國
立
交
通
大
學
生化工程所
碩
士
論
文
大環配位子 ONO2A 之穩定常數研究與
其鑭系金屬錯合物之水解磷酸酯鍵效力
The Stability Constants of Lanthanide Complexes of
ONO2A and the Promotion of BNPP Hydrolysis by
Lanthanide Complexes of ONO2A
大環配位子 ONO2A 之穩定常數研究與其鑭系金屬錯合物之水解磷酸酯鍵效力 學生：吳幸怡 指導教授：張正 博士 國立交通大學生化工程研究所 碩士班
摘要
鑭系金屬是正三價的金屬，其本身及錯合物是屬於好的路易士酸，且 已經被證實用在DNA、RNA及磷酸雙酯鍵的切割效果，是這些生物分子的 有效切割劑。先前，我們發表過LnDO2A+的配位特性以及在水解BNPP之 磷酸雙酯鍵的動力學效應2, 36, 40。為了可以利用三價的鑭系金屬錯合物來 設計更好而有效的人造核酸水解酶、去氧核醣核酸水解酶，我們合成過一 些多胺含氧多酸基的大環配位子，這樣的大環配位子比線性結構的異構物 高更能形成穩定的鑭系金屬錯合物。 在本篇論文中，我們發表合成ONO2A（二氮一氧九元環二乙酸基）大 環，並計算其與鑭系金屬形成錯合物時的穩定常數。在我們實驗比較後得 到的結果是，大致上三價鑭系金屬與大環的穩定常數隨著鑭系金屬原子序 的增加而增加。對於任一個鑭系金屬離子而言，其穩定常數在三種九元環 異構物的排序：LnNO2A+ > LnONO2A+ > LnPhNO2A+。 此外，在本論文中也研究LnONO2A+（Ln = Eu3+ , Yb3+）水解BNPP 的動力學效應。將動力學實驗速率結果套入我們所導出的單體-雙體反應模 式中，我們可以觀察單體與雙體在水解BNPP時的水解常數（k1 及k2）還 有單體-雙體的形成常數（Kf）。The Stability Constants of Lanthanide Complexes of ONO2A and the Promotion of BNPP Hydrolysis by Lanthanide Complexes of ONO2A
Student : Hsin-Yi Wu Adviser : Dr. C. Allen Chang Institute of Biochemical Engineering
National Chiao Tung University
Abstract
The cationic trivalent lanthanide (Ln3+) ions and complexes are good
Lewis acids and have been demonstrated to be effective DNA, RNA, and phosphodiester compounds’ cleavage agents. Previously we have reported the coordination properties of LnDO2A+ and their kinetic
behaviors of BNPP phosphodiester bond hydrolysis.2, 36, 40 To help
designing better effective artificial nucleases and ribonucleases employing trivalent lanthanide complexes, we have synthesized several macrocyclic polyaza-oxa polycarboxylate ligands which forms more stable complexes than their linear structural analogues.
In this thesis, we report the synthesis of ONO2A
(1-oxa-4,7-diazacyclononane-4,7-diacetic acid) and the stability
constants of its lanthanide complexes. In general, the stability constants of trivalent lanthanide complexes of a given ligand increase with increasing lanthanide atomic number. For a given lanthanide ion, the
stability constant follow the order: LnNO2A+ > LnONO2A+ > LnPhNO2A+.
Also, we study the kinetics of BNPP hydrolysis by LnONO2A+,
where Ln = Eu3+, Yb3+. By fitting the rate data to a monomer-dimer
誌謝
剛進入張正老師實驗室的時候，對於這個領域完全陌生，很幸運的在 這裡有一起學習、教導我的學長姐、學弟妹們。因為這裡的人事物，讓我 有一個值得回憶的碩士生活。 今天能夠畢業，完成我的研究，要感謝張正老師的指導、實驗上的建 議、生活上的關心。還有張家靖老師的寒喧、關心。以及諸位口試委員的 寶貴意見、指導。 我也要感謝一路支持跟陪伴我的翊帆，因為他，我的生活充滿意義！ 此外，政憲、志祥、郁頻、業琳、玉淳、健葒、岳輝、明慧、萬利、 秉博等等，在我的研究生活裡，幫助我跟我一起討論、一起努力、一起娛 樂的朋友，我也都要感謝。 最後，我要感謝我的家人以及十多年情誼的老朋友們，謝謝你們一直 給我信心，讓我完成學業，希望你們一起分享我的喜悅！目錄
頁次 中文摘要 ……… i 英文摘要 ……… ii 誌謝 ……… iii 目錄 ……… iv 第一章 緒論 ……… 1 前 言 …… …… …… ……… …… …… …… ……… …… …… …… …… 1 文獻回顧 ……… 7 研究目的 ……… 18 第二章 配位子 ONO2A 的合成 ……… 19 1,5-bis(p-toluenesulfonato)-3-oxapentane 之合成 ……… 19 N,N’-bis(p-toluenesulfonyl)ethane-1,2-diamine 之合成 ……… 20 1-oxa-4,7-bis(p-toluenesulfonyl)-4,7-diazacyclonane 之合成 ………… 21 1-oxa-4,7-diazacyclonane〃2HBr 之合成 ……… 24 1-oxa-4,7-diazacyclononane-4,7-diacetic acid〃2HBr 之合成 ………… 26 第三章 配位子 ONO2A 質子化常數之研究 ……… 31 配位子 ONO2A 溶液之配製 ……… 31 配位子 ONO2A 溶液濃度之標定 ……… 32 配位子質子化常數之滴定原理 ……… 36 配位子 ONO2A 之質子化常數 ……… 39 ONO2A 質子化常數之計算結果 ……… 39金屬陽離子濃度之標定方法 ……… 44 金屬陽離子濃度之標定原理 ……… 46 金屬陽離子濃度之標定步驟 ……… 48 配製溶液 ……… 48 標定濃度 ……… 51 配位子 ONO2A 與鑭系金屬之穩定常數 ……… 52 實驗方法 ……… 52 實驗結果 ……… 53 第五章 配位子 ONO2A 與鑭系金屬錯合物之動力學研究……… 58 反應動力學之實驗原理 ……… 58 LnONO2A+反應動力學之實驗方法 ……… 60 溶液的配製 ……… 60 動力學實驗步驟 ……… 62 LnONO2A+動力學實驗結果 ……… 64 CeONO2A+不同 pH 值下監測吸收光譜 ……… 64 CeONO2A+不同 pH 值下監測 281 nm 吸收光譜 ……… 65 CeONO2A+ pH 9.8 監測 281 nm 吸收光譜（濃度效應） ……… 67 EuONO2A+不同 pH 值下水解 BNPP 動力實驗 ……… 69 EuONO2A+pH 9.0 水解 BNPP 濃度效應 ……… 71 EuONO2A+不同 pH 值雷射光譜實驗 ……… 75 YbONO2A+不同 pH 值下水解 BNPP 動力實驗 ……… 76 YbONO2A+pH 8.5 水解 BNPP 級數動力實驗 ……… 78 YbONO2A+pH 8.5 水解 BNPP 濃度效應 ……… 79 第六章 討論與未來展望 ……… 81 參考文獻 ……… 83 附錄 ……… 86
第一章 緒論
※ 前言
在生命系統中每一個生化反應都牽扯到酵素（enzyme；酶）的催化， 因此生命的延續跟酵素反應息息相關。酵素主要成分是蛋白質（protein）， 蛋白質的來源又是由 DNA（deoxyribonucleic acid）上面的基因密碼 （genetic code）轉錄成 mRNA（messenger ribonucleic acid），再轉譯 成蛋白質。上述的所有生物聚合體（biopolymers）的穩定與否，就非常重 要。一般而言，在中性 pH 值、25℃的環境之下，水解 DNA 之磷酸雙酯 鍵（phospodiester bond）的半生期可以達 13 萬年之久，RNA 的磷酸雙 酯鍵水解半生期則為 4 年左右，蛋白質的胜肽鍵（peptide bond）水解半 生期則約為 7 年。然而，一旦 DNA 發生突變（mutation）需要修補（repair）， 或是蛋白質功能不再，需要被分解，在生理條件的時間尺度，這些生物聚 合體的分解就需要被催化，此時就需要水解酶（hydrolase）來促進 DNA、
