萊氏擬烏賊胚胎在高溫緊迫下的氧化代謝研究

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 萊氏擬烏賊胚胎在高溫緊迫下的氧化代謝研究 Study of oxidative metabolism in Sepioteuthis lessoniana embryos under hyperthermic environment. 研究生：關寶龍 Pou-Long Kuan 指導教授：曾庸哲博士 Yung-Che Tseng, Ph. D. 中. 華民國. 103 年 6 月.

(2) 致謝首先誠摯的感謝我的指導教授曾庸哲博士，不管我做錯多少次的實驗還是打破各式各樣的實驗器材，都給予耐心與包容，而在我實驗失敗的時候也會給予鼓勵與方向的指導，使我能盡情研究與熱束自己的實驗。此外，也要感謝中研院細生所的黃鵬鵬老師，提供我良好的實驗器材與協助，使我能完成這篇論文的實驗成果。同時也要感謝海洋大學的張清風老師與國立臺灣師範大學的林豊益老師在口試時的指導與建議，使此篇論文能夠更加的完整與嚴謹。感謝實驗室這個大家庭，對於我這個來自不同國家的人也沒有歧視或不平等的對待，而且還在這結識到碩士生涯中重要的伙伴們，沒有他們的幫忙便不會出現本篇論文。真心感謝杰龍學長對我這個天兵學生的教導，讓我了解實驗操作的基本功與注意事項，也在我需要技術支援時給予有力的解決辦法與指導；感謝永安學長、家豪學長，大顧學長、咸台學長、冠霖同學在實驗上的協助，還有帛軒學弟、玉奇學妹與珮甄學妹對我實驗的支持與研究室公共事務的辛苦奉獻，讓我能夠安心的完成實驗；感謝若冬學姐與書彥學姐在口試前給予大量的建議與論文呈現上的指導；同時感謝在實驗中犠牲的動物們，有你們的支持才能完成這篇論文。在 B205 中渡過的這兩年是我人生中永不忘記的時光，當中有喜有悲，這些辛苦與歡笑都是我重要的回憶，也許老去的某一天我還會提起在魚房中濕身與淹水之類的趣事，但這也是我重要的成就之一。最後感謝我偉大的家人們，謝謝他們給予我無形的支持與金錢上的援助，讓我能安穩的完成這兩年的工作與學習，支持著我的前路，也感謝我身邊所有的朋友給予鼓勵與建議，讓我有滿滿的活力去完成論文的編織。.

(3) 摘要環境溫度變異會促使變溫動物改變代謝機制，細胞內將因此產生過量的活性氧/氮化物(ROS/RNS)累積造成細胞毒害。本研究運用萊氏擬烏賊(Sepioteuthis lessoniana)胚胎探討高溫環境下頭足類動物的細胞代謝策略。根據胚胎耗氧與排氨實驗發現：頭足類胚胎在發育初期的整體代謝容易受到高溫環境影響而提升，故本實驗選擇早期胚胎(stage 25)進行高溫緊迫研究。在高溫緊迫下，細胞中 ROS/RNS 濃度沒有顯著變異，而抗氧化因子(CAT, SOD, HRP)，抗逆境基因(HSP70, HSP90) 與細胞色素 c 氧化酶(Cox I)的基因表現相均有上升趨勢。進一步發現低氧誘導因子(HIF-1)與鈉鉀幫浦(NKA)蛋白質表現量與高溫誘導的適應性能量轉移(adaptive metabolic shift)機制有關。因此我們推論：高溫緊迫下的萊氏擬烏賊胚胎可以藉由增加並調整呼吸代謝與氨基酸代謝的機制獲得能量，而細胞內亦會啟動有效的抗氧化機制抵禦 ROS 與 RNS 的累積。. 關鍵字：高溫緊迫、萊氏擬烏賊、氧化代謝. i.

(4) Abstract Under temperature perturbations, metabolic strategies of ectothermic vertebrates would be modified and further increase the cellular reactive oxygen/nitrogen species (ROS/RNS) formations. Previous studies indicated that excess ROS/RNS accumulation would cause cytotoxicity. However in cephalopods, the cellular and physiological mechanisms behind metabolic adaptation under temperature perturbations is still an open question. In this study, we use squid (S. lessoniana) embryos as a cephalopod model to investigate the antioxidant mechanisms and further metabolic modifications under hyperthermic environment. According to oxygen consumption rate and ammonium excretion rate studies in squid embryos, 25-stage squid embryos were sensitive to ambient hyperthermic stress and further selected for following experiments. Under hyperthermic conditions, intracellular ROS/RNS contents were not obviously changed. Transcripts expressions of cytochrome c oxidase I (Cox I), anti-oxidation molecules (CAT, SOD, HRP) and stress-resistant genes (HSP70, HSP90) were up-regulated under hyperthermic stress. Moreover protein expressions. of. hypoxia-inducible. factor. 1-alpha. (HIF-1). and. Na+-K+-ATPase (NKA) are close related to cellular adaptive metabolic shift in hypothermic conditions. In conclusion, intact metabolic rate increment in squid embryos under hyperthermic stress would further induce adaptive metabolism shift for proper physiological functions and avoiding ROS/RNS accumulation.. keywords：hyperthermic environment、Sepioteuthis lessoniana、oxidative metabolism. ii.

(5) 目錄中文摘要--------------------------------------------------ⅰ 英文摘要--------------------------------------------------ⅱ 目錄-------------------------------------------------------1 前言-------------------------------------------------------5 一、人類活動與全球暖化的進程------------------------------5 二、水生生物在高溫緊迫(hyperthermic stress)下的生理反應-------6 三、變溫動物的生理與能量運用策略--------------------------8 1. 活性氧/氮與氧化壓力--------------------------------10 2. 環境壓力相關因子-----------------------------------11 3. 調節細胞平衡與代謝相關因子-------------------------13 四、頭足類動物-萊氏擬烏賊--------------------------------13 五、實驗目的---------------------------------------------14 材料與方法------------------------------------------------16 一、實驗動物飼養-----------------------------------------16 1. 實驗動物飼養---------------------------------------16 2. 實驗動物的高溫處理---------------------------------16 二、耗氧速率偵測-----------------------------------------17 三、Total RNA 萃取----------------------------------------18 1.

(6) 四、反轉錄聚合酶反應(Reverse transcription reaction, RT)---------18 五、即時定量反轉錄聚合酶連鎖反應 (Real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)------------------------------------19 六、西方墨點法(Western blotting)-------------------------------------------19 1. 蛋白質樣本製備--------------------------------------------------------19 2. 鈉鉀幫浦 (Na+/K+-ATPase, NKA)----------------------------------20 3. 缺氧誘導因子 (Hypoxia-inducible factor-1 alpha, HIF-1)---21 七、活性氧/氮物質含量分析-------------------------------------------------22 八、銨離子含量分析----------------------------------------------------------22 九、統計分析-------------------------------------------------------------------23 結果-------------------------------------------------------------------------------24 一、高溫緊迫下對萊氏擬烏賊秏氧速率與排放銨離子至水中的影響 -------------------------------------------------------------------------------24 二、高溫緊迫對萊氏擬烏賊活性氧/氮(ROS/RNS)的影響------------25 三、高溫緊迫對萊氏擬烏賊抗氧化基因(SOD、CAT、HRP)的影響 -------------------------------------------------------------------------------25 四、高溫緊迫對萊氏擬烏賊抗逆境基因 (HSP70 、 HSP90) 的影響 -------------------------------------------------------------------------------26 五、高溫緊迫對萊氏擬烏賊電子傳遞鏈中細胞色素 c 氧化酶Ⅰ的影響----------------------------------------------------------------------------26 2.

