胚胎自受精卵中取出後，將三隻胚胎放進同一個塑膠離心管中，加入 1 ml Trizol 試劑 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)，並利用組織研磨機 (Retsch,, Haan, Germany)將樣本均勻打碎，隨後加入 0.2 ml 三氯甲仿 (chloroform)混合均勻後置於室溫 3 分鐘，之後利用離心機在 4℃環境 下以 12,000 x g 離心 30 分鐘，取出上清液移至新的離心管並加入等 量的異丙醇 (Isopropanol)與總溶液體積十分之一的醋酸鈉 (3M, pH5 NaOAc)混合均勻後放置於-20℃。隔日以 13,000 xg 在 4℃條件下離心 30 分鐘並移除上清液，加入 1 ml 75 %酒精清洗留下的白色沉澱。再 以 13,000 xg 與 4℃條件下離心 10 分鐘，隨後移除酒精後放置於室溫 下風乾，接著加入去離子水溶解 RNA pellet 後放置於 60 ℃加熱 10 分鐘，再加入 1 μl DNaseⅠ置於 37 ℃反應 1 小時。最後置於 70℃進 行終止反應 10 分鐘，最後以 RNAse-free water 稀釋 5 倍進行定量，
並放置-20 ℃儲存以供後續實驗使用。
四、 反轉錄聚合酶連鎖反應 (Reverse transcription reaction, RT) 取5 μg total RNA 加入 1 μl Oligo(dT)18 Primer 與 1 μl 10mM dNTP Mix，
以 DEPC 水加至總體積 13 μl，以 65 ℃加熱 5 分鐘，使 RNA 變性，
並立即放置冰上冷卻 1 分鐘以上，使 RNA 與 Oligo(dT)18引子結合，
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再加入4 μl 5X First Strand BF、1 μl 0.1M DTT、1 μl RNase Out (40U/ul) 和1 μl SuperScript Ⅲ RT (200U/μl)，將所有試劑均勻混合後，以 50
℃反應 1 小時，再提高溫度至 70 ℃加熱 15 分鐘，再加入 1 μl RNase H (2U/μl)以 37 ℃反應 20 分鐘，隨後置於冰上加入 180 μl Elution buffer 稀釋 10 倍，再進行互補 DNA (complementary DNA；cDNA)定 量，分裝並儲存在-20 ℃以供後續實驗使用。
五、 即時定量反轉錄聚合酶連鎖反應 (Real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)
原液濃度稀釋至 10~20 ng 的 cDNA 做為反應模板，加入 5 μl 2 x SYBR Green Ⅰ Master Mix (Roche)、10 μM 引子，均勻混合成總體 積10 μl 的反應物。以 Light Cycler real-time PCR system (Roche, Penzberg, Germany)進行螢光反應的偵測。實驗結果採用相對於 ubiquitin-conjugated enzyme (UBC)基因表現量的方式表現。
即時定量聚合酶連鎖反應實驗所使用之引子序列標示於 Table 1.
六、 西方墨點法 (Western blotting) 6-1 蛋白質樣本製備
胚胎自受精卵中取出後，將三隻胚胎放進同一支塑膠離心管中，加入 400 μl 均質液 (Homogenization buffer, HMBF)，以及 1：400 的蛋白質
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分解酶抑制劑 (proteinase inhibitor) ，利用組織研磨機 (Retsch,, Haan, Germany)將樣本均勻打碎，再以 13,000 xg 在 4℃條件下離心三十分
鐘，抽取上清液即蛋白質萃取液。將得到的蛋白質萃取液進行分裝，
其中一部分進行蛋白質濃度含量測定，另一部分保存在-80℃以供後 續實驗使用。
將蛋白質萃取液稀釋後，取800 μl 稀釋後蛋白質萃取液並加上 200 μl Protein Assay (Bio-Rad)，利用呈色比色法以分光光度計 (spectrophotometer, NanoDrop 2000c)在波長 595 nm 的可見光下，測 量蛋白質萃取液中所含的蛋白質濃度。
6-2 鈉鉀幫浦 (Na+/K+-ATPase, NKA)蛋白檢測
取20 μg 蛋白質箤取液，加入均質液與 4 μl 6 倍濃度的 loading dye 均 勻混合成總體積 24 μl 的反應物，於 37 ℃反應 10 分鐘，將蛋白質載 入 12.5 % SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE )中，以 100 伏特進行 3 小時的電泳層析。取出 SDS-PAGE 層析後的凝膠，以 30 伏特、3 小時條件轉漬至 polyvinylidene difloride (PVDF) membrane 上。取出轉漬後的 PVDF membrane，室溫下以 1 % Western Blocking Reagent (Roche) 進行免疫阻斷處理 1 小時 30 分鐘後，以 PBST 清洗 兩次 (10 分鐘/次)，再以稀釋 1：1000 倍之 NKA 一級抗體 (H-300,