RNA 或蛋白質的分解1，人造核酸水解酶（artificial nuclease/ribonuclease）
就是想針對目標生物聚合體的分解而被設計產生。
天然的限制酶（nature restriction nuclease）有一些先天上的限制， 包括分離純化不易且成本高、認知的序列辨識區常只有 4-6 個鹼基，核醣 核酸長鏈會被切割成很多小片段，造成辨識度不足，在各式病毒性及癌症
重在 RNA 的水解機構。因為 RNA 其五碳糖的第二位置上有一氫氧基 （2’-OH），這個氫氧基在反應機制中被認為扮演極重要的角色；目前被廣 泛接受水解 RNA 的反應機制包括兩個步驟，轉酯反應（transesterification） 和水解反應。在第一個步驟的轉酯反應中，RNA 上五碳糖的 2’-OH 會先 解離脫掉氫質子 （deprotonation），並形成強親核基（nucleophile）alkoxide， 之後 alkoxide 會攻擊五碳糖 3’端磷酸酯鍵之磷原子，形成 2’,3’-cyclic phosphate；在第二個步驟的水解反應中，2’,3’-cyclic phosphate 會水解 為2’-phosphate 及 3’-phosphate，至此完成整個水解反應。然在轉酯反應
中，可能會形成一個雙三角椎（trigonal bipyrimide）之過渡態3，RNA 水
解機構如（圖 1-1.）。
【圖 1-1.】 RNA alkaline cleavage 水解步驟3
RNA 因為有其結構上的優勢，形成 alkaline instability3，水解的速率
很快。相對的 DNA 的五碳糖的2’-H，使得 DNA 的水解過程中所需要的親
核基就必頇由外界提供；此外，外來的親核基帶負電，而磷酸酯鍵也帶負 電，同性相斥的結果，會使得 DNA 水解反應更不容易進行，也因此 DNA 在自然界可以穩定存在萬年以上。
DNA 的酵素水解通常是依照下列兩步驟，如（圖 1-2.）所示：
（1）藉由外來的親核基攻擊在磷原子上，例如：外來的 OH- ，形成五配
位的中間物（pentacoordinated intermediate）。
（2）移除2’-deoxyribonucleotide 位置上的 5’-OH ，且 P-O 鍵斷裂。此
步驟是反應的速率決定步驟。而在非酵素水解反應中，在3’端 P-O 鍵的分
裂也會發生4。
【圖 1-2.】 DNA 水解的反應步驟4
天然的核酸酶和限制酶是非常具有專一性，但是卻有鍵結過強的缺點，
加上 DNA 水解不易，RNA 水解速率是比 DNA 快 105～106倍。因此除了
參考 RNA 水解的反應特性外，觀察自然界中的水解 DNA 酵素也是一項很 好 的 選 擇 。 最 有 名 的 兩 個 例 子 ： alkaline phosphatase 、 purple acid
phosphatase。以 E. coli. alkaline phosphatase 為例（圖 1-3.），其是有兩
個 Zn2+金屬中心的雙核酵素，兩個 Zn2+金屬彼此相距約 3.9Å ，可不專一
【圖 1-3.】 Escherichia coli alkaline phosphatase 催化磷酸酯鍵的過程1
由此可知水解 DNA 或 RNA 的磷酸雙酯鍵如果有金屬離子的加入，就 會更有效率，實際上生物體的酵素的確都需要金屬離子才能發揮其功用。
金屬離子在催化水解磷酸雙酯鍵反應的角色主要是5（如圖 1-5.）：
（a）和水配位後並解離形成金屬氫氧根離子（ metal-bound hydroxy
anion），金屬氫氧根離子當作是一個路易士鹼（Lewis base）來拔除 2’-OH
上的氫，使其成為2’-O-強親核基，攻擊五碳糖3’端磷酸酯鍵之磷原子；
（b）配位在 2’-OH 的氧原子上，吸引氧原子上電子雲，使 2’-OH 的氫更
容易解離，以形成2’-O
-親核基（metal stabilized oxyanion）；
（c）轉酯過程中所形成的五配位中間物或過渡態，會由於金屬靜電相吸 而提供其穩定性； （d）配位在離去基（leaving group）上，穩定離去基，使反應朝向水解 方向進行。 【圖 1-5.】 金屬催化轉酯或水解的可能機制5 在親核基攻擊的反應部分，可用來幫助加速水解反應的金屬離子包括
Mg2+、Ca2+、Fe3+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Ln3+（鑭系金屬離子）、UO2+
水解反應速率會隨著鑭系金屬的原子序增加而遞增，Tm3+、Yb3+和 Lu3+ 等離子是較有效率的；Ce4+被認知是最有效率的 DNA 水解促進劑4。 雖然鑭系金屬離子在水溶液下是很有效率的 DNA 切割試劑，但其在 高 pH 值的水溶液下會產生沈澱8，且會對生物體產生毒性；因此設計出一 種錯合物是可保有鑭系金屬的水解切割能力，且不具有生物毒性及安全性， 是科學家努力的方向。為設計出對鑭系金屬有較高親和力的配位子，我們
參照 MRI（magnetic resonance imaging） 核磁共振造影試劑的設計 9，
發現大環配位子遠比線性配位子對鑭系金屬所形成的錯合物較穩定，更發 現到當配位子中在氮原子上有 carboxymethyl group (乙酸基) 的鍵結，可 提供一個帶中性或正電的錯合物之設計方法。 【圖 1-6.】 目前 FDA 通過的 MRI 試劑9 目前有不少團隊致力於人造磷酸水解酶的研究，也都有重要的發 現，循著這些研究我們可以更了解不同切割劑的特性與應用。
※ 文獻回顧
◎Breslow et al.
從 alkaline phosphatase 發現到金屬 Zn2+有催化的功能，1986 年，
Breslow 團隊就設計含氮大環，錯合 Zn2+，切割 DPPNPP（diphenyl
p-nitrophenyl phosphate），在 pH 8.7 的 CH3CN（aq）下，催化的活性物質
zinc hydroxide complex 會產生，水解效率提高10。其團隊早期主要的三
個大環（圖 1-7.），衍生物 1、2 在相同的實驗條件下，反應速率可以比沒 有官能基的 3 快 9 或 20 倍以上。顯示這些輔助官能基具有一般鹼基的功 能，可促進催化反應，稱為雙官能基催化（bifunctional catalysis）（圖 1-8.） 11 。 【圖 1-7.】 Breslow 團隊研究的含氮大環衍生物12 【圖 1-8.】 酵素與金屬的雙官能基催化11 Zn2+ B Zn2+ B O -X O H
◎Hendry and Sargeson
1986～1990，Hendry and Sargeson 發表以 Co3+及 Ir3+與四元的單體
錯合的催化金屬，發現 Ir3+比 Co3+體積來得大，反應過程環的包覆性
（closure）會較差，因此催化速率比 Co3+的錯合物慢。但是環的開闔與
否，並不是那麼重要，在生物體酵素催化反而傾向開放性的結構，且生物
中常用來催化的金屬 Mg2+、Zn2+都是比 Ir3+還大的金屬。所以此團隊提出
來的催化機制比較不符合生物體的酵素催化機制13。
◎Krämer
1996 年，Krämer 團隊以雙官能基催化反應機構為基礎設計配位子（圖
1-10.）12, 14。其結構是由兩個吡啶環（bpy）構成，並在吡啶環 2 的位置
上接上烷基胺（alkylamine）作為胺基酸的類比物。兩種配位子，一個胺
基上接有氫，另一個則以甲基取代。兩者均配位上 Cu2+形成 L1Cu、L3Cu。
L1Cu、L3Cu 水解 BNPP（bis(p-nitrophenyl) phosphate）的結果，L1Cu
的水解速率比 L3Cu 快上 1000 倍，而(bpy)Cu 則和 L3Cu 的速率相當。這
主要的原因可能是 BNPP 的磷酸雙酯鍵與 L1Cu 金屬配位並以氫鍵與一個
胺基酸連結，這樣電荷穩定的狀態下受質在合適的方位被 Cu-OH-的親核
基攻擊（圖 1-10.）12。
◎Burstyn et al. 從 1993 年起，Burstyn 提出（Cu[9]aneN3Cl2）以三氮九元環的配位 子與 Cu2+錯合，水解 BNPP，並以 HPLC 分析水解後的產物為 p-nitrophenyl phosphate 及 p-nitrophenolate15。水解後的動力學發現，催化級數只有 0.5， 金屬的配位水在 pH 7.3 始解離，水解反應上升。Burstyn 認為水解反應過 程單體形成雙體（圖 1-11.）的平衡常數 Kf=1220 M-1，因此具有活性的單 體比例下降，反應級數下降16。 【圖 1-11.】 Burstyn Cu[9]aneN3Cl2水解 BNPP 反應平衡式16 Burstyn 等又陸續合成 Cu[9-11]aneN3X2，水解 BNPP 實驗結果，環 穴越大，水解速率就會增加，從九元環到十一元環速率常數增加了 8 倍， 並發現雙體形成常數 Kf隨之下降（表 1-1.）。而在分析金屬錯合物結晶圖， 環穴越大，金屬離子就越深入環穴中心，N-Cu-N 的鍵角就越大，相對 Cu 的兩個配位水鍵角會減小，大環錯合物在水溶液中形成雙體的立體阻礙變 大，單體的比例升高，水解反應自然增快17。