(7) 六、高溫緊迫對萊氏擬烏賊卵鞘液中銨離子含量的差異------------27 七、高溫緊迫對萊氏擬烏賊調控細胞平衡的 NKA 蛋白表現量的影響 --------------------------------------------------------------------------------28 八、高溫緊迫對萊氏擬烏賊細胞中容易受 ROS 影響的 HIF-1蛋白表現量的影響----------------------------------------------------------------28 討論-------------------------------------------------------------------------------29 一、寶驗用萊氏擬烏賊胚胎發育時間挑選-----------------------------29 二、高温緊迫對萊氏擬烏賊氧化壓力與抗氧化壓力相關能力探討 ------------------------------------------------------------------------------30 三、高温緊迫對萊氏擬烏賊氧化代謝機制相關探討------------------31 結論--------------------------------------------------------------------------------34 參考文獻--------------------------------------------------------------------------35 附表--------------------------------------------------------------------------------40 表一、即時定量聚合酶連鎖反應實驗所使用之引子序列--------------40 表二、耗氧速率實驗中樣本的基礎表徵測量------------------------------41 附圖--------------------------------------------------------------------------------42 圖一、高溫緊迫下對萊氏擬烏賊秏氧速率與排放銨離子至水中的影響 --------------------------------------------------------------------------------------42 圖二、高溫緊迫對萊氏擬烏賊活性氧/氮(ROS/RNS)的影響------------43 圖三、高溫緊迫對萊氏擬烏賊抗氧化基因(SOD、CAT、HRP)的影響 3.

(8) --------------------------------------------------------------------------------------44 圖四、高溫緊迫對萊氏擬烏賊抗逆境基因(HSP70、HSP90)的影響 --------------------------------------------------------------------------------------45 圖五、高溫緊迫對萊氏擬烏賊卵鞘液中銨離子含量的差異----------46 圖六、高溫緊迫對萊氏擬烏賊電子傳遞鏈中細胞色素 c 氧化酶Ⅰ的影響--------------------------------------------------------------------------47 圖七、高溫緊迫對萊氏擬烏賊調控細胞平衡的 NKA 蛋白表現量的影響--------------------------------------------------------------------------48 圖八、高溫緊迫對萊氏擬烏賊細胞中容易受 ROS 影響的 HIF-1蛋白表現量的影響-----------------------------------------------------------49. 4.

(9) 前言一、人類活動與全球暖化的進程自古以來，地球的氣候系統即使在沒有人類活動的干預下仍會不斷的發生改變，因此形成一個持續變動卻維持動態恆定的系統；其中影響氣候系統改變的因子包括火山活動、太陽輻射與海洋洋流運動等大規模自然因素(Rahmstorf, 2003; Shindell et al., 2001)。然而，18 世紀中期發生的工業革命不但改變了世界經濟前進的方向，還深遠地影響著地球氣候系統長久以來的平衡；以機器取代人力為社會帶來快速增長，但相對應能源的需求也隨之提升。其中石化燃料是目前人類獲取能源的主要來源，同時也是造成全球暖化的元凶之一，因為石化燃料在燃燒的過程中會產生大量的溫室氣體，造成顯著的地球溫室效應；而近百年地球人口密度的急速上升促使清理林木製作居住用地、社會發展與畜牧等人為活動更使溫室氣體進一步地快速提升，根據聯合國政府間氣候變遷小組(Intergovernmental panel on climate change, IPCC)指出：近十年來全球二氧化碳濃度上升了將近 30% (Solomon, 2007)。溫室氣體所造成的溫室效應能有效防止地面溫度散失至外太空中，而使得地球能夠維持在恆定的溫度(Wood, 1909)。但因為人類活動製造出過量的二氧化碳、氧化亞氮、甲烷等溫室氣體導致地球大氣. 5.

(10) 層下整體保留的熱能上升，造成全球暖化的形成(Kelly and Wigley, 1992)。而全球暖化會進一步影響水循環中大氣降雨與各水域的蒸發程度等，使暖化情況更加嚴重(Klige, 1990; Zektser and Loaiciga, 1993)。根據 IPCC 在 2007 年出版的第 4 次氣候變遷評估報告中提出：在上一個世紀(1906-2005 年)全球平均溫度上升了約 0.6 度，且在後期的 25 年間溫度上升速度最為嚴重，並進一步推測未來 100 年後全球表層海水溫度將平均上升 3 度或以上(Meehl GA, 2007)；因此，與環境互相關聯的生態結構與生物個體也會受到嚴重影響(Harley et al., 2006)，對於棲息於海洋環境的的生物而言將是一個嚴峻的生存挑戰。. 二、水生生物在高溫緊迫(hyperthermic stress)下的生理反應全球暖化導致的海平面上升、海洋酸化與海平面溫度上升等環境變異 (Caldeira and Wickett, 2003; Church and White, 2006; Meehl GA, 2007; Zhang et al., 2004)，以生物多樣性豐富的沿海潮間帶區域最容易受到影響，因潮汐漲退與局部地區日照長短不一，導致棲地環境容易出現相對較大的溫度或鹽度等環境差異(Harley et al., 2006)；以臺灣海峽區域為例：本實驗室的檢測發現夏季澎湖沿海地區因太陽輻射加熱作用會使沿岸海平面溫度由上午八點平均 26℃上升至正午約平均 32℃。 6.

(11) 然而，大部分的海洋生物屬於變溫動物，當水體溫度發生變異時，其體內溫度也會隨著外界環境的牽動影響，進而導致體內的酵素或蛋白質等分子變化，因此可能會造成細胞壓力而損傷(Harley et al., 2006)；因此，生理機制必需作出改變才能有效面對環境的變異(Abele and Puntarulo, 2004; Eaton and Scheller, 1996)，若無法適應環境變異只能走向死亡，例如：全球暖化已知顯著地影響著珊瑚與共生細菌的棲息環境，雖然部分物種演化出適應機制以面對環境變異，可是已導致大量珊瑚出現白化現象(Hughes et al., 2003; McWilliams et al., 2005; Weis, 2008)。棲息在沿海地區的生物面臨瞬息萬變的生活環境，在經過長時間的演化進程已發展出不同的適應機制去調控與存活，例如：潮間帶或沿海地區的螃蟹會利用不同的方法調節體液滲透壓與離子組成以面對潮汐漲退導致環境鹽度變動(Pequeux, 1995)。而不同品系的瓷蟹 (porcelain crabs, Genus Petrolisthes)，被發現可能因為分佈在高、低不同的潮間帶區域，長時間的棲地溫度落差導致瓷蟹品系間的心跳頻率會有所差異(Stillman, 2002)。另外，海洋無脊椎動物除了已知會運用氨基酸代謝機制進行代謝反應，也會運用有氧代謝的大量提升來獲取足夠能量以作為面對環境緊迫的緊急生理對策(Frederich and Pörtner, 2000; Pörtner and Knust, 2007)。然而，沿岸生物能存活的溫度耐受極 7.

(12) 限值通常與其棲息地温度變異範圍十分接近(Stillman, 2002; Tomanek and Somero, 1999)，而上述經歷長時間演化發展的生理調適機制通常只能用作短暫且緊急的適應性調控(Stillman and Somero, 2000)，在全球暖化現象因人為作用影響下，造成惡化速度將遠快過於生物演化的速度，雖然沿海生物或許具備良好的生理應對策略，但如果遇上長期或反覆的高溫緊迫，可能仍然會對其正常的生理功能帶來負面影響 (Pörtner, 2012)。. 三、變溫動物的生理與能量運用策略對於變溫動物而言，周遭環境溫度的變異會促使個體內的體溫隨之改變 (Tseng et al., 2011)。對於某些運動能力較強的的水生動物而言，例如鰹魚和鮪魚，其體溫甚至會比水溫微高，其高體溫可能是因為遊動時肌肉的代謝作用所產生的熱能有關(Kieffer et al., 1998)。另外，諸多報告發現當魚類在適應或遭遇嚴苛的環境溫度變化過程中，會以乳酸取代葡萄糖作為腦部能量的來源(Bittar et al., 1996; Dienel, 2012; Purdon and Rapoport, 1998; Tseng and Hwang, 2008)。因此，水生變溫動物體內對於能量供給極為敏感的高耗能器官，諸如：腦部、肌肉、腸道、與腎臟，在面臨溫度適應過程中是否能夠有效的調節能量運用策略，對於個體的存活極為必要，並且一直是生物學研究上熱門的議 8.

