緒論

※ 前言

在生命系統中每一個生化反應都牽扯到酵素（enzyme；酶）的催化，

因此生命的延續跟酵素反應息息相關。酵素主要成分是蛋白質（protein），

蛋白質的來源又是由 DNA（deoxyribonucleic acid）上面的基因密碼

（genetic code）轉錄成 mRNA（messenger ribonucleic acid），再轉譯 成蛋白質。上述的所有生物聚合體（biopolymers）的穩定與否，就非常重 要。一般而言，在中性 pH 值、25℃的環境之下，水解 DNA 之磷酸雙酯 鍵（phospodiester bond）的半生期可以達 13 萬年之久，RNA 的磷酸雙 酯鍵水解半生期則為 4 年左右，蛋白質的胜肽鍵（peptide bond）水解半 生期則約為 7 年。然而，一旦 DNA 發生突變（mutation）需要修補（repair），

或是蛋白質功能不再，需要被分解，在生理條件的時間尺度，這些生物聚 合體的分解就需要被催化，此時就需要水解酶（hydrolase）來促進 DNA、

RNA 或蛋白質的分解¹，人造核酸水解酶（artificial nuclease/ribonuclease）

就是想針對目標生物聚合體的分解而被設計產生。

天然的限制酶（nature restriction nuclease）有一些先天上的限制，

包括分離純化不易且成本高、認知的序列辨識區常只有 4-6 個鹼基，核醣 核酸長鏈會被切割成很多小片段，造成辨識度不足，在各式病毒性及癌症

重在 RNA 的水解機構。因為 RNA 其五碳糖的第二位置上有一氫氧基

（2’-OH），這個氫氧基在反應機制中被認為扮演極重要的角色；目前被廣 泛接受水解 RNA 的反應機制包括兩個步驟，轉酯反應（transesterification）

和水解反應。在第一個步驟的轉酯反應中，RNA 上五碳糖的 2’-OH 會先 解離脫掉氫質子 （deprotonation），並形成強親核基（nucleophile）alkoxide，

之後 alkoxide 會攻擊五碳糖 3’端磷酸酯鍵之磷原子，形成 2’,3’-cyclic phosphate；在第二個步驟的水解反應中，2’,3’-cyclic phosphate 會水解 為2’-phosphate 及 3’-phosphate，至此完成整個水解反應。然在轉酯反應 中，可能會形成一個雙三角椎（trigonal bipyrimide）之過渡態³，RNA 水 解機構如（圖 1-1.）。

【圖 1-1.】 RNA alkaline cleavage 水解步驟³

RNA 因為有其結構上的優勢，形成 alkaline instability³，水解的速率 很快。相對的 DNA 的五碳糖的2’-H，使得 DNA 的水解過程中所需要的親 核基就必頇由外界提供；此外，外來的親核基帶負電，而磷酸酯鍵也帶負 電，同性相斥的結果，會使得 DNA 水解反應更不容易進行，也因此 DNA 在自然界可以穩定存在萬年以上。

DNA 的酵素水解通常是依照下列兩步驟，如（圖 1-2.）所示：

（1）藉由外來的親核基攻擊在磷原子上，例如：外來的 OH^- ，形成五配 位的中間物（pentacoordinated intermediate）。

（2）移除2’-deoxyribonucleotide 位置上的 5’-OH ，且 P-O 鍵斷裂。此 步驟是反應的速率決定步驟。而在非酵素水解反應中，在3’端 P-O 鍵的分 裂也會發生⁴。

【圖 1-2.】 DNA 水解的反應步驟⁴

天然的核酸酶和限制酶是非常具有專一性，但是卻有鍵結過強的缺點，

加上 DNA 水解不易，RNA 水解速率是比 DNA 快 10⁵～10⁶倍。因此除了 參考 RNA 水解的反應特性外，觀察自然界中的水解 DNA 酵素也是一項很 好 的 選 擇 。 最 有 名 的 兩 個 例 子 ： alkaline phosphatase 、 purple acid phosphatase。以 E. coli. alkaline phosphatase 為例（圖 1-3.），其是有兩 個 Zn²⁺金屬中心的雙核酵素，兩個 Zn²⁺金屬彼此相距約 3.9Å ，可不專一 催化任意磷酸酯鍵。它是由兩個步驟催化 DNA 的水解：當雙金屬離子固

【圖 1-3.】 Escherichia coli alkaline phosphatase 催化磷酸酯鍵的過程¹

【圖 1-4.】 Escherichia coli alkaline phosphatase 催化磷酸酯鍵的五配位過渡態⁶

由此可知水解 DNA 或 RNA 的磷酸雙酯鍵如果有金屬離子的加入，就 會更有效率，實際上生物體的酵素的確都需要金屬離子才能發揮其功用。

金屬離子在催化水解磷酸雙酯鍵反應的角色主要是⁵（如圖 1-5.）：

（a）和水配位後並解離形成金屬氫氧根離子（ metal-bound hydroxy anion），金屬氫氧根離子當作是一個路易士鹼（Lewis base）來拔除 2’-OH 上的氫，使其成為2’-O^-強親核基，攻擊五碳糖3’端磷酸酯鍵之磷原子；

