所有蛋白質的身分。
參考文獻
Au, C., Mutkus, L., Dobson, A., Riffle, J., Lalli, J., & Aschner, M. (2007).
Effects of nanoparticles on the adhesion and cell viability on astrocytes. Biological Trace Element Research, 120(1-3), 248-256.
Barrett, J., Brophy, P. M., & Hamilton, J. V. (2005). Analysing proteomic data. International Journal for Parasitology, 35(5), 543-553.
Bradshaw, R. A., & Burlingame, A. L. (2005). From proteins to proteomics.
IUBMB Life, 57(4-5), 267-272.
Cowell, J. K., & Hawthorn, L. (2007). The application of microarray technology to the analysis of the cancer genome. Current Molecular Medicine, 7(1), 103-120.
Das, G. K., Chan, P. P., Teo, A., Loo, J. S., Anderson, J. M., & Tan, T.
T. (2010). In vitro cytotoxicity evaluation of biomedical nanoparticles and their extracts. Journal of Biomedical Materials Research.Part A, 93(1), 337-346.
Elrick, M. M., Walgren, J. L., Mitchell, M. D., & Thompson, D. C. (2006).
Proteomics: Recent applications and new technologies. Basic &
Clinical Pharmacology & Toxicology, 98(5), 432-441.
Ensenauer, R., Hartl, D., Vockley, J., Roscher, A., & Fuchs, U. (2010).
Efficient and gentle siRNA delivery by magnetofection. Biotechnic &
Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission,
Ettema, T. J., de Vos, W. M., & van der Oost, J. (2005). Discovering novel biology by in silico archaeology. Nature Reviews.Microbiology, 3(11),
859-869.
Fan, X., Fett, W. F., & Mitchell, B. W. (2007). Effect of negative air ions on escherichia coli ATCC 25922 inoculated onto mung bean seed and apple fruit. Journal of Food Protection, 70(1), 204-208.
Fass, R. J., & Barnishan, J. (1979). Minimal inhibitory concentrations of 34 antimicrobial agents for control strains escherichia coli ATCC 25922 and pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 16(5), 622-624.
Fuchs, P. C., Barry, A. L., & Brown, S. D. (1997). Is escherichia coli ATCC 25922 useful for monitoring broth microdilution tests of fluoroquinolones? The Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 39(4),
549-550.
Gatenby, R. A., & Frieden, B. R. (2007). Information theory in living systems, methods, applications, and challenges. Bulletin of
Mathematical Biology, 69(2), 635-657.
Heidecker, B., & Hare, J. M. (2007). The use of transcriptomic biomarkers for personalized medicine. Heart Failure Reviews, 12(1), 1-11.
Hoorn, E. J., Hoffert, J. D., & Knepper, M. A. (2005). Combined proteomics and pathways analysis of collecting duct reveals a protein regulatory network activated in vasopressin escape. Journal of the American Society of Nephrology : JASN, 16(10), 2852-2863.
Jain, N., Wang, Y., Jones, S. K., Hawkett, B. S., & Warr, G. G. (2010).
Optimized steric stabilization of aqueous ferrofluids and magnetic nanoparticles. Langmuir : The ACS Journal of Surfaces and Colloids, 26(6), 4465-4472.
Jaluria, P., Konstantopoulos, K., Betenbaugh, M., & Shiloach, J. (2007).
A perspective on microarrays: Current applications, pitfalls, and potential uses. Microbial Cell Factories, 6, 4.
Koseki, S., & Yamamoto, K. (2006). Recovery of escherichia coli ATCC 25922 in phosphate buffered saline after treatment with high hydrostatic pressure. International Journal of Food Microbiology, 110(1),
108-111.
Lee, T. L., Alba, D., Baxendale, V., Rennert, O. M., & Chan, W. Y. (2006).
Application of transcriptional and biological network analyses in mouse germ-cell transcriptomes. Genomics, 88(1), 18-33.
Nagele, E., Vollmer, M., Horth, P., & Vad, C. (2004). 2D-LC/MS techniques for the identification of proteins in highly complex mixtures. Expert Review of Proteomics, 1(1), 37-46.
O'Hara, B. F., Ding, J., Bernat, R. L., & Franken, P. (2007). Genomic and proteomic approaches towards an understanding of sleep. CNS &
Neurological Disorders Drug Targets, 6(1), 71-81.
Sahoo, Y., Goodarzi, A., Swihart, M. T., Ohulchanskyy, T. Y., Kaur, N., Furlani, E. P., et al. (2005). Aqueous ferrofluid of magnetite nanoparticles: Fluorescence labeling and magnetophoretic control.