(13) 題。而溫度會影響代謝率，在變溫動物容忍的溫差範圍內，溫度愈高，體內的代謝率和活動頻率會提高氧的消耗量，因此耗氧量可用以表示生物體內整體的代謝活動。在溫度每提高 10°C 的狀況下，體內相對應之耗氧量會因此改變，稱為 Q10 (Guppy and Withers, 1999; Kieffer et al., 1998)。對於大部份的變溫生物而言，Q10 的範圍值多界於 2 至 3；換句話說，氧的消耗量會隨著每提高 10°C 的溫度而增為 2 或 3 倍。在較高的溫度下，耗氧量的增加，相對地需要更多的能量熱量來維持同樣的生長需求。倘若溫度趨近致死溫度的上限時，Q10 通常會減少。這是由於極端溫度造成細胞能量代謝失衡，導致粒線體內 ROS (Reactive oxygen species)或 RNS (Reactive /nitrogen species)增加，進而對動物的生理活動所產生的抑制作用(Abele and Puntarulo, 2004; Portner et al., 2000)。例如籐壺觸手的活動會隨著溫度的提高而增加。但在接近致死溫度上限時，觸手的活動會受到抑制。另外，生存於潮間帶上層的生物種類通常較生存於潮間帶下層的生物種類對於溫度變異的容忍範圍更大。. 3-1 活性氧/氮與氧化壓力粒線體為了供應三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）至細胞中 9.

(14) 以協助各項生理的正常運行，必需持續進行氧化磷酸化作用；藉由電子在粒線體內膜上進行一系列氧化還原反應後會通過 ATP 合成酶生成 ATP。然而，在此反應過程中也會生成具有未成對自由電子組成的活性氧/活性氮物質(Reactive oxygen/nitrogen species, ROS/RNS)，如：氧離子(Superoxide anion radical, O2-˙)、過氧化物(Hydrogen peroxide, H2O2)、氫氧自由基(Hydroxyl radical, •OH)、nitric oxide (•NO)、與 peroxynitrite (ONOO−)等(Finkel, 1998; Fleury et al., 2002; Nicholls and Ferguson, 2013)。一般狀況下，ROS/RNS 在細胞中具有信息傳遞和保持細胞平衡的功能，如：Escherichia coli 受到氧化壓力時，O2-˙能活化 Escherichia coli 中 SoxR 轉錄因子，而活化的 SoxR 能刺激 SoxS 基因轉錄成蛋白質進一步活化其他基因表現，其中包括抗活性氧化物的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等(Demple and Amábile-Cuevas, 1991; Greenberg et al., 1990; Thannickal and Fanburg, 2000)。另外無脊椎動物海膽受精作用被觸發時會在細胞外生成 H2O2，並利用 H2O2 或過氧化物酶(Peroxidase)與細胞外蛋白產生交聯作用，在剛受精的卵母細胞外形成具有保護性的外殼(Shapiro, 1991; Thannickal and Fanburg, 2000)。此外，生物體內活性氧與抗氧化機制互相抑制和保持著平衡關係(Fleury et al., 2002)，並在細胞中維持一定的比率，但面對環境壓力影響下，可能會導致代謝對策和其他生理機. 10.

(15) 制之間的連動轉換，造成細胞內 ROS/RNS 的不正常增加累積，導致細胞氧化壓力(oxidative stress)的形成(Abele et al., 1998)。具有未成對自由電子的 ROS/RNS 自身處於不穩定狀態，會主動造成細胞內的蛋白質、DNA 與 RNA 的斷裂以及造成細胞凋亡或氧化(Mittler, 2002)，因此過量累積的 ROS/RNS 會造成細胞毒害。. 3-2 環境壓力相關因子當細胞感受到環境壓力，導致細胞中 ROS/RNS 出現不正常增加累積與造成氧化壓力過程，會誘導細胞中各保護機制啓動，以防止細胞受到損害。其中各種抗氧化酶能與細胞中的 ROS/RNS 作用，防止 ROS/RNS 過量累積，如：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD) 能把細胞中的 O2-˙轉化成 H2O2，再利用過氧化氫酶(catalase, CAT)或過氧化物酶(Peroxidase)把 H2O2 轉化成 H2O 分子傳送至細胞外(Abele and Puntarulo, 2004; Thannickal and Fanburg, 2000)，防止正常細胞因氧化壓力而壞死。因此，抗氧化酶的表現量是細胞中氧化壓力的重要指標之一。另外，細胞內容易受到環境緊迫因子誘發的熱休克蛋白(heat shock proteins, HSP)，主要能幫助轉譯過程中的蛋白質進行正確的摺疊或水解不穩定的蛋白質等功能，以進行著保護細胞的功能(Hartl, 11.

(16) 1996; Rutherford and Lindquist, 1998)。而其中的 HSP70 與 HSP90 在細胞面對外界壓力時都被證實具有重要的生理功能。HSPs 依照其分子量的大小(kilodaltons, kDa)命名，而異構型的分類則以其功能與 DNA 序列等機制作為基準(Lindquist and Craig, 1988)。全球表層海水溫度上升，導致水中含氧量下降，進一步造成細胞出現缺氧情況，其中細胞內的缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factors, HIF)會因為細胞缺氧而大量表現，促進生物體內血流量上升、血管增生與營養提供等，藉此提昇細胞存活的機會(Benarroch, 2009; Chavez et al., 2008)。另外，研究指出 HIFs 不僅細胞缺氧才會表現，當細胞面對外界環境緊迫時同樣具有功用；除了能夠短暫抑制電子傳遞鏈與克氏循環，減少 ROS 的產生，同時能夠提昇糖解作用以獲取更多能量面對外界壓力(Benarroch, 2009; Chavez et al., 2008; Taylor, 2008)。另外，當環境溫度變異時，分布在各種細胞膜上，運用耗能的主動運輸機制保持細胞膜電位平衡、協助次級主動傳輸和調整細胞體積等功能的鈉鉀幫浦(Na+/K+-ATPase, NKA)也會受到影響(Sardella et al., 2004)， NKA 的表現已被證實會因環境變異的刺激而改變(Blanco and Mercer, 1998; Jorgensen et al., 2003)。. 12.

(17) 3-3 調節細胞平衡與代謝相關因子根據前人與本實驗室之前的研究成果指出頭足類主要是利用氨基酸代謝獲取能量(Hoeger et al., 1987; Lee, 1995; Villanueva et al., 2004)。細胞在進行麩醯胺酸(Glutamine)與麩胺酸(Glutamate)之間的代謝轉換時，會因脫氨作用產生銨(ammonium)，銨的過量累積會做成細胞毒害(Randall and Tsui, 2002)，所以一般會通過氨的膜通道蛋白或尿液等方式排出細胞或體外(Smith, 1929)。另外，頭足類動物也會進行有氧代謝機制以供應細胞能量(Storey and Storey, 1978, 1983)，其中電子傳遞鏈是有氧代謝中重要的環節，藉由粒線體內膜上的四個複合蛋白通過一連串的氧化還原反應產生大量能量(Liu et al., 2002)。當生物面對環境緊迫壓力時，正常的能量供應反應可能會受到影響，此時會引發生理上的適應性代謝策略轉換(adaptive metabolism shift)，藉由不同的代謝途徑獲取更多的能量，協助細胞面臨逆境時獲取充足的能量以保持個體的正常運作。. 四、頭足類動物-萊氏擬烏賊萊氏擬烏賊(Sepioteuthis lessoniana)，屬於軟體動物門(Mollcus)，頭足綱(Cephalopoda)，槍形目(Teuthida)，槍烏賊科(Loliginidae)，俗名香匙、魷魚及軟絲仔等。主要分布在太平洋與印度洋海域，且台灣沿海 13.

(18) 地區是其主要的繁殖區域之一，一般在夏季 5 月至 9 月期間是萊氏擬烏賊主要的繁殖期；繁殖時，雌性會把受精卵附著在水深 5~10 的沿海礁石或養殖業者箱網上形成一群卵團，每一個胚胎都具有獨立卵鞘保護且卵鞘中充滿了卵鞘液(perivitelline fluid, PVF)，個體代謝後廢物會排放到 PVF 中再經過擴散機制穿透卵鞘排到外界。. 五、實驗目的大洋中的水溫受到洋流、季風的調節多半相當穩定。然而，潮間帶地區的水溫變化則是非常劇烈，在每日不同時間、不同季節的變化程度也不同。因此，潮間帶水溫的變異常超過生物溫度容忍的範圍，而潮間帶生物在極熱和極冷的環境中，也有行為、構造、生理上的特殊適應機制(Abele et al., 2009)。另外，大氣中溫室氣體濃度增加已明顯地導致表層海水溫度有異常升降，除了對於陸地氣候相造成前所未有的影響，對於大洋生態圈的平衡也逐漸產生結構性變化。頭足類在海洋生態系中扮演著重要的角色(Rosa et al., 2008)，但近年因氣候變遷與不明環境影響，導致台灣沿海地區頭足類捕獲量大幅下降(施教民, 2013)，已有歐洲科學家指出因為全球暖化促速海平面溫度的上升，導致歐洲烏賊 Loligo vulgaris 胚胎在發育時期因外界環境威脅，而導致發育不全或致死等不良的狀態(Rosa et al., 2012)。 14.