【表 1-1.】 Burstyn Cu[9-11]aneN3Cl2水解 BNPP 之常數17
為了增加大環的立體障礙，Burstyn 在其九元環的氮上加上三個異丙
基（圖 1-12.）18，Cu(i-Pr3[9]aneN3)2+環穴中心金屬鍵角更大，雙體的形
成常數更小，反應速率也更快，可達九元環的 60 倍以上（表 1-2.）。
【圖 1-12.】 Burstyn Cu[9]aneN3Cl2及 Cu(i-Pr3[9]aneN3)2+圖示18
◎Morrow et al. 天然的酵素 多半有 兩個以上的 金屬參 與催化反應 ，例如 alkaline phosphate。因此除了單核金屬錯合物，多核金屬錯合也被重視，1998 年 Morrow 就以此為概念，採用了 Burstyn 發展的三氮九元環來做雙體的研 究，利用苯環橋接了兩個三氮九元環，合成了兩種雙體配位子19（圖 1-13.）。 滴定得知雙體在 pH 7.3 時主要活性物種為（Cu2L(OH)22+），因此在 pH 7.3 條件下水解 GpppG 得到的假一次速率常數 20，兩種雙體的速率都是單體 的 100 倍左右。Morrow觀察到隨著 L3雙體濃度上升，反應速率剛開始是 二次趨勢，而高濃度處則有飽和的現象。所以他推測 L3雙體與 GpppG 反 應有 2:1 與 1:1 的反應機制（圖 1-14.），而套入到此模型計算出 L3 2:1 組 合的假一次速率常數為 L3 1:1 組合的 20 倍。而 L2雙體則只有 2:1 的反應 組成，假一次速率常數為 4.3 × 10-5 s-1。 【圖 1-13.】 Morrow 合成的兩種雙體，m-xylene、p-xylene19 【圖 1-14.】 Morrow 雙體反應模型
2003 年 Morrow21, 25將兩個三氮九元環使用 1, 3-dibromo-2-propanol 連接合成新的雙核配位子 Zn2(L2O) （圖 1-15.）。滴定實驗結果，相關設 計的雙體配位子與兩當量的 Zn2+都有極佳的錯合效果。而動力學實驗從水 解 HPNP （ 2-hydroxypropyl-4-nitrophenyl phosphate ） 的 結 果 顯 示 ， Zn2(L2O) 的 二 級 反 應 常 數 是 Zn[9]aneN3 的 120 倍 。 這 結 果 支 持 了 Zn2(L2O) 的兩個金屬離子可藉由協同作用來穩定 HPNP 的中間過渡態的 假設，大幅增加了水解速率（圖 1-15.）。 【圖 1-15.】 2003 Morrow 提出的 Zn2(L2O)，水解 HPNP 可能的過渡態21 除了專注在雙核水解反應之外，Morrow 在早期就曾經研究過過渡金屬、 鑭系金屬與六配位的配位子水解 RNA，結果發現鑭系金屬錯合物（圖 1-16.） 具有非常高的熱力學穩定性 22。此外，Morrow 團隊還發表了單純使用鑭 系金屬離子來進行 RNA 的轉酯催化反應，反應性亦比過渡金屬離子快很 多，推測是因為鑭系金屬具有更高的路易士酸的特性23, 26。
陸續，Morrow 發表許多配位子與鑭系金屬的活性或動力學研究。1996 年 24，八配位的 TCMC 以及七配位的 NBAC（圖 1-17.）。以 TCMC 與十 配位的 La3+錯合後，具有水解 RNA 結構的效果，而與九配位的 Eu3+錯合 後就失去了活性。另外將 NBAC 與 Eu3+錯合，則具有水解效果。所以推 測，金屬錯合物必頇具有兩個配位水，才能發揮催化水解反應的效果。接 著發表其他以 Cyclen 為基礎的鑭系金屬大環配位子（圖 1-17.）。藉由改 變氮原子上所接的官能基，希望能展現更優秀的水解效果，而其中 THED 水解 mRNA 的 5’Cap 結構有顯著效率26 。
◎Gunnlaugsson et al. 2005 年Gunnlaugsson 團隊發表以 Cyclen 為基礎的 La3+及 Eu3+大環 錯合物27，進行水解 HPNP 的實驗，觀察到 La3+錯合物的催化速率會隨著 pH 值上升，在 pH 8.5 後則下降。但是 Eu3+的錯合物並沒有此現象。推測 應該是 La3+有兩個配位水，比 Eu3+多了一個配位水，造成 pH 上升後兩個 配位水皆解離而失去反應活性，因此 La3+的錯合物水解 HPNP 會隨 pH 值 改變，而 Eu3+錯合物的水解反應則無關 pH 值（圖 1-18.）。 【圖 1-18.】 Gunnlaugsson 水解 HPNP 速率常數與 pH 值的關係，實心圓為 Eu complex27
◎Chang et al.（our lab） 而我們實驗室近年來主要以三氮九元環以及四氮十二元環的衍生物 並配合鑭系金屬來進行人工水解酶的研究。利用加上乙酸基的大環配位子， 與鑭系金屬錯合後，金屬錯合物就會為電中性或帶正電，負電性的磷酸酯 鍵就會與之結合反應。實驗室研究的大環，我們都有特定的簡稱，各簡稱 的大環結構請見附錄（1.）。 近年我們對於DO2A（1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,7-bis(acetic acid)）為主的大環錯合物之動力學研究已有相當的了解，在前人的研究中， 觀察到DO2A是一個具有熱力學穩定性以及動力學惰性（Kinetically inert） 的錯合物28，與鑭系金屬的錯合穩定常數皆很高（LogK > 13），是非常好 的金屬錯合物。而本實驗室已經研究了不同鑭系金屬與DO2A錯合後的水 解效率，實驗發現以EuDO2A+有最優秀的催化能力2。而與EuK21DA+ （K21DA：1,7-diaza-4,10,13-trioxacyclopentadecane-N,N’-diacetic acid）、
EuEDDA+（EDDA：ethylenediamine-N,N’-diacetic acid）（圖1-19.）錯合
物水解BNPP能力做比較，觀察到配位水越多水解效果越好。
【圖 1-19.】 Eu3+
與不同配位子之配位關係與配位水數量2
接著選擇 NO2A（1,4,7-triazacyclododecane-1,4-bis(acetic acid)） 以減少配位數為目標進行研究，希望能保持金屬錯合物的穩定常數並且增
加配位水數量，以達到更好的水解效果。另外為了防止多體錯合物的生成， 我們也加入了具有立體張力的取代基來抑制多體的產生，但是因為取代基 限制太多，反而錯合鑭系金屬的穩定常數很低。得到的結果是，NO2A 的 確容易形成雙體。在水解 BNPP 的動力學實驗中，YbNO2A+級數小於 1， 而 EuNO2A+級數則大於 1。這也許是 Eu3+在產生不具有活性雙體前，會 有比單體更具有活性的雙體結構產生29。 【圖 1-20.】 NO2A（1,4,7-triazacyclododecane-1,4-bis(acetic acid)） N N O O HO OH H N
※ 研究目的
在大環配位子的研究中，除了常用的氮原子做為供電子基（donor） 以外，也有人研究用氧原子替換氮原子的大環配位子，發現對於金屬離子 的選擇性增強，也就是比起替換前的大環配位子對於不同的金屬離子穩定 常數增加或減少，而大環錯合物的構型也會有所改變30, 31, 32。 因此，決定將以前研究的三氮九元環 NO2A 其中一個氮以氧取代，合 成新的配位子 ONO2A（1-oxa-4,7-diazacyclononane-4,7-diacetic acid）。 ◎研究 ONO2A 的熱力學以及與鑭系金屬錯合之配位化學。 ◎研究 LnONO2A+水解 BNPP 的動力學。 ◎比較 ONO2A 與 NO2A 的水解效力。第二章 配位子 ONO2A 的合成
※ 1,5-bis(p-toluenesulfonato)-3-oxapentane 之合成
＊ 合成圖：
＊ 實驗方法：
1. 取 100 ml 的 triethylamine 及 0.10mole 的 bis(2-hydroxyethyl)ether（約
10.61 g），一起加入 500ml 的圓底燒瓶中，冰浴攪拌子攪拌拔氫。
2. 另外，取 0.20 mole（約 38.13 g）的 p-toluenesulfonyl chloride， 將 之 溶 於 200 ml 的 乙 醚 ， 置 入 等 壓 分 液 漏 斗 ， 再 逐 滴 加 入 bis(2-hydroxyethyl)ether 溶液中，持續攪拌反應，約在 3～4 小時內加 入完成。接著再將所有的反應物以電動攪拌子強力攪拌 10 小時。 3. 攪拌完的產物為白色的乳狀物，經減壓過濾可以得到白色的粉末固體， 以大量的二次水及酒精沖洗 2～3 次。 4. 完成後產物加入有 450 ml 的熱酒精燒杯中加熱，持續攪拌到完全溶解 後，蓋上保鮮膜，靜置冷卻、冷藏。12 小時後，得白色細針狀結晶， 為 1,5-bis(p-toluenesulfonato)-3-oxapentane。 HO O OH + H3C S O O Cl OTs O OTs
※
N,N’-bis(p-toluenesulfonyl)ethane-1,2-diamine 之合成
＊ 合成圖：
＊ 實驗方法：
