實驗數據以平均值正負標準差 (mean ± SD)表示，實驗所得之資料由 Student’s t-test 或 one-way analysis of variance (ANOVE, Tukey’s
multiple-comparison)作為統計檢定方法。
24
結果
一、 高溫緊迫對萊氏擬烏賊秏氧速率的影響
耗氧速率實驗主要為了確定萊氏擬烏賊面對高溫緊迫，哪一個發育時 期會受到影響，與其基礎表徵(Table 2)與基礎代謝作用的表現。實驗 以長期的 32 ± 1℃高溫處理下，分別在發育時期 24、29 的受精卵與 剛孵化的個體中，取 5 個同一發育時期的受精卵或個體作為一組，各 取三組進行測量與分析；並以 28 ± 1℃正常溫度下，相同發育時期的 個體作為對照。結果發現在高溫緊迫的環境下，胚胎發育早期
(stage-24)與晚期(stage-29 or hatching)均受到影響；在高溫緊迫下，發 育早期胚胎的耗氧速率相對於控制組上升約 95%，隨著胚胎發育時期 的上升，實驗組與控制組的耗氧速率都有明顯上升，並且控制組在發 育時期 stage-29 時，其耗氧速率已經有比實驗組高的趨勢；實驗組對 比於控制組在發育晚期(hatching)胚胎則有下降約 40%(Fig. 1A)。而測 定水樣中氨鹽基含量的結果顯示在高溫緊迫下，發育早期胚胎
(stage-24)排放至水中的銨離子有上升趨勢；而發育晚期胚胎(stage-29 or hatching)的銨離子排放量在高溫緊迫組與控制組間無顯著差異(Fig.
1B)。
25
二、 高溫緊迫對萊氏擬烏賊活性氧/氮(ROS/RNS)的影響
本研究探討在高溫緊迫下，萊氏擬烏賊胚胎的細胞中 ROS/RNS 是否 出現過量累積。本實驗將萊氏擬烏賊 stage-25 的受精卵放置於 32 ± 1
℃高溫環境中，並分別於 4 小時與 28 小時後立即進行解剖採樣，作 為短期處理組(acute)與長期處理組(chronic)，研磨成蛋白質萃取液後 進行細胞中 ROS/RNS 濃度測量與分析。短期高溫處理對萊氏擬烏賊 胚胎沒有顯著影響。而長期高溫處理下，雖然實驗結果統計上沒有明 顯差異，但萊氏擬烏賊胚胎細胞內 ROS/RNS 不但沒有出現過度累積，
反而有下降約 14% (Fig. 2)。
三、 高溫緊迫對萊氏擬烏賊抗氧化因子(SOD、CAT、HRP)的影響 本研究進一步探討在高溫緊迫下，萊氏擬烏賊的抗氧化機制如何表現。
本實驗將萊氏擬烏賊 stage-25 的受精卵放置於 32 ± 1℃高溫環境中，
分別於 4 小時與 28 小時後立即進行採樣，作為短期處理組(acute)與 長期處理組(chronic)，採集後製成 cDNA 進行抗氧化因子的基因表現 量測量與分析。實驗結果顯示在短期高溫處理下，實驗組細胞內 SOD 的基因表現量相對於控制組已有明顯上升約 46%，以協助進行初始活 性氧 O2-˙的轉換(Fig. 3A)；而在長期處理下，實驗組細胞內的 SOD、
CAT 與 HRP 的基因表現量相對於控制組各明顯上升約 41%、53%、
26
與 96% (Fig. 3A-C)。
四、 高溫緊迫對萊氏擬烏賊抗逆境基因(HSP70、HSP90)的影響
本研究進一步探討在高溫緊迫下，萊氏擬烏賊的抗逆境因子如何表現，
本實驗將萊氏擬烏賊 stage-25 的受精卵放置於 32 ± 1℃高溫環境中，
分別於 4 小時與 28 小時後立即進行採樣，作為短期處理組(acute)與 長期處理組(chronic)，採集後製成 cDNA 進行抗逆境因子的基因表現 量測量與分析。實驗結果顯示 HSP70 與 HSP90 的基因表現量在短期 (4h)高溫處理組相對於控制組顯著各上升約 34%與 135%；而長期(28h) 高溫處理組，相對於控制組顯著各上升約 189%與 49% (Fig. 4A,B)。