(19) 而台灣沿海水域、海灣、瀉湖、珊瑚礁區的夏季海平面溫度提升，常常接近變溫動物的致死高溫，所以發展穩定的熱平衡生理機制應是在此生活的萊氏擬烏賊胚胎存活關鍵，而維持生理恆定的背後必定需要有效的細胞能量調控策略。因此在台灣沿海繁殖的萊氏擬烏賊胚胎，是否與之前歐洲烏賊的研究結果一致，會因海洋高溫對其幼體胚胎造成傷害，導致此族群捕獲量下降？抑或是早已發展出良好的生理機制與代謝策略以面對高溫逆境？. 本論文計畫進行下列問題的探討： (1) 藉由檢測細胞中 ROS/RNS 的濃度，判斷細胞內 ROS/RNS 是否因為海水暖化出現過量累積造成細胞毒害？ (2) 檢測細胞中的抗氧化因子與抗逆境因子的基因表現量，並通過 HIF-1的蛋白表現量，探討在高溫緊迫下的萊氏擬烏賊早期胚胎的生理反應機制。 (3) 測定高溫緊迫下卵鞘液中銨離子濃度與電子傳遞鏈中的細胞色素 c 的表現，進一步通過檢測細胞中 NKA 的蛋白表現量，探討萊氏擬烏賊胚胎的代謝對策會如何轉換以應對外界的高溫緊迫。. 15.

(20) 材料與方法一、實驗動物飼養 1-1 實驗動物飼養萊氏擬烏賊 (Sepioteuthis lessoniana)胚胎採集於澎湖菜園海洋牧場，海平面下水深約 5~10 米附著在箱網上的卵團，採集完成後以一般海水馴養於 25 ± 1℃恆溫飼養箱中，光週期設定為每日 12 小時光照/12 小時黑暗，保持恆速滴流持續置換飼養箱中的海水，使其保持在鹽度 32 ± 1 ppm 自然海水中，並持續對海水打氣以維持水中含氧量高於 90%。 1-2 實驗動物的高溫處理持續飼養受精卵至實驗用的發育時期，即胚胎眼睛呈現橘色或深橘色 (stage-25 or stage-26)(Cole and Hall, 2009)，發育時間合適之樣本會轉移至另一個飼養箱中，並且利用加熱棒讓飼養箱水溫在 4 小時內從 25 ± 1℃逐漸升溫至 32 ± 1℃高溫狀態。飼養在高溫狀態的受精卵作為實驗處理組，維持在正常水温的受精卵作為實驗控制組，並持續打氣以保持水中含氧量，當水溫穩定後開始進行計時。經過 4 小時後，分別對處理組(4h acute group)與控制組(control group)進行解剖取樣，並作為實驗的短期處理組；再經過 24 小時後，進行第二次取樣作為 16.

(21) 實驗的長期處理組(28 h chronic group)。取樣時，利用針筒把受精卵中的卵鞘液抽出密封儲存進行後續實驗；並打開受精卵取出胚胎進行各項體長體重等基礎表徵測量。. 二、耗氧速率偵測實驗組或控制組的胚胎發育至適當時期後，在轉移前先將受精卵的表層卵鞘清理乾淨，並轉移至環境條件相同的無菌天然海水中適應一段時間，接著取其中 5 個受精卵和無菌天然海水一起密閉在實驗槽中，實驗槽內壁上貼有氧含量螢光偵測傳感器 (PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Germany)，與傳感器同一位置的實驗槽外壁具有數位光纖偵測探針，透過光纖把偵測所得的數位光波信號傳送至 OXY-4 mini (OXY-4 mini, PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg, Germany)，數位數據以電腦軟件 OXY-4v2_30FB 轉換為類比訊號進行整理與顯示，而顯示的數據為即時偵測密封實驗槽中海水的含氧量(%)，直至實驗槽中含氧量介於 65%~60%之間便停止偵測，並從實驗槽中取出受精卵進行解剖和體長體重等基礎表徵測量，分別採集實驗槽中測量前後的水樣進行銨離子含量分析。耗氧速率以下述計算式計算： Respiration rate= [(treatment-background)*Oxygen Solubility in Sea Water]*(volume -PVF)\ total embryo mass 17.

(22) 三、 Total RNA 萃取胚胎自受精卵中取出後，將三隻胚胎放進同一個塑膠離心管中，加入 1 ml Trizol 試劑 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)，並利用組織研磨機 (Retsch,, Haan, Germany)將樣本均勻打碎，隨後加入 0.2 ml 三氯甲仿 (chloroform)混合均勻後置於室溫 3 分鐘，之後利用離心機在 4℃環境下以 12,000 x g 離心 30 分鐘，取出上清液移至新的離心管並加入等量的異丙醇 (Isopropanol)與總溶液體積十分之一的醋酸鈉 (3M, pH5 NaOAc)混合均勻後放置於-20℃。隔日以 13,000 xg 在 4℃條件下離心 30 分鐘並移除上清液，加入 1 ml 75 %酒精清洗留下的白色沉澱。再以 13,000 xg 與 4℃條件下離心 10 分鐘，隨後移除酒精後放置於室溫下風乾，接著加入去離子水溶解 RNA pellet 後放置於 60 ℃加熱 10 分鐘，再加入 1 μl DNaseⅠ置於 37 ℃反應 1 小時。最後置於 70℃進行終止反應 10 分鐘，最後以 RNAse-free water 稀釋 5 倍進行定量，並放置-20 ℃儲存以供後續實驗使用。. 四、反轉錄聚合酶連鎖反應 (Reverse transcription reaction, RT) 取 5 μg total RNA 加入 1 μl Oligo(dT)18 Primer 與 1 μl 10mM dNTP Mix，以 DEPC 水加至總體積 13 μl，以 65 ℃加熱 5 分鐘，使 RNA 變性，並立即放置冰上冷卻 1 分鐘以上，使 RNA 與 Oligo(dT)18 引子結合， 18.

(23) 再加入 4 μl 5X First Strand BF、1 μl 0.1M DTT、1 μl RNase Out (40U/ul) 和 1 μl SuperScript Ⅲ RT (200U/μl)，將所有試劑均勻混合後，以 50 ℃反應 1 小時，再提高溫度至 70 ℃加熱 15 分鐘，再加入 1 μl RNase H (2U/μl)以 37 ℃反應 20 分鐘，隨後置於冰上加入 180 μl Elution buffer 稀釋 10 倍，再進行互補 DNA (complementary DNA；cDNA)定量，分裝並儲存在-20 ℃以供後續實驗使用。. 五、即時定量反轉錄聚合酶連鎖反應 (Real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR) 原液濃度稀釋至 10~20 ng 的 cDNA 做為反應模板，加入 5 μl 2 x SYBR Green Ⅰ Master Mix (Roche)、10 μM 引子，均勻混合成總體積 10 μl 的反應物。以 Light Cycler real-time PCR system (Roche, Penzberg, Germany)進行螢光反應的偵測。實驗結果採用相對於 ubiquitin-conjugated enzyme (UBC)基因表現量的方式表現。即時定量聚合酶連鎖反應實驗所使用之引子序列標示於 Table 1.. 六、西方墨點法 (Western blotting) 6-1 蛋白質樣本製備胚胎自受精卵中取出後，將三隻胚胎放進同一支塑膠離心管中，加入 400 μl 均質液 (Homogenization buffer, HMBF)，以及 1：400 的蛋白質 19.