1. 取 80 ml 的二次水及 0.30 mole 的 NaOH（約 40.00 g），一起加入 500
ml 的圓底燒瓶中，攪拌溶解，再加入 0.10 mole 的 ethylene diamine （約 6.01 g），持續冰浴攪拌拔氫。
2. 取 0.20 mole（約 38.13 g）的 p-toluenesulfonyl chloride， 將之溶於 200 ml 的乙醚，置入等壓分液漏斗，再逐滴加入上述的 ethylene diamine 溶液，持續攪拌反應，約在 3～4 小時內加入完成。接著再將 所有的反應物裝置電動攪拌子強力攪拌 10 小時。 3. 攪拌完的產物為白色的霜狀物，經減壓過濾可以得到白色的粉末固體， 以大量的二次水及酒精沖洗 2～3 次。 4. 完成後產物加入有 450 ml 的熱酒精燒杯中加熱，持續攪拌到完全溶解， 蓋上保鮮膜，靜置冷卻、冷藏。12 小時後，得白色長片針狀結晶。 6. 減壓過濾結晶，為 N,N’-bis(p-toluenesulfonyl)ethane-1,2-diamine， 真空乾燥後，稱重保存。 產率：88％ 熔點：160 ℃～163 ℃ H2N NH2 + H3C S O O Cl NHTs TsHN
※ 1-oxa-4,7-bis(p-toluenesulfonyl)-4,7-diazacyclonane 之合成
根據 Macrocycle Synthesis - A Practical Approach（David Parcker,
Oxford University Press,1996）33內容所提供的方法。
＊ 合成圖： ＊ 材料： Dimethylformamide（DMF） 100 ml Dicloromethane（CH2Cl2） 300 ml Toluene 100 ml Hexane 50 ml Diethyl ether 50 ml K2CO3、MgSO4 Cs2CO3 8.26 g（25.4 mmole） 1,5-bis(p-toluenesulfonato)-3-oxapentane 5.00 g（12.1 mmole） N,N’-bis(p-toluenesulfonyl)ethane-1,2-diamine 4.44 g（12.1 mmole） NHTs TsHN OTs O OTs DMF Cs2CO3 TsN NTs O + + NTs O TsN TsN O NTs 1,5-bis(p-toluenesulfonato)-3-oxapentane N,N'-bis(p-toluenesulfonyl)ethane-1,2-diamine 1-oxa-4,7-bis(p-toluenesulfonyl)-4,7-diazacyclonane 1,10-dioxa-4,7,13,16-tetra(p-toluenesulfonyl)-4,7,13,16-tetraazacyclooctadecane
＊ 實驗方法： 1. 取 5.00 g 的 1,5-bis(p-toluenesulfonato)-3-oxapentane 加入 50 ml DMF 於 250 ml 圓底瓶中，再加入 8.26 g 的 Cs2CO3，溶液呈白色， 攪拌反應。 2. 取 4.44 g 的N,N’-bis(p-toluenesulfonyl)ethane-1,2-diamine，溶於 50 ml DMF 中 ， 溶 液 呈 透 明 狀 ， 再 倒 入 等 壓 分 液 漏 斗 ， 緩 緩 滴 入 1,5-bis(p-toluenesulfonato)-3-oxapentane 溶液中，約歷時 3-4 個小時， 期間不斷攪拌混合。 3. 混合好的反應物在室溫下，攪拌反應 19 個小時。再加熱到 60 ℃，反 應 2 個小時。 4. 以減壓濃縮儀（水浴 75 ℃，壓力 1.0 mmHg）抽乾 DMF 溶劑。得到 白色偏黃的產物。將產物溶在 100 ml 的二次水，會有一些無法溶解的 懸浮物，再加入 100 ml 的 CH2Cl2（可以 CHCl3取代）萃取，此時所 有未溶的懸浮物都溶解。以分液漏斗分離有機層，約反覆萃取 3 次。 5. 萃取液中加入 2.00 g 的 MgSO4，乾燥有機層，約半個小時。 6. 過濾掉 MgSO4，將濾液以減壓濃縮儀抽乾，得淡黃色固體。 7. 將所得的淡黃色固體加入 100 ml 的 toluene，置於燒杯中加熱，所有 的溶液呈黃色澄清，加熱過程中有部份無法溶解的白色粉末，將之濾 出，應該是 18-ring 的 1,10-dioxa-4,7,13,16-tetra(p-toluenesulfonyl)- 4,7,13,16-tetraazacyclooctadecane，對整個反應而言，這是附產物。 8. 濾液則再持續加熱，讓 toluene 的量減少，約剩下 40 ml。
9. 溶液靜置於室溫下，約 1 小時就有結晶出現。冷藏溶液 10 小時後， 濾得產物，為 1-oxa-4,7-bis(p-toluenesulfonyl)-4,7-diazacyclonane。 10. 真空乾燥後，稱重保存。 產率：60％ 熔點：196 ℃～198 ℃ ＊ 討論： 1. 這個合環的步驟，曾經多次試過要用實驗室常用的 NaH 拔氫，但是結 果都未成功，沒有大環生成或是僅有及少量的產物。以 Cs2CO3為反 應劑，則合環的效力提高很多，且步驟簡單，唯所需的實驗成本較高。 2. 整個反應的過程中，會有另一個 18-ring 的產物，會減低所要的 1-oxa-4,7-bis(p-toluenesulfonyl)-4,7-diazacyclonane 的產率，但是， 可以由調整反應時間來降低這個損失，尤其是加熱反應的這個步驟， 時間越長，產生的 18-ring 大環比例會越高。
※ 1-oxa-4,7-diazacyclonane〃2HBr 之合成
根據 J. Chem Research (M)，1985，3501-350934的實驗方法。 ＊ 合成圖： ＊ 材料： 1-oxa-4,7-bis(p-toluenesulfonyl)-4,7-diazacyclonane 8.77 g（0.02 mol） Phenol 9.42 g（0.1 mol） HBr / Acetate 33％ 58.2 ml Ether 300 ml Acetone Methanol ＊ 實驗方法： 1. 將 8.77 g 的 1-oxa-4,7-bis(p-toluenesulfonyl)-4,7-diazacyclonane、 9.42 g 的 phenol、58.2 ml 的 HBr / Acetate 33％一起加到 250 ml 的 圓底瓶中，油浴 100 ℃，架設冷卻迴流裝置，迴流管上方出口以玻璃 棉塞住，減低酸蒸氣揮發量，反應 48 小時。整個反應物呈現酒紅色。 2. 反應結果產物為暗紅色，將產物到入 250 ml 的燒杯中，0 ℃冰浴冷卻， 並加入 350 ml 的冰乙醚，攪拌子攪拌 30 分鐘，開始有暗紅色的黏稠 固體附在瓶壁上。 TsN NTs O HBr/Acetate 100℃, 48hr HN NH O 2HBr 1-oxa-4,7-bis(p-toluenesulfonyl)-4,7-diazacyclonane 1-oxa-4,7-diazacyclonane．2HBr3. 倒掉乙醚，再以乾淨的乙醚清洗產物，最後再以丙酮清洗一次。 4. 加入 80 ml 的二次水，此時產物全溶解於水中，呈粉紅色液體，再加 入少量活性碳脫色。 5. 過濾掉活性碳，得黃色的液體，以減壓濃縮儀將之抽乾，得紅褐色的 黏稠物。 6. 將所得的紅褐色黏稠產物加入 50 ml 的熱甲醇，再加入等量的乙醚， 此時溶液會呈白霧狀，靜置冷卻，移至冰箱中 10 小時，再結晶。過 濾得產物。 7. 真空乾燥後，稱重保存。 產率：68％ 熔點：200 ℃～202 ℃ ＊ 討論： Phenol 及 HBr / Acetate 的揮發性極強，必頇在抽風櫥操作。原本會 將冷卻迴流裝置再接管子到 NaOH 水溶液中，以消除過多的酸蒸氣， 然一旦反應圓底瓶內的壓力不足，會造成 NaOH 倒抽入圓底瓶內，嚴 重影響實驗，經過多次調整都會有這種狀況。因此，仍以塞玻璃棉在 迴流管上方出口為佳。
※ 1-oxa-4,7-diazacyclononane-4,7-diacetic acid〃2HBr 之合成
根據 J. Chem Research (M)，1985，3501-350934的實驗方法。 ＊ 合成圖： HN NH O Ba(OH)2(aq) Bromoacetic acid N N O O O OH OH 2HBr HN NH ONaOH(aq)/Ether
1.1-oxa-4,7-diazacyclonane．2HBr 1-oxa-4,7-diazacyclonane 1-oxa-4,7-diazacyclononane-4,7-diacetic acid HBr N N O O O OH OH 2HBr 1-oxa-4,7-diazacyclononane-4,7-diacetic acid．2HBr
