本研究進一步探討在高溫緊迫下，萊氏擬烏賊細胞中容易受 ROS 影 響的 HIF-1蛋白表現量，藉此了解細胞中 ROS 是否出現過量累積，
因而導致 HIF-1蛋白表現量出現改變。本實驗將萊氏擬烏賊 stage-25 的受精卵放置於 32 ± 1℃高溫環境中，分別於 4 小時與 28 小時後立 即進行採樣，作為短期處理組(acute)與長期處理組(chronic)，採集後 研磨成蛋白質萃取液，進行 HIF-1蛋白表現量的測量與分析。在短 期高溫處理下，HIF-1的蛋白表現量相對於控制組顯著上升約 60%；
然而在長期處理下，HIF-1的蛋白表現量相對於控制組卻僅有上升而 無顯著差異的現象 (Fig. 8)。
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討論
一、 實驗用萊氏擬烏賊胚胎發育時期挑選
根據胚胎各發育時期耗氧實驗結果顯示：萊氏擬烏賊胚胎發育早期或 晚期在面對高溫緊迫的環境下，其耗氧速率與胚胎排放銨離子程度均 受到影響；同時耗氧速率伴隨著胚胎發育有所上升，因胚胎發育或面 對高溫壓力會增加體內的代謝率導致氧消耗量的提高，所以生物耗氧 速率能夠反映細胞進行有氧代謝的效能(Hoeger et al., 1987; Pimentel et al., 2012)，本實驗結果與前人研究的歐洲烏賊 Loligo vulgaris 和歐 洲虎斑烏賊 Sepia officinalis 研究結果也相互吻合(Pimentel et al., 2012)。
而防止因脫氨作用而細胞銨累積造成毒害，銨必需排出細胞或體外，
因此測量密封實驗槽中水樣銨離子濃度能夠反映細胞進行氨基酸代 謝的效能(Randall and Tsui, 2002; Smith, 1929)。面對高溫緊迫環境下，
實驗組的發育早期胚胎(stage-24)與控制組相比，其耗氧速率與水樣中 銨濃度均有上升趨勢(Fig. 1A,B)，Q5值為 1.95，可見高溫緊迫對早期 胚胎具有提升其基礎代謝率的重大影響，因此導致整體代謝效能的提 高。然而，實驗組的發育晚期胚胎(hatching)與控制組相比，其耗氧速 率與水樣中銨濃度卻有下降趨勢(Fig. 1A,B)，Q5值為 0.72，由此結果 推測：因為胚胎發育早期便轉移到高溫緊迫環境下持續飼養，而面臨 這種長期的外界高溫壓力，可能導致胚胎發育晚期之生理與代謝狀況
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異常，影響實驗結果(Rosa et al., 2012)。因此，本一系列的代謝指標 檢測實驗結果提供我們選取最合適以進行後續實驗，而不會因發育問 題與影響結果的胚胎時期，故本實驗選取 stage-25 或 stage-26 的早期 胚胎，其重要的胚胎外表徵為眼睛呈現橘色或深橘色，套膜完全包覆 鰓，墨囊可見於腹面(Cole and Hall, 2009)。
二、 高温緊迫對萊氏擬烏賊氧化壓力與抗氧化壓力相關能力探討 根據 ROS/RNS 的實驗分析結果顯示：萊氏擬烏賊體內的 ROS/RNS 含量不論是處於短期高溫緊迫壓力還是長期高溫處理適應都沒有出 現顯著的累積(Fig. 2)。因此，我們推測高溫緊迫並不會對萊氏擬烏賊 胚胎造成細胞氧化壓力。然而，根據抗氧化壓力因子的一系列實驗結 果顯示：短期高溫緊迫處理(4 小時)下，烏賊胚胎體內對活性氧 O2-˙
具有高敏感度的 SOD 基因表現相已有顯著上升(Fig. 3A)，在此同時，
容易受到 ROS 累積刺激的 HIF-1蛋白表現量也有明顯提升(Fig. 8)。
由以上結果我們推論：萊氏擬烏賊胚胎體內的活性氧可能在瞬間且短 期的高溫緊迫壓力下大量上升，在此同時細胞中抗氧化機制也能夠即 時啓動，以防止細胞中因 ROS/RNS 的過量累積而造成細胞毒害。另 外在長期高溫處理(28 小時)後，大量的 O2-˙已轉化為其他的活性氧分 子，如：H2O2與˙OH 等，導致其他抗氧化因子 CAT 與 HRP 的基因 表現相均有上升(Fig. 3B,C)，共同協助防止 ROS/RNS 累積；而細胞
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中 ROS/RNS 累積已經獲得緩和，進而促使 HIF-1的蛋白表現量只有 上升趨勢而沒有明顯差異(Fig. 8)。另一方面，萊氏擬烏賊胚胎細胞在 面對外界高溫緊迫壓力下，不論短期或長期高溫處理胚胎均有受到損 害或發生變異的可能，因此導致細胞中抗逆境因子 HSP70 與 HSP90 的基因表現相均明顯上升 (Fig. 4A,B)，以幫助蛋白質摺疊與細胞修復。
綜合以上結果我們推論：海洋無脊椎頭足類動物在早期胚胎發育階段 已具有十分完善的細胞抗氧化機制來面對外界的高温緊迫。
三、 高温緊迫對萊氏擬烏賊氧化代謝機制相關探討
根據前人的研究報告指出：外溫動物面臨外界壓力時會提昇代謝速率 以獲取額外能量面對逆境(Houde, 1989; Pörtner and Knust, 2007)，另外，