(24) 分解酶抑制劑 (proteinase inhibitor) ，利用組織研磨機 (Retsch,, Haan, Germany)將樣本均勻打碎，再以 13,000 xg 在 4℃條件下離心三十分鐘，抽取上清液即蛋白質萃取液。將得到的蛋白質萃取液進行分裝，其中一部分進行蛋白質濃度含量測定，另一部分保存在-80℃以供後續實驗使用。將蛋白質萃取液稀釋後，取 800 μl 稀釋後蛋白質萃取液並加上 200 μl Protein Assay (Bio-Rad)，利用呈色比色法以分光光度計 (spectrophotometer, NanoDrop 2000c)在波長 595 nm 的可見光下，測量蛋白質萃取液中所含的蛋白質濃度。. 6-2 鈉鉀幫浦 (Na+/K+-ATPase, NKA)蛋白檢測取 20 μg 蛋白質箤取液，加入均質液與 4 μl 6 倍濃度的 loading dye 均勻混合成總體積 24 μl 的反應物，於 37 ℃反應 10 分鐘，將蛋白質載入 12.5 % SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE )中，以 100 伏特進行 3 小時的電泳層析。取出 SDS-PAGE 層析後的凝膠，以 30 伏特、3 小時條件轉漬至 polyvinylidene difloride (PVDF) membrane 上。取出轉漬後的 PVDF membrane，室溫下以 1 % Western Blocking Reagent (Roche) 進行免疫阻斷處理 1 小時 30 分鐘後，以 PBST 清洗兩次 (10 分鐘/次)，再以稀釋 1：1000 倍之 NKA 一級抗體 (H-300,. 20.

(25) rabbit polyclonal antibodies, Santa Cruz Biotechnology)在室溫下浸泡 2 小時，以 PBST 清洗兩次 (10 分鐘/次)，隨後以稀釋 1：1000 倍的二級抗體 (Alkaline Phosphatase conjugated Goat anti-Rabbit IgG, AbboMax)在室溫下浸泡 2 小時，以 PBST 清洗兩次 (10 分鐘/次)，加人 1-StepTM NBT/BCIP (Thermo Scientific)進行呈色反應，充分呈色後以 Methanol 退色並乾燥收藏。. 6-3 缺氧誘導因子 (Hypoxia-inducible factor-1 alpha, HIF-1)蛋白檢測取 20 μg 蛋白質箤取液，藉由上述的 SDS-PAGE 電泳層析與轉漬反應後，以稀釋 1：1000 倍之 HIF-1一級抗體 (rabbit polyclonal antibodies, Aviva Systems Biology)在室溫下浸泡反應 2 小時，以 PBST 清洗兩次 (10 分鐘/次)，隨後以稀釋 1：1000 倍的二級抗體 (Enhanced chemiluminescence Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab from donkey, GE Healthcre Life Sciences)在室溫下浸泡 2 小時，以 PBST 清洗兩次 (10 分鐘/次)，加入 Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare Life Sciences)進行呈色反應，以冷光影像分析系統 (ImageQuant LAS 4000, GE Healthcare Life Sciences)進行冷光反應的偵測並拍照存檔。. 21.

(26) 七、活性氧/氮物質含量分析細胞中ROS/RNS活性的測定是利用蛋白質萃取液中的ROS/RNS與 OxiSelect™ In Vitro ROS/RNS Assay Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA) 中的DCFH之間的化學反應，最後生成2,7-dichlorodihydrofluorescein (DCF)，通過偵測DCF發出的螢光強度計算ROS/RNS的相對表現量。實驗流程如下：取備用的蛋白質萃取液利用PBS稀釋成10 μg/μl 蛋白質溶液，取50 μl蛋白質加入不透光的96孔盤中，並加入50 μl catalyst 均勻混合放置室溫反應5分鐘 (避光)，接著加入100 μl DCFH試劑後置於室溫避光反應1小時，再利用五合一多功能微量盤分析儀 (Spectra Max M5, Molecular Devices)以480 nm波長進行激發反應，並偵測530 nm波長放射光的螢光強度。. 八、銨離子的含量分析 PVF 中的銨離子濃度的測定是利用 orthophtaldialdehyde (OPA)與樣本中的銨離子之間的化學反應後激發出的螢光強度作為計算基準 (Kérouel and Aminot, 1997)。藥品配方與步驟參考於 Holmes 與 Aminot 等人的著作(Holmes, Aminot et al. 1999)。樣本收集是利用針筒刺穿卵鞘，並抽取卵鞘中的 PVF 密封儲存在 4 ℃，測量時先在 96 孔盤中加入 25 μl PVF，接著加入 100 μl working reagent 並放置在室溫中避光反應 3 小時，再利用五合一多功能微量盤分析儀 (Spectra Max M5, 22.

(27) Molecular Devices) 以 360 nm 波長進行激發反應，並偵測 420 nm 波長的反應放射光的螢光強度。. 九、統計分析實驗數據以平均值正負標準差 (mean ± SD)表示，實驗所得之資料由 Student’s t-test 或 one-way analysis of variance (ANOVE, Tukey’s multiple-comparison)作為統計檢定方法。. 23.

(28) 結果一、高溫緊迫對萊氏擬烏賊秏氧速率的影響耗氧速率實驗主要為了確定萊氏擬烏賊面對高溫緊迫，哪一個發育時期會受到影響，與其基礎表徵(Table 2)與基礎代謝作用的表現。實驗以長期的 32 ± 1℃高溫處理下，分別在發育時期 24、29 的受精卵與剛孵化的個體中，取 5 個同一發育時期的受精卵或個體作為一組，各取三組進行測量與分析；並以 28 ± 1℃正常溫度下，相同發育時期的個體作為對照。結果發現在高溫緊迫的環境下，胚胎發育早期 (stage-24)與晚期(stage-29 or hatching)均受到影響；在高溫緊迫下，發育早期胚胎的耗氧速率相對於控制組上升約 95%，隨著胚胎發育時期的上升，實驗組與控制組的耗氧速率都有明顯上升，並且控制組在發育時期 stage-29 時，其耗氧速率已經有比實驗組高的趨勢；實驗組對比於控制組在發育晚期(hatching)胚胎則有下降約 40%(Fig. 1A)。而測定水樣中氨鹽基含量的結果顯示在高溫緊迫下，發育早期胚胎 (stage-24)排放至水中的銨離子有上升趨勢；而發育晚期胚胎(stage-29 or hatching)的銨離子排放量在高溫緊迫組與控制組間無顯著差異(Fig. 1B)。. 24.

(29) 二、高溫緊迫對萊氏擬烏賊活性氧/氮(ROS/RNS)的影響本研究探討在高溫緊迫下，萊氏擬烏賊胚胎的細胞中 ROS/RNS 是否出現過量累積。本實驗將萊氏擬烏賊 stage-25 的受精卵放置於 32 ± 1 ℃高溫環境中，並分別於 4 小時與 28 小時後立即進行解剖採樣，作為短期處理組(acute)與長期處理組(chronic)，研磨成蛋白質萃取液後進行細胞中 ROS/RNS 濃度測量與分析。短期高溫處理對萊氏擬烏賊胚胎沒有顯著影響。而長期高溫處理下，雖然實驗結果統計上沒有明顯差異，但萊氏擬烏賊胚胎細胞內 ROS/RNS 不但沒有出現過度累積，反而有下降約 14% (Fig. 2)。. 三、高溫緊迫對萊氏擬烏賊抗氧化因子(SOD、CAT、HRP)的影響本研究進一步探討在高溫緊迫下，萊氏擬烏賊的抗氧化機制如何表現。本實驗將萊氏擬烏賊 stage-25 的受精卵放置於 32 ± 1℃高溫環境中，分別於 4 小時與 28 小時後立即進行採樣，作為短期處理組(acute)與長期處理組(chronic)，採集後製成 cDNA 進行抗氧化因子的基因表現量測量與分析。實驗結果顯示在短期高溫處理下，實驗組細胞內 SOD 的基因表現量相對於控制組已有明顯上升約 46%，以協助進行初始活性氧 O2-˙的轉換(Fig. 3A)；而在長期處理下，實驗組細胞內的 SOD、 CAT 與 HRP 的基因表現量相對於控制組各明顯上升約 41%、53%、. 25.