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rabbit polyclonal antibodies, Santa Cruz Biotechnology)在室溫下浸泡 2 小時，以 PBST 清洗兩次 (10 分鐘/次)，隨後以稀釋 1：1000 倍的二 級抗體 (Alkaline Phosphatase conjugated Goat anti-Rabbit IgG,
AbboMax)在室溫下浸泡 2 小時，以 PBST 清洗兩次 (10 分鐘/次)，加 人 1-StepTM NBT/BCIP (Thermo Scientific)進行呈色反應，充分呈色後 以 Methanol 退色並乾燥收藏。
6-3 缺氧誘導因子 (Hypoxia-inducible factor-1 alpha, HIF-1)蛋白
檢測
取20 μg 蛋白質箤取液，藉由上述的 SDS-PAGE 電泳層析與轉漬反應 後，以稀釋 1：1000 倍之 HIF-1一級抗體 (rabbit polyclonal antibodies, Aviva Systems Biology)在室溫下浸泡反應 2 小時，以 PBST 清洗兩次 (10 分鐘/次)，隨後以稀釋 1：1000 倍的二級抗體 (Enhanced
chemiluminescence Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab from donkey, GE Healthcre Life Sciences)在室溫下浸泡 2 小時，以 PBST 清洗兩次 (10 分鐘/次)，加入 Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare Life Sciences
)
進行呈色反應，以冷光影像分析 系統 (ImageQuant LAS 4000, GE Healthcare Life Sciences)
進行冷光反 應的偵測並拍照存檔。22
七、 活性氧/氮物質含量分析
細胞中ROS/RNS活性的測定是利用蛋白質萃取液中的ROS/RNS與 OxiSelect™ In Vitro ROS/RNS Assay Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA) 中的DCFH之間的化學反應，最後生成2,7-dichlorodihydrofluorescein (DCF)，通過偵測DCF發出的螢光強度計算ROS/RNS的相對表現量。
實驗流程如下：取備用的蛋白質萃取液利用PBS稀釋成10 μg/μl 蛋白 質溶液，取50 μl蛋白質加入不透光的96孔盤中，並加入50 μl catalyst 均勻混合放置室溫反應5分鐘 (避光)，接著加入100 μl DCFH試劑後置 於室溫避光反應1小時，再利用五合一多功能微量盤分析儀 (Spectra Max M5, Molecular Devices)以480 nm波長進行激發反應，並偵測530 nm波長放射光的螢光強度。
八、 銨離子的含量分析
PVF 中的銨離子濃度的測定是利用 orthophtaldialdehyde (OPA)與樣本 中的銨離子之間的化學反應後激發出的螢光強度作為計算基準
(Kérouel and Aminot, 1997)。藥品配方與步驟參考於 Holmes 與 Aminot 等人的著作(Holmes, Aminot et al. 1999)。樣本收集是利用針筒刺穿卵 鞘，並抽取卵鞘中的 PVF 密封儲存在 4 ℃，測量時先在 96 孔盤中加 入25 μl PVF，接著加入 100 μl working reagent 並放置在室溫中避光 反應 3 小時，再利用五合一多功能微量盤分析儀 (Spectra Max M5,
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Molecular Devices) 以 360 nm 波長進行激發反應，並偵測 420 nm 波 長的反應放射光的螢光強度。
九、 統計分析
實驗數據以平均值正負標準差 (mean ± SD)表示，實驗所得之資料由 Student’s t-test 或 one-way analysis of variance (ANOVE, Tukey’s
multiple-comparison)作為統計檢定方法。
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結果
一、 高溫緊迫對萊氏擬烏賊秏氧速率的影響
耗氧速率實驗主要為了確定萊氏擬烏賊面對高溫緊迫，哪一個發育時 期會受到影響，與其基礎表徵(Table 2)與基礎代謝作用的表現。實驗 以長期的 32 ± 1℃高溫處理下，分別在發育時期 24、29 的受精卵與 剛孵化的個體中，取 5 個同一發育時期的受精卵或個體作為一組，各 取三組進行測量與分析；並以 28 ± 1℃正常溫度下，相同發育時期的 個體作為對照。結果發現在高溫緊迫的環境下，胚胎發育早期
(stage-24)與晚期(stage-29 or hatching)均受到影響；在高溫緊迫下，發 育早期胚胎的耗氧速率相對於控制組上升約 95%，隨著胚胎發育時期 的上升，實驗組與控制組的耗氧速率都有明顯上升，並且控制組在發 育時期 stage-29 時，其耗氧速率已經有比實驗組高的趨勢；實驗組對 比於控制組在發育晚期(hatching)胚胎則有下降約 40%(Fig. 1A)。而測 定水樣中氨鹽基含量的結果顯示在高溫緊迫下，發育早期胚胎
(stage-24)排放至水中的銨離子有上升趨勢；而發育晚期胚胎(stage-29 or hatching)的銨離子排放量在高溫緊迫組與控制組間無顯著差異(Fig.