The Journal of Physical Chemistry.B, 109(9), 3879-3885.
Schwegmann, H., Feitz, A. J., & Frimmel, F. H. (2010). Influence of the zeta potential on the sorption and toxicity of iron oxide nanoparticles on S. cerevisiae and E. coli. Journal of Colloid and Interface Science, 347(1), 43-48.
Sequeira, A., & Turecki, G. (2006). Genome wide gene expression studies in mood disorders. Omics : A Journal of Integrative Biology, 10(4),
444-454.
Stephens, A. N., Quach, P., & Harry, E. J. (2005). A streamlined approach to high-throughput proteomics. Expert Review of Proteomics, 2(2),
173-185.
Timo Lebold, Christophe Jung, Jens Michaelis, & Christoph Bra¨uchle.
(2009). Nanostructured silica materials as drug-delivery systems for doxorubicin:Single molecule and cellular studies. Nano Letter, 9(8),
2877-2883.
Yan, S. F., King, F. J., He, Y., Caldwell, J. S., & Zhou, Y. (2006).
Learning from the data: Mining of large high-throughput screening databases. Journal of Chemical Information and Modeling, 46(6),
2381-2395.
Zhang, Y., Wang, Z. Q., Liu, B., Zhang, X. J., Jiang, F., & Xiang, J. H.
(2007). The study of optimal conditions of electroporation in escherichia coli DH10B strain. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao = Chinese Journal of Biotechnology, 23(2), 347-351.
劉吉平、郝向陽(2003)。奈米科學與技術。台灣台北〆世茂出版社。
吳惠君(2005)。冺用蛋白質體學分析膽道疾病病人之膽汁。台南〆國立成功大學 醫事技術學系碩士班碩士論文。
姜忠義，成國祥(2004)。奈米生物科技。台灣台北〆 五南圖書出版股份有限公
司。
孔守中(2003)。鎳鋅鐵氧磁體奈米粒子生成動力學及其電磁波吸收行為之研究。
桃園〆中原大學化學所碩士論文。
川合 知二(2003)。奈米技術入門。台灣台北〆 全華科技圖書股份有限公司。
張安華等(2005)。實用奈米技術。台灣台北〆 新文京開發出版股份有限公司。
李國棟(2005)。無所不在的磁-粒子磁矩與固體磁性。台灣台北〆 世潮出版有 限公司。
李玉寶主編(2006)。奈米生醫材料。台灣台北〆 五南圖書出版股份有限公司。
李茂佑(2005)。蛋白質體學之大腸直腸癌差異性蛋白質表現分析。高雄〆國立中 山大學生物醫學科學研究所碩士論文。
楊雅涵(2007)。製備磁性奈米粒子作為藥物載體。台南〆國立成功大學生物科技 所碩士論文。
江峰村(2002)。生物資訊在胜肽研究之應用。台中〆朝陽科技大學應用化學所碩 士論文。
沈春榮(2008)。以蛋白質體學方法分析腸炎弧菌對抗菌胜肽之抗性機制。宜蘭〆 國立宜蘭大學生物技術研究所碩士論文。
溫明鏡(2003)。氧化鐵磁性奈米粒子之合成與特性研究。嘉義〆國立中正大學物 理研究所碩士論文。
王序揚(2005)。應用在生醫上含鐵磁性奈米粒之研製。嘉義〆國立中正大學物理
研究所碩士論文。
王沛懿(2007)。運用生物資訊分析工具及蛋白質體學技術來建立一個整合性藥物 篩選開發平台。台東〆國立台東大學生命科學研究所碩士論文。
羅吉宗等(2003)。奈米科技導論。台灣台北〆 全華科技圖書股份有限公司。
邱月霞(2004)。磁性氧化鐵奈米粒子之表面修飾及其在純化分離 DNA 之應用。台 南〆南台科技大學化學工程所碩士論文。
鄭豐裕(2006)。四氧化三鐵磁性奈米粒子之製備及其在生物醫學上的應用。台 南〆國立成功大學化學研究所博士論文。
馬遠榮(2002)。奈米科技。台灣台北〆商周出版。
黃明遠(2001)。胞膜電穿孔基因轉殖晶片之研究。台南〆國立成功大學工程科學 研究所碩士論文。
黃治維(2006)。應用超順磁奈米顆粒高密度種植骨髓間質幹細胞於氧化澱粉—幾 丁聚醣支架。嘉義〆國立中正大學化學工程研究所碩士論文。
龔建華(2002)。你不可不知的奈米科技〆影響世界、改變未來。台灣台北〆世茂 出版社。
附錄一 磁奈米之生物反應路徑分析
Type Name Description Notes
Protein TNF
tumor necrosis factor (TNF superfamily, member 2)
acts as a cytokine; binds TNF receptors;
plays a role in regulation of cell proliferation, induction of apoptosis, and inflammatory response [RGD]
Protein ERBB2
v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2, neuro/glioblastoma derived oncogene homolog (avian)
may play a role in cell proliferation and differentiation [RGD]
Functiona
l Class surfactant
Protein CCL2 chemokine (C-C motif) ligand 12 (predicted)
This gene is one of several cytokine genes clustered on the q-arm of chromosome 17. Cytokines are a family of secreted proteins involved in immunoregulatory and inflammatory processes. The protein encoded by this gene is structurally related to the CXC subfamily of cytokines. Members of this subfamily are characterized by two cysteines separated by a single amino acid. This cytokine displays chemotactic activity for monocytes and basophils but not for neutrophils or eosinophils. It has been implicated in the pathogenesis of diseases characterized by monocytic infiltrates, like psoriasis, rheumatoid arthritis and atherosclerosis. It binds to chemokine receptors CCR2 and CCR4.