(30) 與 96% (Fig. 3A-C)。. 四、高溫緊迫對萊氏擬烏賊抗逆境基因(HSP70、HSP90)的影響本研究進一步探討在高溫緊迫下，萊氏擬烏賊的抗逆境因子如何表現，本實驗將萊氏擬烏賊 stage-25 的受精卵放置於 32 ± 1℃高溫環境中，分別於 4 小時與 28 小時後立即進行採樣，作為短期處理組(acute)與長期處理組(chronic)，採集後製成 cDNA 進行抗逆境因子的基因表現量測量與分析。實驗結果顯示 HSP70 與 HSP90 的基因表現量在短期 (4h)高溫處理組相對於控制組顯著各上升約 34%與 135%；而長期(28h) 高溫處理組，相對於控制組顯著各上升約 189%與 49% (Fig. 4A,B)。. 五、. 高溫緊迫對萊氏擬烏賊卵鞘液中銨離子含量的差異. 本研究進一步探討在高溫緊迫下，藉由測量卵鞘內 PVF 含有的銨離子濃度，了解萊氏擬烏賊的氨基酸代謝與高溫緊迫間的關係。受精卵長期放置於 32 ± 1℃高溫環境中，採集發育時期 24、26 與 29 的受精卵，並利用針筒抽取卵鞘內 PVF 密封保存在 4℃，進行銨離子濃度測量與分析，而採樣胚胎各基礎表徵測量標示於 Fig. 5B。並以各採樣時期在 28 ± 1℃的處理溫度做為控制組。實驗結果顯示，在高溫緊迫下，胚胎發育早期(stage-24)與晚期(stage-29)排放至 PVF 中的銨離子相對於控制組各別上升約 49%與 19%；可是，結果顯示隨著胚胎發 26.

(31) 育時期的成熟，PVF 中銨離子濃度會逐漸下降(Fig. 5A)。. 六、高溫緊迫對萊氏擬烏賊電子傳遞鏈中細胞色素 c 氧化酶Ⅰ(COX Ⅰ)的影響本研究進一步探討在高溫緊迫下，藉由測量電子傳遞鏈中四個複合物之一的 COXⅠ的基因表現量，探討萊氏擬烏賊面對高溫緊迫時有氧代謝會如何表現，本實驗將萊氏擬烏賊 stage-25 的受精卵放置於 32 ± 1℃高溫環境中，分別於 4 小時與 28 小時後立即進行採樣，作為短期處理組(acute)與長期處理組(chronic)，採集後製成 cDNA 進行抗逆境因子的基因表現量測量與分析。在短期高溫處理下，COXⅠ的基因表現量相對於控制組有明顯下降約 59%；然而在長期處理下，COXⅠ 的基因表現量相對於控制組卻有明顯上升約 96% (Fig. 6)。. 七、高溫緊迫對萊氏擬烏賊調控細胞平衡的 NKA 蛋白表現量的影響本研究進一步探討在高溫緊迫下，萊氏擬烏賊細胞中 NKA 的蛋白表現量是否與維持細胞內體液與生理平衡機制有關。本實驗將萊氏擬烏賊 stage-25 的受精卵放置於 32 ± 1℃高溫環境中，分別於 4 小時與 28 小時後立即進行採樣，作為短期處理組(acute)與長期處理組(chronic)，採集後研磨成蛋白質萃取液，進行 NKA 蛋白表現量的測量與分析。在短期高溫處理下，NKA 的蛋白表現量相對於控制組有顯著下降約 27.

(32) 33%；在長期處理下，NKA 的蛋白表現量相對於控制組會顯著上升約 236% (Fig. 7)。. 八、高溫緊迫對萊氏擬烏賊細胞中容易受 ROS 影響的 HIF-1蛋白表現量的影響本研究進一步探討在高溫緊迫下，萊氏擬烏賊細胞中容易受 ROS 影響的 HIF-1蛋白表現量，藉此了解細胞中 ROS 是否出現過量累積，因而導致 HIF-1蛋白表現量出現改變。本實驗將萊氏擬烏賊 stage-25 的受精卵放置於 32 ± 1℃高溫環境中，分別於 4 小時與 28 小時後立即進行採樣，作為短期處理組(acute)與長期處理組(chronic)，採集後研磨成蛋白質萃取液，進行 HIF-1蛋白表現量的測量與分析。在短期高溫處理下，HIF-1的蛋白表現量相對於控制組顯著上升約 60%；然而在長期處理下，HIF-1的蛋白表現量相對於控制組卻僅有上升而無顯著差異的現象 (Fig. 8)。. 28.

(33) 討論一、. 實驗用萊氏擬烏賊胚胎發育時期挑選. 根據胚胎各發育時期耗氧實驗結果顯示：萊氏擬烏賊胚胎發育早期或晚期在面對高溫緊迫的環境下，其耗氧速率與胚胎排放銨離子程度均受到影響；同時耗氧速率伴隨著胚胎發育有所上升，因胚胎發育或面對高溫壓力會增加體內的代謝率導致氧消耗量的提高，所以生物耗氧速率能夠反映細胞進行有氧代謝的效能(Hoeger et al., 1987; Pimentel et al., 2012)，本實驗結果與前人研究的歐洲烏賊 Loligo vulgaris 和歐洲虎斑烏賊 Sepia officinalis 研究結果也相互吻合(Pimentel et al., 2012)。而防止因脫氨作用而細胞銨累積造成毒害，銨必需排出細胞或體外，因此測量密封實驗槽中水樣銨離子濃度能夠反映細胞進行氨基酸代謝的效能(Randall and Tsui, 2002; Smith, 1929)。面對高溫緊迫環境下，實驗組的發育早期胚胎(stage-24)與控制組相比，其耗氧速率與水樣中銨濃度均有上升趨勢(Fig. 1A,B)，Q5 值為 1.95，可見高溫緊迫對早期胚胎具有提升其基礎代謝率的重大影響，因此導致整體代謝效能的提高。然而，實驗組的發育晚期胚胎(hatching)與控制組相比，其耗氧速率與水樣中銨濃度卻有下降趨勢(Fig. 1A,B)，Q5 值為 0.72，由此結果推測：因為胚胎發育早期便轉移到高溫緊迫環境下持續飼養，而面臨這種長期的外界高溫壓力，可能導致胚胎發育晚期之生理與代謝狀況 29.

(34) 異常，影響實驗結果(Rosa et al., 2012)。因此，本一系列的代謝指標檢測實驗結果提供我們選取最合適以進行後續實驗，而不會因發育問題與影響結果的胚胎時期，故本實驗選取 stage-25 或 stage-26 的早期胚胎，其重要的胚胎外表徵為眼睛呈現橘色或深橘色，套膜完全包覆鰓，墨囊可見於腹面(Cole and Hall, 2009)。. 二、. 高温緊迫對萊氏擬烏賊氧化壓力與抗氧化壓力相關能力探討. 根據 ROS/RNS 的實驗分析結果顯示：萊氏擬烏賊體內的 ROS/RNS 含量不論是處於短期高溫緊迫壓力還是長期高溫處理適應都沒有出現顯著的累積(Fig. 2)。因此，我們推測高溫緊迫並不會對萊氏擬烏賊胚胎造成細胞氧化壓力。然而，根據抗氧化壓力因子的一系列實驗結果顯示：短期高溫緊迫處理(4 小時)下，烏賊胚胎體內對活性氧 O2-˙ 具有高敏感度的 SOD 基因表現相已有顯著上升(Fig. 3A)，在此同時，容易受到 ROS 累積刺激的 HIF-1蛋白表現量也有明顯提升(Fig. 8)。由以上結果我們推論：萊氏擬烏賊胚胎體內的活性氧可能在瞬間且短期的高溫緊迫壓力下大量上升，在此同時細胞中抗氧化機制也能夠即時啓動，以防止細胞中因 ROS/RNS 的過量累積而造成細胞毒害。另外在長期高溫處理(28 小時)後，大量的 O2-˙已轉化為其他的活性氧分子，如：H2O2 與˙OH 等，導致其他抗氧化因子 CAT 與 HRP 的基因表現相均有上升(Fig. 3B,C)，共同協助防止 ROS/RNS 累積；而細胞 30.