1B)。
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二、 高溫緊迫對萊氏擬烏賊活性氧/氮(ROS/RNS)的影響
本研究探討在高溫緊迫下，萊氏擬烏賊胚胎的細胞中 ROS/RNS 是否 出現過量累積。本實驗將萊氏擬烏賊 stage-25 的受精卵放置於 32 ± 1
℃高溫環境中，並分別於 4 小時與 28 小時後立即進行解剖採樣，作 為短期處理組(acute)與長期處理組(chronic)，研磨成蛋白質萃取液後 進行細胞中 ROS/RNS 濃度測量與分析。短期高溫處理對萊氏擬烏賊 胚胎沒有顯著影響。而長期高溫處理下，雖然實驗結果統計上沒有明 顯差異，但萊氏擬烏賊胚胎細胞內 ROS/RNS 不但沒有出現過度累積，
反而有下降約 14% (Fig. 2)。
三、 高溫緊迫對萊氏擬烏賊抗氧化因子(SOD、CAT、HRP)的影響 本研究進一步探討在高溫緊迫下，萊氏擬烏賊的抗氧化機制如何表現。
本實驗將萊氏擬烏賊 stage-25 的受精卵放置於 32 ± 1℃高溫環境中，
分別於 4 小時與 28 小時後立即進行採樣，作為短期處理組(acute)與 長期處理組(chronic)，採集後製成 cDNA 進行抗氧化因子的基因表現 量測量與分析。實驗結果顯示在短期高溫處理下，實驗組細胞內 SOD 的基因表現量相對於控制組已有明顯上升約 46%，以協助進行初始活 性氧 O2-˙的轉換(Fig. 3A)；而在長期處理下，實驗組細胞內的 SOD、
CAT 與 HRP 的基因表現量相對於控制組各明顯上升約 41%、53%、
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與 96% (Fig. 3A-C)。
四、 高溫緊迫對萊氏擬烏賊抗逆境基因(HSP70、HSP90)的影響
本研究進一步探討在高溫緊迫下，萊氏擬烏賊的抗逆境因子如何表現，
本實驗將萊氏擬烏賊 stage-25 的受精卵放置於 32 ± 1℃高溫環境中，
分別於 4 小時與 28 小時後立即進行採樣，作為短期處理組(acute)與 長期處理組(chronic)，採集後製成 cDNA 進行抗逆境因子的基因表現 量測量與分析。實驗結果顯示 HSP70 與 HSP90 的基因表現量在短期 (4h)高溫處理組相對於控制組顯著各上升約 34%與 135%；而長期(28h) 高溫處理組，相對於控制組顯著各上升約 189%與 49% (Fig. 4A,B)。
五、 高溫緊迫對萊氏擬烏賊卵鞘液中銨離子含量的差異
本研究進一步探討在高溫緊迫下，藉由測量卵鞘內 PVF 含有的銨離 子濃度，了解萊氏擬烏賊的氨基酸代謝與高溫緊迫間的關係。受精卵 長期放置於 32 ± 1℃高溫環境中，採集發育時期 24、26 與 29 的受精 卵，並利用針筒抽取卵鞘內 PVF 密封保存在 4℃，進行銨離子濃度測 量與分析，而採樣胚胎各基礎表徵測量標示於 Fig. 5B。並以各採樣 時期在 28 ± 1℃的處理溫度做為控制組。實驗結果顯示，在高溫緊迫 下，胚胎發育早期(stage-24)與晚期(stage-29)排放至 PVF 中的銨離子 相對於控制組各別上升約 49%與 19%；可是，結果顯示隨著胚胎發
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育時期的成熟，PVF 中銨離子濃度會逐漸下降(Fig. 5A)。
六、 高溫緊迫對萊氏擬烏賊電子傳遞鏈中細胞色素 c 氧化酶Ⅰ(COX
Ⅰ)的影響
本研究進一步探討在高溫緊迫下，藉由測量電子傳遞鏈中四個複合物 之一的 COXⅠ的基因表現量，探討萊氏擬烏賊面對高溫緊迫時有氧 代謝會如何表現，本實驗將萊氏擬烏賊 stage-25 的受精卵放置於 32 ± 1℃高溫環境中，分別於 4 小時與 28 小時後立即進行採樣，作為短期 處理組(acute)與長期處理組(chronic)，採集後製成 cDNA 進行抗逆境 因子的基因表現量測量與分析。在短期高溫處理下，COXⅠ的基因表 現量相對於控制組有明顯下降約 59%；然而在長期處理下，COXⅠ 的基因表現量相對於控制組卻有明顯上升約 96% (Fig. 6)。
七、 高溫緊迫對萊氏擬烏賊調控細胞平衡的 NKA 蛋白表現量的影響 本研究進一步探討在高溫緊迫下，萊氏擬烏賊細胞中 NKA 的蛋白表 現量是否與維持細胞內體液與生理平衡機制有關。本實驗將萊氏擬烏 賊 stage-25 的受精卵放置於 32 ± 1℃高溫環境中，分別於 4 小時與 28 小時後立即進行採樣，作為短期處理組(acute)與長期處理組(chronic)，
採集後研磨成蛋白質萃取液，進行 NKA 蛋白表現量的測量與分析。
採集後研磨成蛋白質萃取液，進行 NKA 蛋白表現量的測量與分析。