＊ 材料： 1-oxa-4,7-diazacyclonane〃2HBr 2.92 g（0.010 mole） NaOH 1.60 g（0.040 mole） Ether 100 ml Ba(OH)2〃8H2O 13.32 g（0.030 mole） Bromoacetic acid 4.17 g H2SO4 12 ml（2.5 M） Acetone 30 ml Bromic acid Ethanol ＊ 實驗方法： 1. 1-oxa-4,7-diazacyclonane〃2HBr 取 2.92 g，溶於 3 ml 的二次水，呈 白色混濁，加入 1.60 g 的 NaOH 攪拌溶解，溶液變成淡粉紅色透明， 倒入分液漏斗中。 2. 以 20 ml 的乙醚加入分液漏斗中萃取，取有機層，共 5 次。水層有白 色的顆粒混雜。 3. 將 乙 醚 萃 取 液 以 減 壓 濃 縮 儀 抽 乾 ， 得 透 明 略 黃 的 稠 狀 物 ， 為 1-oxa-4,7-diazacyclonane。 4. 1-oxa-4,7-diazacyclonane 溶於 10 ml 二次水中置於單頸圓底瓶，加 入 13.32 g 的 Ba(OH)2〃8H2O，瓶口塞橡膠塞， 0 ℃冰浴攪拌。
Principle，冰浴得以使 9-ring 上-NH 的 H 被移除的放熱反應持續進行， 以利接上-CH2COOH。 6. 加完 bromoacetic acid 後，再將單頸瓶口以氮氣球封住，於室溫下反 應 48 小時，原本的反應溶液呈白色粉狀液體，過了一天後，呈現淡 黃色的透明液狀。 7. 反應結束後，加入 12 ml 的 2.5M H2SO4，立即有白色粉末出現，將所 有反應物加熱沸騰後，靜置冷卻，會有 BaSO4的白色沉澱。 8. 以玻璃濾膜漏斗，先加入一層活性碳粉，以二次水讓粉體聚結，再緩 緩倒入圓底瓶內的液體，盡量將圓底瓶的殘留物以二次水沖出。靜置， 等白色 BaSO4粉狀物在玻璃漏斗中大部份沉澱後，再進行減壓過濾。 過濾後得澄清的濾液。 9. 以減壓濃縮儀抽乾濾液，得 1-oxa-4,7-diazacyclononane-4,7-diacetic acid 之紅褐色的膏狀物。 10. 將紅褐色的 1-oxa-4,7-diazacyclononane-4,7-diacetic acid 膏狀產物 加入 30 ml 的丙酮，攪拌 30 分鐘，會成灰白色粉狀固體。過濾掉丙酮， 再以乾淨丙酮沖洗，最後將固體風乾或抽乾。 11. 將所得的粉狀固體加入適量的 3.0 N HBr 溶解，再加入等量的熱酒精， 溶液呈橘紅色，靜置冷卻後置入冰箱中一天，再結晶。 12. 過濾再結晶固體，並以 95％的酒精清洗。 13. 以減壓濃縮儀將結晶乾燥，得到白色固體，即為我們所需的產物— 1-oxa-4,7-diazacyclononane-4,7-diacetic acid〃2HBr，稱重保存。 產率：66％ 熔點：195 ℃～196 ℃
EA：Anal. Calcd for C10H18N2O5‧2HBr‧0.75H2O： N％，6.65；C％，28.49；H％，5.14 Found：N％，6.94；C％，28.49；H％，5.29（附錄（6.）） MS（ESI+）：M/Z 247.2（M+H）+（附錄（5.）） NMR（D2O，500M HZ）：（附錄（2.）、（3.）、（4.）） 1 H：δ 3.292，δ 3.302，δ 3.312（triplet）；δ 3.446（single）；δ 3.793，
δ 3.803，δ 3.813（triplet）；δ 3.942（single）；δ 4.870（single）
13C：δ 50.672，δ 53.222，δ 55.726，δ 64.733，δ 170.000 ＊ 討論： 1. Ba(OH)2 溶水性低，加入反應物水溶液中，會呈糊狀，因此不易反應 完全。反應完後如果要去除多餘的 Ba(OH)2，可用過濾的方式，但是 這樣產物也可能一起被濾掉，解決方法是加入過量的 H2SO4。H2SO4 可以中和未反應的 Ba(OH)2，且因為 9-ring 本身也可能跟 Ba2+錯合， 加入過量的 H2SO4，也可以將 Ba 2+ 逼出。 2. BaSO4的粉體很細，可能不容易濾掉，經多次試驗，都會隨著濾液流 出，因此在玻璃膜漏斗鋪上活性碳粉，發現比較可以阻檔 BaSO4粉末 濾出。此外，過濾過程中濾液也可以被脫色。 3. 以 HBr 再結晶的過程，是最容易失敗的，如果加入過濃的 HBr，產物 不易溶解；加入太多太稀的 HBr，產率及結晶的結果都會變差。經驗 上，大約是加到剛好可以溶解產物的 HBr，再加入等量的熱酒精一起
水溶性及有機的雜質去除，因此用 95％的酒精清洗。再結晶後的濾液， 可以抽乾收集，多批的濾液，可以再結晶出產物。 5. ONO2A 的 NMR 圖譜分析，及產物送測交大貴重儀器中心的 NMR-2D 結果，分析各峰值的對應 ONO2A 的結構如下30。其餘請見附錄（2.）、 （3.）、（4.）。 【圖 2-1.】ONO2A 2D NMR 相對應的元素位置 N N O O O OH OH 1 3 5 4 2
第三章 配位子 ONO2A 質子化常數之研究
※ 配位子 ONO2A 溶液之配製
根據送測元素分析儀 Heraeus CHN-O Rapid 的結果（見附錄（6.））， N％，6.94；C％，28.49；H％，5.29。加上合成 ONO2A 鹽類的過程， 得合理推測合成後 ONO2A 鹽酸應該有 HBr 及結晶水。經過多種的可能組
合推算，鹽類應為 ONO2A‧2HBr‧0.75H2O，計算得分子量為 421.58。
稱取 0.4216 g 的 ONO2A‧2HBr‧0.75H2O (s)，溶於少量二次水，加
入定量瓶中，補二次水達 20 ml，為 50.0 mM 的 ONO2A(aq)母液。再取 4 ml
※ 配位子 ONO2A 溶液濃度之標定
配好的配位子 ONO2A(aq)為求精準，需以標準程序標定濃度。
＊ 標定方法：
1. 配製一級標準酸 KHP（potassium hydrogen phthalate）溶液：
取多量的 KHP(s)，置於 70 ℃烘箱中 3 小時，乾燥。稱取 2.042 g 之
KHP(s)，以二次水溶解，加入 100 ml 定量瓶，配成 0.10 M 的 KHP(aq)
標準液。
2. 配製 TMAOH（tetramethylammonium hydroxide，(CH3)4NOH）溶液：
取 22.73 ml 的 TMAOH(aq)（～1.1 M）母液，加入 50 ml 的定量瓶， 以二次水稀釋，得約 0.50 M 的 TMAOH(aq)，為滴定用之鹼液。 配好的鹼液裝置到 702 SM Titrino，Metrohm 中，鹼液瓶的蓋子除了 流通的管線外，還要再接上一瓶的鹼石灰（eg., Sodalime，Merck）， 以除去空氣中過多的水氣及二氧化碳，維持鹼液的濃度。另外，滴定 槽接循環水流，控制溫度在 25±0.1 ℃。 滴定槽內加入 0.50 ml 的 KHP(aq)標準液，在補二次水達 5.0 ml，攪拌
子攪拌平衡，以 Metrodata TiNet 2.4，Metrohm 軟體為滴定計量。
TMAOH(aq)與 KHP(aq)之滴定為一般的酸鹼平衡，設定值為 V step：
0.004 ml；signal drift：5 mv/min；equilibrium time：100 s。由 0.50 ml
的 0.10 M KHP(aq)所需的 TMAOH(aq)體積計算標定 TMAOH(aq)的濃
3. 配製 TMACl（tetramethylammonium chloride，(CH3)4NCl）溶液：
取多量的 TMACl (s)，置於 70 ℃烘箱中 3 小時，乾燥。稱取 4.38 g 之
TMACl (s)，二次水溶解，加入 20 ml 定量瓶，配成 2.0 M 的 TMACl (aq) ，
為所需之離子強度劑。 離子強度的計算方法：
2 2 2 2 1 Aa Bb Cc [A]、[B]、[C] …代表該 A、B、C…離子的莫耳濃度； a、b、c…則代表 A、B、C…離子的電荷 以 CuONO2A 為例： ONO2A‧2HBr + CuSO4→ CuONO2A + 2Br- + SO42- + 4H+ μ=1/2 [ 2(-1)2 + (-2)2 + 4(+1)2 ]=5 如配 5.0 ml，配位子濃度 2.0 mM，μ=0.10 M 之滴定溶液 需補 2 M TMACl (aq)：[(0.10 – 5 × 0.002) × 5.0] ÷ 2=0.225 (ml)4. 以 TMAOH(aq)標定配位子 ONO2A 溶液：
在滴定槽中加入 1000 μl ONO2A (aq)；250 μl TMACl (aq)；3750 μl 二
次水，配成體積 5 ml，配位子濃度 2.0 mM，μ=0.10 M 之滴定溶液， 控制溫度在 25±0.1 ℃，攪拌子攪拌平衡。
滴定前，電極先以 pH 7.00；pH 4.01；pH 9.95 三個標準液做校正， pH(as)=7.0±0.10；slope=0.999～0.985。
滴定超過 5 個 ONO2A 當量的 TMAOH(aq)，會在約 3 當量的 TMAOH(aq)
體積，產生一個反曲點（圖 3-1.）。
5. 以 TMAOH(aq)標定配位子 CuONO2A 溶液：
因為合成的過程中，生成配位子溴酸鹽，一個 ONO2A 不一定有整數
個 HBr。為求精確，還要再以 Cu2+錯合標定，以交叉確定 ONO2A (aq)
的濃度。
配體積 5 ml，配位子濃度 2.0 mM，μ=0.10 M 之滴定溶液：取 1000 μl