五、 高溫緊迫對萊氏擬烏賊卵鞘液中銨離子含量的差異
本研究進一步探討在高溫緊迫下，藉由測量卵鞘內 PVF 含有的銨離 子濃度，了解萊氏擬烏賊的氨基酸代謝與高溫緊迫間的關係。受精卵 長期放置於 32 ± 1℃高溫環境中，採集發育時期 24、26 與 29 的受精 卵，並利用針筒抽取卵鞘內 PVF 密封保存在 4℃，進行銨離子濃度測 量與分析，而採樣胚胎各基礎表徵測量標示於 Fig. 5B。並以各採樣 時期在 28 ± 1℃的處理溫度做為控制組。實驗結果顯示，在高溫緊迫 下，胚胎發育早期(stage-24)與晚期(stage-29)排放至 PVF 中的銨離子 相對於控制組各別上升約 49%與 19%；可是，結果顯示隨著胚胎發
27
育時期的成熟，PVF 中銨離子濃度會逐漸下降(Fig. 5A)。
六、 高溫緊迫對萊氏擬烏賊電子傳遞鏈中細胞色素 c 氧化酶Ⅰ(COX
Ⅰ)的影響
本研究進一步探討在高溫緊迫下，藉由測量電子傳遞鏈中四個複合物 之一的 COXⅠ的基因表現量，探討萊氏擬烏賊面對高溫緊迫時有氧 代謝會如何表現，本實驗將萊氏擬烏賊 stage-25 的受精卵放置於 32 ± 1℃高溫環境中，分別於 4 小時與 28 小時後立即進行採樣，作為短期 處理組(acute)與長期處理組(chronic)，採集後製成 cDNA 進行抗逆境 因子的基因表現量測量與分析。在短期高溫處理下，COXⅠ的基因表 現量相對於控制組有明顯下降約 59%；然而在長期處理下，COXⅠ 的基因表現量相對於控制組卻有明顯上升約 96% (Fig. 6)。
七、 高溫緊迫對萊氏擬烏賊調控細胞平衡的 NKA 蛋白表現量的影響 本研究進一步探討在高溫緊迫下，萊氏擬烏賊細胞中 NKA 的蛋白表 現量是否與維持細胞內體液與生理平衡機制有關。本實驗將萊氏擬烏 賊 stage-25 的受精卵放置於 32 ± 1℃高溫環境中，分別於 4 小時與 28 小時後立即進行採樣，作為短期處理組(acute)與長期處理組(chronic)，
採集後研磨成蛋白質萃取液，進行 NKA 蛋白表現量的測量與分析。
在短期高溫處理下，NKA 的蛋白表現量相對於控制組有顯著下降約
28
33%；在長期處理下，NKA 的蛋白表現量相對於控制組會顯著上升 約 236% (Fig. 7)。
八、 高溫緊迫對萊氏擬烏賊細胞中容易受 ROS 影響的 HIF-1蛋白 表現量的影響
本研究進一步探討在高溫緊迫下，萊氏擬烏賊細胞中容易受 ROS 影 響的 HIF-1蛋白表現量，藉此了解細胞中 ROS 是否出現過量累積，
因而導致 HIF-1蛋白表現量出現改變。本實驗將萊氏擬烏賊 stage-25 的受精卵放置於 32 ± 1℃高溫環境中，分別於 4 小時與 28 小時後立 即進行採樣，作為短期處理組(acute)與長期處理組(chronic)，採集後 研磨成蛋白質萃取液，進行 HIF-1蛋白表現量的測量與分析。在短 期高溫處理下，HIF-1的蛋白表現量相對於控制組顯著上升約 60%；
然而在長期處理下，HIF-1的蛋白表現量相對於控制組卻僅有上升而 無顯著差異的現象 (Fig. 8)。
29
討論
一、 實驗用萊氏擬烏賊胚胎發育時期挑選
根據胚胎各發育時期耗氧實驗結果顯示：萊氏擬烏賊胚胎發育早期或 晚期在面對高溫緊迫的環境下，其耗氧速率與胚胎排放銨離子程度均 受到影響；同時耗氧速率伴隨著胚胎發育有所上升，因胚胎發育或面 對高溫壓力會增加體內的代謝率導致氧消耗量的提高，所以生物耗氧 速率能夠反映細胞進行有氧代謝的效能(Hoeger et al., 1987; Pimentel et al., 2012)，本實驗結果與前人研究的歐洲烏賊 Loligo vulgaris 和歐 洲虎斑烏賊 Sepia officinalis 研究結果也相互吻合(Pimentel et al., 2012)。