Protein TAC1 tachykinin 1
encodes neuropeptides substance P, neurokinin A, neuropeptide K, and neuropeptide gamma [RGD]
Protein MYH1
myosin, heavy
polypeptide 1, skeletal muscle, adult
Myosin is a major contractile protein which converts chemical energy into mechanical energy through the hydrolysis of ATP. Myosin is a hexameric protein composed of a pair of myosin heavy chains (MYH) and two pairs of nonidentical light chains. Myosin heavy chains are encoded by a multigene family. In mammals at least 10 different myosin heavy chain (MYH) isoforms have been described from striated, smooth, and nonmuscle cells. These isoforms show expression that is spatially and temporally regulated during development.
Functiona
l Class PKA
Complex Luteinizing hormone
Protein ADAM10
a disintegrin and metalloprotease domain 10
may act as a disintegrin-metalloprotease related to the reprolysin family [RGD]
Protein GNRH1 gonadotropin-releasing hormone 1
involved in induction of ovulation; may inhibit anterior pituitary cell apoptosis [RGD]
Protein ALB albumin
may play a role in nitric oxide signaling;
may mediate formation of S-nitrosothiols [RGD]
Complex ferritin
Protein FRTS Fanconi renotubular syndrome
Protein GPI glucose phosphate
isomerase
This gene belongs to the GPI family whose members encode multifunctional phosphoglucose isomerase proteins involved in energy pathways. The protein encoded by this gene is a dimeric enzyme that catalyzes the reversible isomerization of glucose-6-phosphate
and fructose-6-phosphate. The protein functions in different capacities inside and outside the cell. In the cytoplasm, the gene product is involved in glycolysis and gluconeogenesis, while outside the cell it functions as a neurotrophic factor for spinal and sensory neurons. Defects in this gene are the cause of nonspherocytic hemolytic anemia and a severe enzyme deficiency can be associated with hydrops fetalis, immediate neonatal death and neurological impairment.
Functiona suppression of tumorigenicity 1
may be a tumor suppressor; found downregulated in transformed cells [RGD]
Molecule cAMP
Protein MT1J metallothionein 1J (pseudogene)
Cell
Process relaxation Cell
Process apoptosis
Disease inflammatio n
Cell Process
phagocytos is
Cell
Process motility Disease cancer Cell
Process endocytosis Cell
Process
electron transfer
Protein TNMD tenomodulin
transmembrane protein; may be an angiogenesis inhibitor; may play a regulatory role in eye and skeletal muscle development [RGD]
Disease tachyphylax is
Disease adenocarci noma
Disease prostate cancer
Disease hyperthermi a
Disease Brain tumor Small
Molecule oxygen Protein PDB2 Small
Molecule iron Small
Molecule fenoterol Small
Molecule Fe(ii) Small
Molecule KT5720 Small
Molecule MPMs Small
Molecule Herceptin Small
Molecule catechol Small sio2
Molecule Small
Molecule gallium Small
Molecule
epichlorohy drin Small
Molecule oxides Small
Molecule magnetite Small
Molecule acetonate Small
Molecule gallium ions
附錄二 質譜分析結果
下頁起將附上原始質譜資料。
9 10 11 12 9 10 11 12
9 10 11 12 9 10 11 12
此圖為 PDQuest 軟體分冸對於二維電泳膠片的 某一特定範圍內 4 個蛋白質點進行分析比對，
並且也挖取標號 1～4 的點進行質譜分析磁奈米 與電穿孔對 DH10B 菌的影響。