ONO2A (aq)、已標定濃度的 CuSO4(aq)（標定方法及原理見第四章），
過量 5%，即 10.50 mmole、225.0 μl TMACl (aq)，補足二次水達 5 ml，
控制溫度在 25±0.1 ℃，攪拌子攪拌平衡。
以 TMAOH(aq)滴定，Metrodata TiNet 2.4，Metrohm 軟體計量，設定
值為 V step：0.001 ml；signal drift：1 mv/min；equilibrium time：200 s。
滴定超過 5 個 ONO2A 當量的 TMAOH(aq)，會在約 4 當量的 TMAOH(aq)
體積，產生一個反曲點（圖 3-1.）。
【圖 3-1.】 ONO2A 及 CuONO2A 酸鹼滴定曲線
moles of TMAOH / moles of ligand
0 1 2 3 4 5 6 pH 2 4 6 8 10 12 ONO2A CuONO2A
（例）ONO2A (aq)濃度計算： ONO2A 在滴定了 0.0601 ml TMAOH，產生反曲點。CuONO2A 則在 滴定了 0.0801 ml TMAOH，產生反曲點。 根據錯合的原理，推測兩者反曲點之間相差 1 個當量的 H+。 標定之 TMAOH(aq)=0.4745 M ( 0.0801 - 0.0601 ) ×0.4745=1 ml ONO2A (aq)的毫莫耳數 ONO2A (aq)=9.4900 mM 如果以 ONO2A 在滴定了 0.0601 ml TMAOH，產生的反曲點做為 3 個當量的 H+，則 ONO2A (aq)=9.5058 mM 兩種方法標定 ONO2A(aq)濃度在誤差範圍內（0.16％），因此認定合成 的配位子包含 2 個溴酸鹽。
※ 配位子質子化常數之滴定原理
化學反應中，當中心離子 A 開始與反應物 B 進行反應，一連串的平衡 反應就會接著進行，而形成物種 ABi（i=1,2,3…）。 其平衡反應式如下： i AB iB A
i i B AB B A ABK
i 式（1.） 假如 A 為配位子（L），B 為氫離子（H），則反應平衡為： HL H L
H L HLK
HHL 式（2.） L H H L Hn1 n
H L H L H n n H L HK
n 1 式（3.） 因 為K
HHL
i n
i 3 , 2 , 1 為 每 一 步 的 質 子 化 常 數 （ stepwise protonation constant），而K
H LHn '為總質子化常數（overall protonation constant），其
關係式為：
K
K
K
K
K
HHL H L H H L H H HL H L Hn ' 2 3 n 式（4.） 若平均質子化數為 h，配位子所能解離的氫離子濃度為已知，則平均 質子化數可定義為：
totalligand concentration
species ligand to bound ion concentrat ion hydrogen dissocial total h
L HL H L
H L
L H n L H L H HL n n 2 3 2 3 2
n i i n i i L H L H i 0 1
n i i H L H n i i H L H H K H iK i i 0 1 where 1 0 K
HHL 式（5.）溶液中總氫離子濃度
H t，包含未鍵結與鍵結（free and bound）的部 份，因此在溶液中的質量平衡式為：
OH H L H i H t i 式（6.）
i HiL ：與配位子鍵結的氫離子濃度（the total bound hydrogen ionconcentration）
H ：從配位子解離出的自由氫離子濃度（the total free hydrogen ion
concentration）
OH ： 氫離子濃度的校正因子（the correction term for hydrogen ion
concentration formed by the dissociation of water）
在滴定的過程中，持續將強鹼加入溶液中，所以氫離子的總濃度會下 降，此時
H t也可以寫成：
V b L n H t t 式（7.）n ：配位子質子化總數（number of protonation sites on the ligand）
L t：配位子總濃度（total ligand concentration）
H t：溶液中氫離子總濃度（total hydrogen ion concentration in thesolution）
V ：體積校正因子（a volume concentration factor for dilution）
b：滴定過程中所加鹼的量 根據式（6.）、式（7.）可得：
iH L H H OH n Lt b H OH t i 式（8.）若取 half-integral a 值（mole of base / mole of ligand）為
K
H L Hn 值， 代入式（5.）便可以得到
n i i n i i l theoretica L H L H i h 0 1 ，且與實驗值所得到的 h theoretical 存在一個標準偏差值，利用電腦反覆取點運算後可找出最小偏差，同時也 可找出正確的K
H L Hn （質子化常數）。※ 配位子 ONO2A 之質子化常數
將 ONO2A (aq)及 TMAOH(aq)滴定的結果（圖 3-2.），以 Microsoft EXCEL
軟體處理，取前 60～70 點的數據，再輸入 Martell PKAS 程式，鍵入標定
後的 TMAOH(aq)濃度及 ONO2A (aq) 毫莫耳數，即可得到配位子 ONO2A
之質子化常數（LogKi）。
＊ ONO2A 質子化常數之計算結果：
【圖 3-2.】ONO2A 濃度 2.0 mM，μ=0.10 M（TMACl）體積 5.0 ml，以 TMAOH 滴定之結果
ONO2A Titration Equivalents 0 1 2 3 4 5 6 pH 2 4 6 8 10 12 0827-1 0827-2 0827-3
實驗值 參考資料30 參考資料34 LogK1 10.61（±0.05） 10.57（±0.01） 10.8 LogK2 4.96（±0.15） 4.02（±0.08） LogK3 2.50（±0.03） 1.8（±0.3） LogK4 1.71（±0.02） ＜1 【表 3-1.】ONO2A 質子化常數
根據 Delgado et al.30，利用 NMR 滴定，找出 ONO2A 的質子化順序
（圖 3-3.），第一個質子化（LogK1）是在 ONO2A 任一個 N 上，第二個質 子化的位置，則是尚未質子化的 N 上的 COO-，再來是另一個 N 上的 COO-， 最後才是另一個 N。 但是根據林玉淳學姐分子模擬 41以及 ONO 本身的質子化常數 30、乙 酸根及三級氮的鹼度，分析結果應該是水溶液下 pH 7 時，大環上的兩個 N 就會部分質子化，最後質子化的則是兩個酸基。
＊ 不同配位子之質子化常數：
ONO2A NO2A29 PhNO2A29 ODO2A35 ONO30
LogK1 10.61（±0.05） 11.24（±0.09） 10.69（±0.02） 10.88（±0.02） 9.68 LogK2 4.96（±0.15） 6.42（±0.07） 5.56（±0.07） 5.96（±0.11） 5.45 LogK3 2.50（±0.03） 3.03（±0.13） 3.02（±0.05） 2.85（±0.13） LogK4 2.04（±0.10） ΣpKa 18.07 22.73 19.27 19.69 15.13 【表 3-2.】相關不同配位子之質子化常數。 PhNO2A（1-phenethyl-4,7-bis(tert-butoxycarbonylmethyl)-1,4,7-triazacyclononane）； ODO2A（1-oxa-4,7,10-triazacyclononane-4,10-diacetic acid） ONO（1-oxa-4,7-diazacyclononane） 因為如果環上 N 質子化後，會跟尚未質子化的 COO-形成內分子氫鍵 30
，會穩定整個分子的結構，因此加了酸基的 ONO2A 之 LogK1會比 ONO
的值來得高。如果就整個分子而言，N 與 COO-產生的氫鍵最強，大於 O。
因此，蔡政憲學長所做的 NO2A 其 LogK1的數值比 ONO2A 來得高。
若與 ODO2A 35相比，因為十二元環的內部質子化的情況影響因子較
第四章 配位子 ONO2A 與鑭系金屬穩定常數之研究
※ 配位子穩定常數之滴定原理
當一金屬離子 M 與一配位子 L 鍵結，其穩定常數的平衡式為： ML L M
M L MLK
ML 式（A.） MHL H ML
ML H MHLK
MHLH 式（B.）K
ML：金屬離子錯合物的穩定常數（stability constant）K
HMHL：金屬離子錯合物的質子化常數 H MHL LogK 可利用取 a 值為 0.5，0.15…附近幾點加以運算，若求出其間的標 準差小於 0.05 便可作為正確的 H MHL LogK 。 H MHL LogK 由 上 述 的 方 法 求 得 後 ， KML 便 可 利 用 電 荷 平 衡 （ charge balance）與質量平衡（mass balance）求得：