隨著胚胎發育時期的進行，頭足類中的歐洲烏賊(L. vulgaris)和歐洲虎 斑烏賊(S. officinalis 胚胎代謝能力與需求也有所增加(Pimentel et al., 2012)。為探討頭足類胚胎在發育時期面對高溫緊迫的環境下，其體 內氨基酸代謝的效能，我們測定經由氨基酸代謝後排放至卵鞘中 PVF 的銨離子(NH4+
)濃度(Hoeger et al., 1987)。根據實驗結果顯示：高溫緊 迫下胚胎各發育時期 PVF 中銨離子濃度都較控制組高 (Fig. 5)，顯示 胚胎面對高溫緊迫體內的代謝反應與能量需求會提升，以供調節體內 平衡與保護細胞等機制對抗外界壓力。然而，卵鞘厚度隨著胚胎發育 有逐漸減薄的現象，導致滲透度逐漸增高進而促進了 PVF 中銨離子
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與外界環境的擴散作用(Rosa et al., 2012; Schmidt-Nielsen, 1997)，因此 在實驗結果中隨著胚胎發育其 PVF 中銨離子濃度逐漸下降(Fig. 5A)，
這現象並不代表胚胎發育時，氨基酸代謝的效能不斷下降，或是面對 外界環境時其細胞採用此代謝途徑的機制下降。也有如先前討論結果，
因長期處於高溫緊迫對於無脊椎變溫動物胚胎或幼體會造成發育不 全，甚至個體死亡(Rosa et al., 2012)，故發育晚期胚胎(hatching)實驗 結果不能進行準確推論。
除此之外，我們偵測生理調控中與細胞呼吸代謝相關的
cytochrome c oxidase subunit I (COX I)基因表現相，與細胞膜電位恆定 相關的 Na+/K+-ATPase (NKA)蛋白表現量發現：短期的高溫處理兩者 都出現明顯下降現象，而長期的高溫處理下卻有顯著上升趨勢(Fig.
6,7)。我們推測短期的高溫緊迫造成 COX I 與 NKA 表現量受到抑制 是因為細胞內的 ROS/RNS 的迅速累積，誘發了 HIF-1的活化，除了 可能促使細胞進行適應性能量移轉(adaptive metabolic shift)機制，同 時抑制粒線體電子傳遞鏈的活性，降低 ROS/RNS 的繼續累積(Taylor, 2008)，因此我們測定的電子傳遞鏈上 COX I 基因表現相才會出現下 降情況 (Fig. 6)；但這種短暫抑制 ROS/RNS 產生的負回饋生理機制 也會影響其他協助面對逆境的代謝途徑，使胚胎整體能量分配出現失 衡狀態，甚至對細胞造成危害。另外，我們檢測了運用主動運輸穩定
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細胞膜電位的 NKA 蛋白，發現其表現量有明顯下降現象(Fig. 7)，我 們推測是因為細胞為了防止能量轉移分配不均的情況加劇，進而抑制 運用主動運輸耗能機制的離子通道，以降低細胞能量需求。
頭足類動物胚胎面臨短期高溫緊迫的生理應變機制能藉由
HIF-1的活化有效降低細胞的氧化壓力。然而，胚胎細胞在長期高溫 緊迫伴隨著發育成長時，個體的整體代謝率必然提升並需要更多的能 量供給，相對地會繼續造成細胞內代謝銨離子或 ROS/RNS 的累積，
細胞除了必需將這些有害的代謝產物排出，並且需要提升抗氧化因子 與抗逆境因子等保護機制以防止細胞傷害。在諸多生理機制需要穩定 的條件影響下我們發現：頭足類動物胚胎在高溫緊迫下因為細胞內 ROS/RNS 的含量能夠有效維持，因此導致 HIF-1在長期高溫緊迫下 已有下降趨勢(Fig. 8)，對電子傳遞鏈的抑制作用因此減弱，造成 COX I 基因表現相的結果顯著上升(Fig. 6)，並且促進整體代謝機制啟動以 提高能量獲取。另外，前人的研究報告指出：具有維持細胞膜電位恆 定的 NKA 與調控細胞內銨離子濃度有直接相關(Ip and Chew, 2010;
Randall et al., 1999)，因此長期高溫緊迫下所測定的 NKA 蛋白表現量 明顯上升(Fig. 7)，說明頭足類動物胚胎必須藉由活化 NKA 的蛋白表 現以協助排放在長期高溫緊迫下產生的銨離子進而維持胞內恆定。
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結論
迴游性的萊氏擬烏賊的胚胎時期由於是附著於沿岸潮間帶礁石區域，
不能通過轉移棲地避免非生物性的環境緊迫壓力，因此可能促使萊氏 擬烏賊胚胎演化出適應環境的對策以提高存活機率。根據我們的研究 結果顯示：萊氏擬烏賊在胚胎發育時期確實具有良好的細胞抗氧化壓 力機制與合適的代謝策略轉移機制協同面對外界的高溫緊迫，可是其 生理上的演化速度能否追上近年人類對自然環境的影響，我們仍然存 疑。雖然本實驗中萊氏擬烏賊胚胎內的 ROS/RNS 在細胞中濃度並不 會因高溫緊迫而明顯提升 (Fig. 2)，然而在飼養的過程中我們發現：
發育初期的萊氏擬烏賊胚胎只要曾經接受高溫處理超過 28 小時後，
即使回復到正常溫度下馴養，胚胎晚期出現胚體畸形或死亡的情況甚 高，即使成功孵化出幼體，幼體出現早產徵狀而容易死亡的現象也十 分普遍。這充分說明萊氏擬烏賊胚胎面臨高溫壓力時的生理適應性代 謝策略並無法在每個發育時期完全有效地防止細胞毒害，其體內的代 謝與生理機制間的協同調適機制還需要進一步研究。
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