而防止因脫氨作用而細胞銨累積造成毒害，銨必需排出細胞或體外，
因此測量密封實驗槽中水樣銨離子濃度能夠反映細胞進行氨基酸代 謝的效能(Randall and Tsui, 2002; Smith, 1929)。面對高溫緊迫環境下，
實驗組的發育早期胚胎(stage-24)與控制組相比，其耗氧速率與水樣中 銨濃度均有上升趨勢(Fig. 1A,B)，Q5值為 1.95，可見高溫緊迫對早期 胚胎具有提升其基礎代謝率的重大影響，因此導致整體代謝效能的提 高。然而，實驗組的發育晚期胚胎(hatching)與控制組相比，其耗氧速 率與水樣中銨濃度卻有下降趨勢(Fig. 1A,B)，Q5值為 0.72，由此結果 推測：因為胚胎發育早期便轉移到高溫緊迫環境下持續飼養，而面臨 這種長期的外界高溫壓力，可能導致胚胎發育晚期之生理與代謝狀況
30
異常，影響實驗結果(Rosa et al., 2012)。因此，本一系列的代謝指標 檢測實驗結果提供我們選取最合適以進行後續實驗，而不會因發育問 題與影響結果的胚胎時期，故本實驗選取 stage-25 或 stage-26 的早期 胚胎，其重要的胚胎外表徵為眼睛呈現橘色或深橘色，套膜完全包覆 鰓，墨囊可見於腹面(Cole and Hall, 2009)。
二、 高温緊迫對萊氏擬烏賊氧化壓力與抗氧化壓力相關能力探討 根據 ROS/RNS 的實驗分析結果顯示：萊氏擬烏賊體內的 ROS/RNS 含量不論是處於短期高溫緊迫壓力還是長期高溫處理適應都沒有出 現顯著的累積(Fig. 2)。因此，我們推測高溫緊迫並不會對萊氏擬烏賊 胚胎造成細胞氧化壓力。然而，根據抗氧化壓力因子的一系列實驗結 果顯示：短期高溫緊迫處理(4 小時)下，烏賊胚胎體內對活性氧 O2-˙
具有高敏感度的 SOD 基因表現相已有顯著上升(Fig. 3A)，在此同時，
容易受到 ROS 累積刺激的 HIF-1蛋白表現量也有明顯提升(Fig. 8)。
由以上結果我們推論：萊氏擬烏賊胚胎體內的活性氧可能在瞬間且短 期的高溫緊迫壓力下大量上升，在此同時細胞中抗氧化機制也能夠即 時啓動，以防止細胞中因 ROS/RNS 的過量累積而造成細胞毒害。另 外在長期高溫處理(28 小時)後，大量的 O2-˙已轉化為其他的活性氧分 子，如：H2O2與˙OH 等，導致其他抗氧化因子 CAT 與 HRP 的基因 表現相均有上升(Fig. 3B,C)，共同協助防止 ROS/RNS 累積；而細胞
31
中 ROS/RNS 累積已經獲得緩和，進而促使 HIF-1的蛋白表現量只有 上升趨勢而沒有明顯差異(Fig. 8)。另一方面，萊氏擬烏賊胚胎細胞在 面對外界高溫緊迫壓力下，不論短期或長期高溫處理胚胎均有受到損 害或發生變異的可能，因此導致細胞中抗逆境因子 HSP70 與 HSP90 的基因表現相均明顯上升 (Fig. 4A,B)，以幫助蛋白質摺疊與細胞修復。
綜合以上結果我們推論：海洋無脊椎頭足類動物在早期胚胎發育階段 已具有十分完善的細胞抗氧化機制來面對外界的高温緊迫。
三、 高温緊迫對萊氏擬烏賊氧化代謝機制相關探討
根據前人的研究報告指出：外溫動物面臨外界壓力時會提昇代謝速率 以獲取額外能量面對逆境(Houde, 1989; Pörtner and Knust, 2007)，另外，
隨著胚胎發育時期的進行，頭足類中的歐洲烏賊(L. vulgaris)和歐洲虎 斑烏賊(S. officinalis 胚胎代謝能力與需求也有所增加(Pimentel et al., 2012)。為探討頭足類胚胎在發育時期面對高溫緊迫的環境下，其體
隨著胚胎發育時期的進行，頭足類中的歐洲烏賊(L. vulgaris)和歐洲虎 斑烏賊(S. officinalis 胚胎代謝能力與需求也有所增加(Pimentel et al., 2012)。為探討頭足類胚胎在發育時期面對高溫緊迫的環境下，其體