L t：配位子總濃度（total ligand concentration）n K ：配位子質子化常數（protonation constant）
Lt L HL H2L
HnL
MHL
ML
1K1 H K1K2 H 2 K1K2K3 H 3 K1K2K3 Kn H n
L
KMHLH
H 1
ML
L X
ML A1 1 式（C.） 令，A
K
H K K
H K K K
H 3 K1K2K3Kn
H n
3 2 1 2 2 1 1 1 1
1
1 K H X MHLH
M t：金屬離子總濃度（total metal ion concentration）
H t：溶液中氫離子總濃度（total hydrogen ion concentration in the solution）n ：配位子質子化總數（number of protonation sites on the ligand）
V ：體積校正因子（a volume concentration factor for dilution）
b：滴定過程中所加鹼的量
V b L n H t t 式（8.）
HL 2H2L
3H3L
n
HnL
H OH
OH MHL n ML n H K K K nK H K K K H K K H K L n n 1 3 2 1 2 2 1 2 3 3 1 2 3 1
OH K n n ML H K K K nK H K K K H K K H K L H MHL n n 1 3 2 1 2 3 3 3 2 1 2 2 1 1
A2 L X2 ML OH 式（E.） 令，A2
K1
H 2K1K2
H 23K1K2K3
H 3nK1K2K3Kn
H n
H MHL K n n X2 1
L 、t
M 、t
H 、t A 、1 X 、1 A 、2 X 、2
OH 為已知可求得之參數，故K
ML （穩定常數）可由上列式（A.～E.）求得。※ 金屬陽離子濃度之標定方法
配位子對金屬離子的穩定常數，建立在配位子與金屬離子濃度的精準 度，當兩者的濃度被標準化過之後，所得的穩定常數才有意義。第三章已 經有標定配位子濃度的方法，金屬離子的濃度標定通常就是利用配位子與 之錯合前後的反應來決定。
例如 Na2H2EDTA（Disodium ethylene diaminetetraacetic acid），此
配位子試劑有四個酸基及兩個氮原子具有電子供給團，可以與金屬離子形
成穩定的六配位錯合物（圖 4-1.），當所有金屬陽離子皆與配位子反應後，
即達滴定終點（end point），其莫耳比率為 1：1。因此，Na2H2EDTA 時
常被拿來標定金屬離子濃度。
標定金屬離子濃度的實驗，除了配位子試劑及金屬離子外，尚需金屬 離子指示劑（indicator）及緩衝溶液（buffer）。例如 Eriochrome Black T 在 pH 10.0 的金屬離子水溶液中為酒紅色，而當足量的 EDTA 與金屬離子 螯合反應後，溶液會由酒紅色轉為藍色，此時即達滴定終點。
利用 Na2H2EDTA 來標定金屬離子時，以下三種方法是較常被使用的：
1. 直接滴定法（direct titration method）：
大約有四十種的金屬陽離子可利用以知濃度的 Na2H2EDTA（aq）及適合
的指示劑來直接滴定未知金屬離子溶液濃度。
2. 反滴定法（back titration method）：
先加過量的 Na2H2EDTA（aq）到金屬溶液中，再利用標準的其他金屬溶
液（Zn2+、Mg2+）滴定過量的 Na2H2EDTA（aq）達滴定終點。此方法適
合以下幾種情況：（A）金屬離子與 Na2H2EDTA（aq）反應速率遲緩；（B）
無適合的金屬離子指示劑；（C）金屬離子容易產生沉澱。
3. 交換反應滴定法（exchange reaction titration method）)：
過量的 Zn-EDTA 或 Mg-EDTA 加入金屬溶液中，若欲分析的金屬與
EDTA 形成更穩定的錯合物，則 Zn2+或 Mg2+會游離，再以標準的
Na2H2EDTA（aq）標定其濃度。此法適用於無適合指示劑可用時。
實 驗 中 ， 所 有 用 來 與 配 位 子 ONO2A 錯 合 的 金 屬 溶 液 ， 濃 度 都 是 以
※ 金屬陽離子濃度之標定原理
當金屬陽離子與配位子試劑莫耳數以 1：1 的比例混合之後，通常會 有下列的反應發生： b a b a MY Y M 例如，Na2H2EDTA（H2Y）與金屬陽離子在不同的 pH 值中有下列主
要的反應平衡，式中 a 值決定 pH 值大小： 在 pH 7～9 時，Ma HY3 MYa4 H 在 pH 9～10 時， a 4 a4 MY Y M 寫成平衡通式如下： cH MY Y H M a c c b a b 平衡常數 K 可寫成下式：
M H Y
H MY K c c 式（a.） 而金屬陽離子與配位子所形成的錯合物之反應平衡式可寫成： MY Y M 其中金屬離子錯合物的穩定常數為KMY：
M Y MY KMY 式（b.） 實驗過程中，為避免氫離子對金屬離子指示劑造成干擾，在標定金屬 離子時，pH 值必頇要維持一定的值。例如以 Na2H2EDTA 標定 Ca+2時， pH 值要保持在 9.0～10.0 左右，其主要反應平衡式如下：4 4 a a MY Y M
4 4 Y M MY K a a MY 式（c.）
4 Y 值會隨著 pH 值的不同而改變，但在標定過程中，pH 值是維持不變的。 而
4 Y 與CT 的關係式如下： T C ：未形成錯合物之配位子總濃度 4 ： 4 Y 在未形成錯合物的配位子之相對濃度 i K ：配位子的質子解離常數
HnY Hn1YH
Y 4CT 4 式（d.）
Y HY
H Y
H Y
H Y
CT 4 1 3 2 2 3 4 式（e.）
T C Y 4 4
3 4 1 2 2 1 3 2 1 4 3 2 1 4 3 2 1 H H K H K K H K K K K K K K K K K K 式（f.） 根據式（c.）、式（d.）可得：
MY T a a MY K C M MY K 4 4 式（g.） MYK 為條件形成常數（conditional formation constant），會隨著 pH 值不同
※ 金屬陽離子濃度之標定步驟
＊ 配製溶液： 1. 0.10 M Ca2+溶液的配製： 將過量 CaCO3（s）放置在 100 ℃的烘箱 2～3 小時，烘乾後秤取 1.009 g， 溶於少量的二次水中，小心地滴入 12.0 N HCl（aq）將 CaCO3（s）慢慢溶 解，最後以 100 ml 的定量瓶加二次水稀釋成 0.10 M 的 Ca2+（aq），此為 標準濃度的 Ca2+（aq）。 2. 0.10 M Na2H2EDTA 溶液的配製： 秤取 18.613 g Na2H2EDTA（s），將之以二次水溶解後，用 100 ml 的定 量瓶稀釋成約 0.10 M 的 Na2H2EDTA（aq）。 3. 指示劑的配製：◇ Erichrome Black T（EBT）：取 Erichrome Black T（s） 0.20 g，以
20 ml 的定量瓶稀釋成 1.0% Erichrome Black T（aq）。
◇ Murexide：取 Murexide（s） 0.04 g，用 20 ml 定量瓶加二次水稀釋
成 0.2% Murexide（aq）。
◇ Xylenol Orange：取 Xylenol Orange tetrasodium salt（s）0.20 g，
4. 緩衝溶液的配製： 緩衝溶液的配製根據 Henderson-Hasselbalch equation，
A HA K O H log a log log 3 即，
HA A pK pH a log 由所需緩衝溶液的 pH 值及 Ka值，可以求得共軛酸鹼的比例。 ◇ NH3/NH4 + （aq） 0.10 M pH 10.0：（Ka=5.70×10-10）
4 3 log 24 . 9 0 . 10 NH NH ，
5.75 4 3 NH NH 取 g mole g L M 0.50 53.49 0.40 10 . 0 75 . 6 1 的 NH4Cl（s），溶於少量二 次水，以 ml ml g mole g L M 0.50 35.05 0.894 29% 5.76 10 . 0 75 . 6 75 . 5 的 NH4OH（aq）（29%）調整 pH 值至 10.0，補水至 500ml。 ◇ NH3/NH4+（aq） 0.10 M pH 7.0～8.0：（Ka=5.70×10-10）
4 3 log 24 . 9 5 . 7 NH NH ，
0.018 4 3 NH NH 取 ml ml g mole g L M 0.50 35.05 0.894 29% 6.76 10 . 0 的 NH4OH （aq），以 ml ml g mole g L M 0.50 36.64 1.18 37% 4.12 10 . 0 018 . 1 1 的 HCl（aq）（37%）調整 pH 值至 7.0~8.0，補水至 500 ml。 ◇ CH3COONa/CH3COOH（aq） 0.10M pH5.0～6.0：（Ka=1.75×10-5）
CH3COO
log 76 . 4 5 . 5 ，
3