（b）配位在 2’-OH 的氧原子上，吸引氧原子上電子雲，使 2’-OH 的氫更 容易解離，以形成2’-O^-親核基（metal stabilized oxyanion）；

（c）轉酯過程中所形成的五配位中間物或過渡態，會由於金屬靜電相吸 而提供其穩定性；

（d）配位在離去基（leaving group）上，穩定離去基，使反應朝向水解 方向進行。

【圖 1-5.】 金屬催化轉酯或水解的可能機制⁵

在親核基攻擊的反應部分，可用來幫助加速水解反應的金屬離子包括 Mg²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、Ln³⁺（鑭系金屬離子）、UO²⁺

（二氧化鈾離子）和 Th salts（釷鹽）等；非金屬離子 H⁺、OH^-、amines

水解反應速率會隨著鑭系金屬的原子序增加而遞增，Tm³⁺、Yb³⁺和 Lu³⁺

等離子是較有效率的；Ce⁴⁺被認知是最有效率的 DNA 水解促進劑⁴。 雖然鑭系金屬離子在水溶液下是很有效率的 DNA 切割試劑，但其在 高 pH 值的水溶液下會產生沈澱⁸，且會對生物體產生毒性；因此設計出一 種錯合物是可保有鑭系金屬的水解切割能力，且不具有生物毒性及安全性，

是科學家努力的方向。為設計出對鑭系金屬有較高親和力的配位子，我們 參照 MRI（magnetic resonance imaging） 核磁共振造影試劑的設計 ⁹， 發現大環配位子遠比線性配位子對鑭系金屬所形成的錯合物較穩定，更發 現到當配位子中在氮原子上有 carboxymethyl group (乙酸基) 的鍵結，可 提供一個帶中性或正電的錯合物之設計方法。

【圖 1-6.】 目前 FDA 通過的 MRI 試劑⁹

目前有不少團隊致力於人造磷酸水解酶的研究，也都有重要的發 現，循著這些研究我們可以更了解不同切割劑的特性與應用。

※ 文獻回顧

◎Breslow et al.

從 alkaline phosphatase 發現到金屬 Zn²⁺有催化的功能，1986 年，

Breslow 團隊就設計含氮大環，錯合 Zn²⁺，切割 DPPNPP（diphenyl

p-nitrophenyl phosphate）

，在 pH 8.7 的 CH₃CN^（_aq^）下，催化的活性物質 zinc hydroxide complex 會產生，水解效率提高¹⁰。其團隊早期主要的三 個大環（圖 1-7.），衍生物 1、2 在相同的實驗條件下，反應速率可以比沒 有官能基的 3 快 9 或 20 倍以上。顯示這些輔助官能基具有一般鹼基的功 能，可促進催化反應，稱為雙官能基催化（bifunctional catalysis）（圖 1-8.）

11。

【圖 1-7.】 Breslow 團隊研究的含氮大環衍生物¹²

【圖 1-8.】 酵素與金屬的雙官能基催化¹¹

Zn

²⁺ B

Zn

²⁺ B

O

-X

_O

H

◎Hendry and Sargeson

1986～1990，Hendry and Sargeson 發表以 Co³⁺及 Ir³⁺與四元的單體 錯合的催化金屬，發現 Ir³⁺比 Co³⁺體積來得大，反應過程環的包覆性

（closure）會較差，因此催化速率比 Co³⁺的錯合物慢。但是環的開闔與 否，並不是那麼重要，在生物體酵素催化反而傾向開放性的結構，且生物 中常用來催化的金屬 Mg²⁺、Zn²⁺都是比 Ir³⁺還大的金屬。所以此團隊提出 來的催化機制比較不符合生物體的酵素催化機制¹³。

【圖 1-9.】 Hendry and Sargeson 利用 O¹⁸追蹤其 Ir³⁺錯合物水解磷酸鍵的機制¹¹

◎Krämer

1996 年，Krämer 團隊以雙官能基催化反應機構為基礎設計配位子（圖 1-10.）^{12, 14}。其結構是由兩個吡啶環（bpy）構成，並在吡啶環 2 的位置 上接上烷基胺（alkylamine）作為胺基酸的類比物。兩種配位子，一個胺 基上接有氫，另一個則以甲基取代。兩者均配位上 Cu²⁺形成 L¹Cu、L³Cu。

L¹Cu、L³Cu 水解 BNPP（bis(p-nitrophenyl) phosphate）的結果，L¹Cu 的水解速率比 L³Cu 快上 1000 倍，而(bpy)Cu 則和 L³Cu 的速率相當。這 主要的原因可能是 BNPP 的磷酸雙酯鍵與 L¹Cu 金屬配位並以氫鍵與一個 胺基酸連結，這樣電荷穩定的狀態下受質在合適的方位被 Cu-OH^-的親核 基攻擊（圖 1-10.）¹²。

【圖 1-10.】 Krämer 的 BNPP 切割劑¹²，L¹Cu Kcat=4.4 × 10^-3；L³Cu Kcat=4 × 10^-6。

◎Burstyn et al.