(35) 中 ROS/RNS 累積已經獲得緩和，進而促使 HIF-1的蛋白表現量只有上升趨勢而沒有明顯差異(Fig. 8)。另一方面，萊氏擬烏賊胚胎細胞在面對外界高溫緊迫壓力下，不論短期或長期高溫處理胚胎均有受到損害或發生變異的可能，因此導致細胞中抗逆境因子 HSP70 與 HSP90 的基因表現相均明顯上升 (Fig. 4A,B)，以幫助蛋白質摺疊與細胞修復。綜合以上結果我們推論：海洋無脊椎頭足類動物在早期胚胎發育階段已具有十分完善的細胞抗氧化機制來面對外界的高温緊迫。. 三、. 高温緊迫對萊氏擬烏賊氧化代謝機制相關探討. 根據前人的研究報告指出：外溫動物面臨外界壓力時會提昇代謝速率以獲取額外能量面對逆境(Houde, 1989; Pörtner and Knust, 2007)，另外，隨著胚胎發育時期的進行，頭足類中的歐洲烏賊(L. vulgaris)和歐洲虎斑烏賊(S. officinalis 胚胎代謝能力與需求也有所增加(Pimentel et al., 2012)。為探討頭足類胚胎在發育時期面對高溫緊迫的環境下，其體內氨基酸代謝的效能，我們測定經由氨基酸代謝後排放至卵鞘中 PVF 的銨離子(NH4+)濃度(Hoeger et al., 1987)。根據實驗結果顯示：高溫緊迫下胚胎各發育時期 PVF 中銨離子濃度都較控制組高 (Fig. 5)，顯示胚胎面對高溫緊迫體內的代謝反應與能量需求會提升，以供調節體內平衡與保護細胞等機制對抗外界壓力。然而，卵鞘厚度隨著胚胎發育有逐漸減薄的現象，導致滲透度逐漸增高進而促進了 PVF 中銨離子 31.

(36) 與外界環境的擴散作用(Rosa et al., 2012; Schmidt-Nielsen, 1997)，因此在實驗結果中隨著胚胎發育其 PVF 中銨離子濃度逐漸下降(Fig. 5A)，這現象並不代表胚胎發育時，氨基酸代謝的效能不斷下降，或是面對外界環境時其細胞採用此代謝途徑的機制下降。也有如先前討論結果，因長期處於高溫緊迫對於無脊椎變溫動物胚胎或幼體會造成發育不全，甚至個體死亡(Rosa et al., 2012)，故發育晚期胚胎(hatching)實驗結果不能進行準確推論。除此之外，我們偵測生理調控中與細胞呼吸代謝相關的 cytochrome c oxidase subunit I (COX I)基因表現相，與細胞膜電位恆定相關的 Na+/K+-ATPase (NKA)蛋白表現量發現：短期的高溫處理兩者都出現明顯下降現象，而長期的高溫處理下卻有顯著上升趨勢(Fig. 6,7)。我們推測短期的高溫緊迫造成 COX I 與 NKA 表現量受到抑制是因為細胞內的 ROS/RNS 的迅速累積，誘發了 HIF-1的活化，除了可能促使細胞進行適應性能量移轉(adaptive metabolic shift)機制，同時抑制粒線體電子傳遞鏈的活性，降低 ROS/RNS 的繼續累積(Taylor, 2008)，因此我們測定的電子傳遞鏈上 COX I 基因表現相才會出現下降情況 (Fig. 6)；但這種短暫抑制 ROS/RNS 產生的負回饋生理機制也會影響其他協助面對逆境的代謝途徑，使胚胎整體能量分配出現失衡狀態，甚至對細胞造成危害。另外，我們檢測了運用主動運輸穩定 32.

(37) 細胞膜電位的 NKA 蛋白，發現其表現量有明顯下降現象(Fig. 7)，我們推測是因為細胞為了防止能量轉移分配不均的情況加劇，進而抑制運用主動運輸耗能機制的離子通道，以降低細胞能量需求。頭足類動物胚胎面臨短期高溫緊迫的生理應變機制能藉由 HIF-1的活化有效降低細胞的氧化壓力。然而，胚胎細胞在長期高溫緊迫伴隨著發育成長時，個體的整體代謝率必然提升並需要更多的能量供給，相對地會繼續造成細胞內代謝銨離子或 ROS/RNS 的累積，細胞除了必需將這些有害的代謝產物排出，並且需要提升抗氧化因子與抗逆境因子等保護機制以防止細胞傷害。在諸多生理機制需要穩定的條件影響下我們發現：頭足類動物胚胎在高溫緊迫下因為細胞內 ROS/RNS 的含量能夠有效維持，因此導致 HIF-1在長期高溫緊迫下已有下降趨勢(Fig. 8)，對電子傳遞鏈的抑制作用因此減弱，造成 COX I 基因表現相的結果顯著上升(Fig. 6)，並且促進整體代謝機制啟動以提高能量獲取。另外，前人的研究報告指出：具有維持細胞膜電位恆定的 NKA 與調控細胞內銨離子濃度有直接相關(Ip and Chew, 2010; Randall et al., 1999)，因此長期高溫緊迫下所測定的 NKA 蛋白表現量明顯上升(Fig. 7)，說明頭足類動物胚胎必須藉由活化 NKA 的蛋白表現以協助排放在長期高溫緊迫下產生的銨離子進而維持胞內恆定。. 33.

(38) 結論迴游性的萊氏擬烏賊的胚胎時期由於是附著於沿岸潮間帶礁石區域，不能通過轉移棲地避免非生物性的環境緊迫壓力，因此可能促使萊氏擬烏賊胚胎演化出適應環境的對策以提高存活機率。根據我們的研究結果顯示：萊氏擬烏賊在胚胎發育時期確實具有良好的細胞抗氧化壓力機制與合適的代謝策略轉移機制協同面對外界的高溫緊迫，可是其生理上的演化速度能否追上近年人類對自然環境的影響，我們仍然存疑。雖然本實驗中萊氏擬烏賊胚胎內的 ROS/RNS 在細胞中濃度並不會因高溫緊迫而明顯提升 (Fig. 2)，然而在飼養的過程中我們發現：發育初期的萊氏擬烏賊胚胎只要曾經接受高溫處理超過 28 小時後，即使回復到正常溫度下馴養，胚胎晚期出現胚體畸形或死亡的情況甚高，即使成功孵化出幼體，幼體出現早產徵狀而容易死亡的現象也十分普遍。這充分說明萊氏擬烏賊胚胎面臨高溫壓力時的生理適應性代謝策略並無法在每個發育時期完全有效地防止細胞毒害，其體內的代謝與生理機制間的協同調適機制還需要進一步研究。. 34.

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(44) Table 1. Primers used for qRT-PCR Protein name. Abbreviation. Catalase. CAT. Superoxide dismutase. SOD. Peroxidase. Prx. Glutathione peroxidase. GPx. Nitric oxide synthase a. NOSa. cytochrome c oxidase I. CoxI. Heat shock protein 70. HSP70. Heat shock protein 90. HSP90. Amplicon size (bp). Accession numbers. 159. AEJ33812.1. F 5’- TGGAAAGATCGTGTCGTCGTGGAA -3’ R 5’- CGCTGTATGGTGATCGGATATCGT -3’. 90. HM157275.1. F 5’- TGAGAGCAATGACAGGCGGTCTTA -3’ R 5’- AATGTTGGCCAGACGGTTGTGTTC -3’. 121. S77774.1. 128. AY675197.1. F 5’- TGGAAAGATCGTGTCGTCGTGGAA -3’ R 5’- ATCCATACCCAATCAGCCGGACAT -3’. 164. AY582749.1. F 5’- ACCGAATTAGGTAAACCCGGCTCA -3’ R 5’- AGGGACAAGTCAGTTACCAAAGCC -3’. 138. AY131065.1. 109. HM157267.1. 106. JN825731.1. 127. HM157280.1. Primer sequence F. 5’- TACAACGCCATTGCGAACGGAAAC -3’. R 5’- AAGTACCATTCGGCCAACAGGGAT -3’. F. 5’- ACTGCACATCCACTTTGGGT -3’. R 5’- TGTGGACTGTAACGTTGGACTGGA -3’. F. 5’- TCAACACCAAGTCAACGGTCGAAG -3’. R 5’- TGGTCAAGCCAGCTGATTACCTCT -3’ F 5’- CCTGACGATGAGGAGTCTAA -3’ R 5’- CAACCTTCTCGACCTTCTTG -3’. Reference genes Ubiquitin-conjugated enzyme. UBC. F. 5’- ATGCAGATGGCAGTATTTGCCTGG -3’. R 5’- TTATTGGCTGGGCTGTTTGGGTTC -3’. F, forward primer; R, reverse primer 40.

(45) Egg mass (g). Embryo + yolk mass (mg). Embryo mass (mg). Total length (mm). mantel length (mm). yolk length (mm). 29. 5.56 ± 0.41. 117.90 ± 13.6. 32.87 ± 9.17. 34.49 ± 1.76. 10.92 ± 1.14. 17.53 ± 0.69. 32. 4.90 ± 0.67. 119.63 ± 11.63. 35.37 ± 9.57. 33.33 ± 2.39. 9.90 ± 1.16. 17.00 ± 1.73. 29. 11.60 ± 1.30. 202.27 ± 12.54 169.43 ± 12.60. 44.56 ± 0.96. 21.93 ± 0.93. 11.62 ± 0.17. 32. 11.31 ± 0.62. 175.50 ± 13.73 135.73 ± 6.81. 43.77 ± 0.71. 20.95 ± 1.01. 11.57 ± 1.87. 29. -. -. 158.70 ± 25.70. 34.26 ± 1.24. 22.46 ± 0.34. -. 32. -. -. 167.50 ± 11.94. 33.22 ± 1.82. 21.90 ± 0.62. -. Temperature (℃). Stage-24. Stage-29. Stagehatching. Table 2 The basis physiological measurement in Sepioteuthis lessoniana embryos (from stage 24, stage 29 and hatching) in respiration rate experiment at two different temperature：28℃ and 32℃.. 41.

(46) in Sepioteuthis lessoniana embryos. Respiration rate (mol O2 /h gEM ). A 28oC 32oC. 60 50. b. 40. z. 30 20 10. y a. x. 0 -10. a stage 24. stage 29. hatching. Embryo development stage. B 28oC 32oC. 1000 in sampling water. Ammonium(NH4. +. ) conentration(mol/gEM ). 1500. 500 0. x. x a. a. x a. -500 -1000 stage 24. stage 29. hatching. Embryo development stage Figure 1 Respiration rate (μmol O2 /h gEM ) in Sepioteuthis lessoniana embryos (A) (from stage 24 to hatching) and ammonium (NH4+) concentrations in sampling water (B) at two different temperature：28 ℃ and 32 ℃. (one-way ANOVA, Tukey test, e.g a significant difference is observed between ‘a’ and ‘b’, but not between ‘a’, P<0.05). 42.

(47) 4 h (acute). 28 h (chronic) o. 25 C. DCF fluorescence (fold of control). o. 1.5. 1.5. 1.0. 1.0. 0.5. 0.5. 0.0. o. 25 C. 0.0. o. 32 C. 32 C. o. 25 C. o. 32 C. Figure 2 The value of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) in Sepioteuthis lessoniana embryos. Detection of various free radical species were using OxiSelectTM In Vitro ROS/RNS Assay Kit. Values were presented as mean ± standard deviation (SD) (n=8). *, Significantly different between control and hyperthermic group (Student’s t-test, p<0.05).. 43.

(48) 4 h (acute). 28 h (chronic). A. Superoxide dismutase (sod) mRNA expression of sod normalized by ubc. 1.2. * *. 0.9 0.6 0.3 0.0. o. 1.2. **. 0.9. 25 C o 32 C. 0.6 0.3. o. 25 C. o. 32 C. 0.0. o. 25 C. o. 32 C. normalized by ubc. mRNA expression of cat. B. Catalase (cat) 1.2. 1.2. 0.9. 0.9. 0.6. 0.6. 0.3. 0.3. 0.0. o. 25 C. o. 32 C. 0.0. *. o. 25 C. o. 25 C o 32 C. o. 32 C. mRNA expression of hrp normalized by ubc. C. Horseradish peroxidase (hrp) 4. 4. 3. 3. 2. 2. 1. 1. 0. o. 25 C. o. 32 C. 0. **. o. 25 C. o. 25 C o 32 C. o. 32 C. Figure 3 Effects of hyperthermic circumstance on anti-oxidants, catalase (cat), superoxide dismutase (sod) and horseradish peroxidase (hrp), expressions in Sepioteuthis lessoniana embryos. The mRNA expressions were detected by qRTPCR. Values were normalized by ubiquitin-conjugated enzyme (ubc) and presented as mean ± standard deviation (SD) (n=4~6). Significantly different between control and hyperthermic group (Student’s t-test, *, p<0.05, **, p<0.01).

(49) 4 h (acute). 28 h (chronic). mRNA expression of hsp70 normalized by ubc. A. Heat shock proteins 70 (hsp70) o. 1.6. 1.6. *. 1.2. 0.8. 0.4. 0.4 o. 25 C. **. 1.2. 0.8. 0.0. 25 C o 32 C. 0.0. o. 32 C. o. 25 C. o. 32 C o. o. 25 C. 25 C. mRNA expression of hsp90 normalized by ubc. B. Heat shock proteins 90 (hsp90) 1.6. 1.6. 1.2. 1.2. *. 0.8. 0.8 0.4. 0.4 0.0. *. o. 25 C o 32 C. o. 25 C. 0.0. o. 32 C. o. 25 C. o. 32 C. Figure 4 Effects of hyperthermic circumstance on stress-resistant genes (Heat shock proteins, hsp70 and hsp90) expressions in Sepioteuthis lessoniana embryos. The mRNA expressions were detected by qRT-PCR. Values were normalized by ubiquitin-conjugated enzyme (ubc ) and presented as mean ± standard deviation (SD) (n=4~6). Significantly different between control and hyperthermic group. (Student’s t-test, *, p<0.05, **, p<0.01). 45.

(50) 2500 in perivitelline fluid (PVF). Ammonium(NH4. +. ) conentration(mol/gEM ). A PVF. 2000. x 1500 1000. a. 500 0. B. **. 28oC 32oC. y b. stage 24. stage 26. *y b. stage 29. Embryo development stage. Figure 5 A. Ammonium (NH4+) concentrations in perivitelline fluid (PVF) at different temperature:. 28 ℃ and 32 ℃ (A). Values were presented as mean ± standard deviation (SD) (n=3~4). Significantly different between control and hyperthermic group (Student’s t-test, *, p<0.05, **, p<0.01). (one-way ANOVA, Tukey test, e.g a significant difference is observed between ‘a’ and ‘b’, but not between ‘a’, P<0.05) B. The basis physiological measurement of Sepioteuthis lessoniana embryos (from stage 24, stage 26 and stage 29) in sampling at two different temperature：28℃ and 32℃. 46.

(51) mRNA expression of cox normalized by ubc. 4 h (acute). 28 h (chronic). 1.2. 1.2. 0.9. 0.9. 0.6. 0.6. *. 0.3 0.0. o. 25 C. o. *. 0.3 0.0. o. 32 C. o. 25 C. o. 32 C. Figure 6 Effects of hyperthermic circustance on cytochrome c oxidase I (coxI) expressions in Sepioteuthis lessoniana embryos. The mRNA expressions were detected by qRT-PCR. Values were normalized by ubiquitin-conjugated enzyme (ubc ) and presented as mean ± standard deviation (SD) (n=4~6). Significantly different between control and hyperthermic group (Student’s t-test, *, p<0.05).. 47. 25 C o 32 C.

(52) 4 h (acute). 28 h (chronic). 25℃ 32℃ 25℃ 32℃ 25℃ 32℃. 25℃ 32℃ 25℃ 32℃ 25℃ 32℃. NKA (110kDa). Relevant NKA protein amount in intact embryos. β-actin (45kDa). 1.2. 1.2. 0.9. 0.9. 0.6. 0.6. *. 0.3 0.0. o. 25 C. **. 0.3 0.0. o. o. 25 C. 32 C. o. 32 C. Figure 7 The representative Western blots of Na+-K+-ATPase (NKA) in Sepioteuthis lessoniana embryos. Values were normalized by β-actin and presented as mean ± standard deviation (SD) (n=3~4). Significantly different between control and hyperthermic group (Student’s t-test, *, p<0.05, **, p<0.01).. 48. o. 25 C o 32 C.

(53) 4 h (acute). 28 h (chronic). 25℃ 32℃ 25℃ 32℃ 25℃ 32℃. 25℃ 32℃ 25℃ 32℃ 25℃ 32℃. HIF-1a (93kDa) β-actin (45kDa). o. Relevant HIF-1a protein amount in intact embryos. 1.2. *. 0.9. 0.9. 0.6. 0.6. 0.3. 0.3. 0.0. 25 C o 32 C. 1.2. o. 25 C. 0.0. o. 32 C. o. 25 C. o. 32 C. Figure 8 The representative Western blots of hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1a) in Sepioteuthis lessoniana embryos. Values were normalized by β-actin and presented as mean ± standard deviation (SD) (n=3~4). Significantly different between control and hyperthermic group (Student’s t-test, *, p<0.05).. 49.

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