從 1993 年起，Burstyn 提出（Cu[9]aneN3Cl₂）以三氮九元環的配位 子與 Cu²⁺錯合，水解 BNPP，並以 HPLC 分析水解後的產物為 p-nitrophenyl phosphate 及 p-nitrophenolate¹⁵。水解後的動力學發現，催化級數只有 0.5，

金屬的配位水在 pH 7.3 始解離，水解反應上升。Burstyn 認為水解反應過 程單體形成雙體（圖 1-11.）的平衡常數 Kf=1220 M^-1，因此具有活性的單 體比例下降，反應級數下降¹⁶。

【圖 1-11.】 Burstyn Cu[9]aneN3Cl2水解 BNPP 反應平衡式¹⁶

Burstyn 等又陸續合成 Cu[9-11]aneN₃X₂，水解 BNPP 實驗結果，環 穴越大，水解速率就會增加，從九元環到十一元環速率常數增加了 8 倍，

並發現雙體形成常數 Kf隨之下降（表 1-1.）。而在分析金屬錯合物結晶圖，

環穴越大，金屬離子就越深入環穴中心，N-Cu-N 的鍵角就越大，相對 Cu 的兩個配位水鍵角會減小，大環錯合物在水溶液中形成雙體的立體阻礙變 大，單體的比例升高，水解反應自然增快¹⁷。

【表 1-1.】 Burstyn Cu[9-11]aneN3Cl2水解 BNPP 之常數¹⁷

為了增加大環的立體障礙，Burstyn 在其九元環的氮上加上三個異丙 基（圖 1-12.）¹⁸，Cu(i-Pr3[9]aneN₃)²⁺環穴中心金屬鍵角更大，雙體的形 成常數更小，反應速率也更快，可達九元環的 60 倍以上（表 1-2.）。

【圖 1-12.】 Burstyn Cu[9]aneN3Cl2及 Cu(i-Pr3[9]aneN3)²⁺圖示¹⁸

【表 1-2.】 Burstyn Cu(i-Pr3[9]aneN3)²⁺水解 BNPP 與其他大環的常數比較¹⁷

◎Morrow et al.

天然的酵素 多半有 兩個以上的 金屬參 與催化反應 ，例如 alkaline phosphate。因此除了單核金屬錯合物，多核金屬錯合也被重視，1998 年 Morrow 就以此為概念，採用了 Burstyn 發展的三氮九元環來做雙體的研 究，利用苯環橋接了兩個三氮九元環，合成了兩種雙體配位子¹⁹（圖 1-13.）。 滴定得知雙體在 pH 7.3 時主要活性物種為（Cu2L(OH)₂²⁺），因此在 pH 7.3 條件下水解 GpppG 得到的假一次速率常數 ²⁰，兩種雙體的速率都是單體 的 100 倍左右。Morrow觀察到隨著 L³雙體濃度上升，反應速率剛開始是 二次趨勢，而高濃度處則有飽和的現象。所以他推測 L³雙體與 GpppG 反 應有 2:1 與 1:1 的反應機制（圖 1-14.），而套入到此模型計算出 L³ 2:1 組 合的假一次速率常數為 L³ 1:1 組合的 20 倍。而 L²雙體則只有 2:1 的反應 組成，假一次速率常數為 4.3 × 10^-5 s^-1。

【圖 1-13.】 Morrow 合成的兩種雙體，m-xylene、p-xylene¹⁹

【圖 1-14.】 Morrow 雙體反應模型

2003 年 Morrow^{21, 25}將兩個三氮九元環使用 1, 3-dibromo-2-propanol 連接合成新的雙核配位子 Zn₂(L2O) （圖 1-15.）。滴定實驗結果，相關設 計的雙體配位子與兩當量的 Zn²⁺都有極佳的錯合效果。而動力學實驗從水 解 HPNP （ 2-hydroxypropyl-4-nitrophenyl phosphate ） 的 結 果 顯 示 ， Zn₂(L2O) 的 二 級 反 應 常 數 是 Zn[9]aneN₃ 的 120 倍 。 這 結 果 支 持 了 Zn₂(L2O) 的兩個金屬離子可藉由協同作用來穩定 HPNP 的中間過渡態的 假設，大幅增加了水解速率（圖 1-15.）。

【圖 1-15.】 2003 Morrow 提出的 Zn2(L2O)，水解 HPNP 可能的過渡態²¹

除了專注在雙核水解反應之外，Morrow 在早期就曾經研究過過渡金屬、

鑭系金屬與六配位的配位子水解 RNA，結果發現鑭系金屬錯合物（圖 1-16.）

具有非常高的熱力學穩定性 ²²。此外，Morrow 團隊還發表了單純使用鑭

具有非常高的熱力學穩定性 ²²。此外，Morrow 團隊還發表了單純使用鑭

在文檔中 大環配位子ONO2A之穩定常數研究與其鑭系金屬錯合物之水解磷酸酯鍵效力 (頁 7-25)