5.50 COO CHml ml g mole g L M 0.50 60.05 1.049 / 0.44 10 . 0 50 . 6 1 的 CH3COOH （aq）調整 pH 值到約 5.0~6.0，再補水至 500 ml。 5. 金屬陽離子溶液的配製： ◇ 過渡金屬離子 Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+溶液的配製：
稱取足量的 Ni(NO3)2〃XH2O（s）、Cu(NO3)2〃XH2O（s）、Zn(NO3)2〃
XH2O（s）、Cd(NO3)2〃XH2O（s），加二次水配製成 100 mM 的 100 ml
水溶液。
◇ 鑭系金屬離子 La3+、Ce3+、Pr3+、Nd3+、Sm3+、Eu3+、Gd3+、Tb3+、
Dy3+、Ho3+、Er3+、Tm3+、Yb3+、Lu3+溶液的配製：
稱取足量的 Ln(NO3)3〃XH2O（s），加二次水配製成 20 mM 鑭系金
＊ 標定濃度： 1. 取 5 ml 0.10 M Ca2+（aq）及 15 ml 的 NH3/NH4+0.10 M pH 10.0 緩衝液， 加入小燒杯中，再加入兩滴 1.0% Erichrome Black T（aq）指示劑。以 EDTA（aq）滴定至小燒杯中，達當量點的時候，溶液由紫紅色變藍色。 此時，EDTA 與 Ca2+為 1：1 當量錯合，紀錄 EDTA（aq）滴定的體積。 由多次滴定的當量點體積平均值推算出精確的 EDTA（aq）濃度。 2. 取 1 ml 標定過的 EDTA（aq）及 5 ml NH3/NH4+0.10 M pH 7.0～8.0 緩 衝液，混合於小燒杯中，加入兩滴 0.2% Murexide（aq）指示劑，將過 渡金屬離子等（Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+）溶液滴定至燒杯中，到達 當量點時，溶液分別由粉紅色變為藍紫色、藍色、黃色、橙色，紀錄 過渡金屬離子溶液滴定的體積，由多次滴定的當量點體積平均值以 1： 1 當量計算 Ni2+（aq）、Cu2+（aq）、Zn2（aq）+、Cd2+（aq）的濃度。 3. 因為鑭系金屬在高 pH 值的水溶液環境下會產生 Ln(OH)3的沉澱，故 標定其濃度的時候用低 pH 值的緩衝液。取 2 ml 的 Ln3+（aq），加入 8 ml CH3COONa/CH3COOH 0.10 M pH 5.0～6.0 緩衝液，再加入兩滴 1.0% Xylenol Orange（aq）指示劑，此時的溶液為橙色的。以標定過的 EDTA（aq）滴定，到達當量點時溶液變成亮黃色，紀錄 EDTA（aq）滴定 的體積，由多次滴定的當量點體積平均值以 1：1 當量去計算 Ln3+（aq） 的濃度。
※ 配位子 ONO2A 與鑭系金屬之穩定常數
＊ 實驗方法：
配體積 5 ml，配位子濃度 2.0 mM，Ln3+(aq)濃度 2.0 mM（過量 5%），
μ=0.10 M 之滴定溶液：
計算後取適量標定過已知濃度 ONO2A (aq)、Ln3+(aq)，TMACl (aq)，補足二
次水達 5.0 ml，控制溫度在 25.0±0.1 ℃，攪拌子攪拌平衡。
以 TMAOH(aq)滴定，Metrodata TiNet 2.4，Metrohm 軟體計量，設定值為
V step：0.001 ml；signal drift：1 mv/min；equilibrium time：200 s。
滴定超過 5 個 ONO2A 當量的 TMAOH(aq)，會在約 4 當量的 TMAOH(aq)
體積，產生一個反曲點（圖 4-2.）。
將 ONO2A (aq)及 Ln
3+
(aq)、TMAOH(aq)滴定的結果，以 Microsoft EXCEL
軟體處理，取前～80 點的數據，再輸入 Martell BEST 程式，鍵入標定後
的 TMAOH(aq)濃度及 ONO2A (aq)毫莫耳數、Ln3+(aq) 毫莫耳數，即可得到
配位子 ONO2A 與特定鑭系金屬之穩定常數（KML）。
＊ 實驗結果： 1. 鑭系金屬與配位子 ONO2A 之錯合滴定曲線，其他個別 Ln 與 ONO2A 錯合的滴定曲線請見附錄（7.）： LnONO2A pH 4 6 8 10 12 ONO2A LuONO2A YbONO2A TmONO2A ErONO2A HoONO2A DyONO2A TbONO2A GdONO2A EuONO2A SmONO2A NdONO2A PrONO2A CeONO2A
【圖 4-3.】部分鑭系金屬、過渡金屬與配位子 ONO2A 之錯合滴定曲線 ML Titraion Curve Equivalents 0 2 4 6 8 pH 2 4 6 8 10 12 ONO2A YbONO2A TbONO2A EuONO2A CeONO2A CdONO2A CuONO2A NiONO2A ZnONO2A
2. 鑭系金屬與配位子 ONO2A 之穩定常數（KML）：
ONO2A NO2A29 PhNO2A29 DO2A36
La3+ 7.25±0.21 8.95±0.08 6.29±0.07 10.94±0.14 Ce3+ 9.65±0.11 9.63±0.08 6.81±0.06 11.31±0.03 Pr3+ 10.03±0.04 10.18±0.05 7.07±0.09 12.00±0.10 Nd3+ 10.21±0.12 10.39±0.02 7.07±0.06 12.56±0.10 Sm3+ 10.47±0.01 10.87±0.07 7.56±0.01 12.93±0.01 Eu3+ 10.44±0.14 10.84±0.04 7.82±0.05 12.99±0.12 Gd3+ 10.18±0.05 10.74±0.14 7.63±0.16 13.06±0.04 Tb3+ 10.25±0.05 10.82±0.03 7.79±0.02 12.93±0.01 Dy3+ 10.22±0.01 10.84±0.03 7.83±0.24 13.13±0.05 Ho3+ 10.06±0.09 10.89±0.02 7.98±0.01 13.00±0.01 Er3+ 10.17±0.01 11.01±0.02 8.09±0.06 13.31±0.02 Tm3+ 10.28±0.05 11.24±0.04 8.22±0.03 13.19±0.11 Yb3+ 10.46±0.04 11.41±0.09 8.42±0.08 13.26±0.15 Lu3+ 10.25±0.07 11.56±0.01 8.42±0.01 13.16±0.18 Cu3+ 15.73±0.07 18.01±0.08 16.95±0.18 Zn3+ 13.94±0.11 17.10±0.12 15.78±0.01 Ni3+ 11.20±0.06 16.29±0.10 14.62±0.01 Cd3+ 11.08±0.04 13.76±0.05 13.06±0.01 【表 4-1.】ONO2A 及其他配位子與鑭系金屬、過渡金屬錯合之穩定常數 St ab ili ty Cons tan ts 7 8 9 10 11 12
由結果可以發現，ONO2A 比 DO2A 的鑭系金屬 KML要來得小（表 4-1.）， 原因是 DO2A 的環穴半徑較大，當金屬與之錯合的時候，穩定度會提高。 而如果單就九元環的衍生物，ONO2A 因為九元環上有一個 O 原子，造成 金屬與之錯合不穩定30，相對而言，NO2A 就有較高的穩定常數。PhNO2A 則是因為其有一個苯基存在，造成金屬錯合時的立體障礙，因此穩定常數 是三個九元環衍生物裡錯合效果最差的。 整體看來，離子半徑越大，穩定常數的值會越低，這在立體空間的狀 況是可以理解的，穩定常數遵循著鑭系收縮的特性。
3. 鑭系金屬與配位子 ONO2A 之水解常數（pKh）：
ONO2A NO2A29 PhNO2A29 Ln3+
La3+ 8.62±0.08 9.51±0.05 8.80±0.05 9.1400 Ce3+ 9.06±0.02 9.08±0.04 8.51±0.01 Pr3+ 9.06±0.12 9.47±0.09 8.32±0.03 8.6300 Nd3+ 9.26±0.09 9.83±0.02 8.25±0.07 8.5100 Sm3+ 8.90±0.02 9.40±0.06 7.89±0.05 8.4200 Eu3+ 8.93±0.04 9.46±0.03 7.69±0.08 8.3900 Gd3+ 8.82±0.06 9.37±0.06 7.72±0.26 8.4300 Tb3+ 8.38±0.04 8.68±0.16 7.59±0.05 8.2400 Dy3+ 8.58±0.01 8.64±0.09 7.61±0.01 8.1800 Ho3+ 8.44±0.06 8.53±0.07 7.54±0.02 8.1200 Er3+ 8.37±0.01 8.40±0.10 7.42±0.01 8.0700 Tm3+ 8.22±0.01 8.54±0.09 7.33±0.01 8.0300 Yb3+ 7.95±0.02 8.50±0.09 7.17±0.03 8.0000 Lu3+ 7.97±0.03 8.52±0.15 7.25±0.02 7.9800 【表 4-2.】鑭系金屬42 、ONO2A 及其他配位子與鑭系金屬、過渡金屬錯合之水解常數 【圖 4-4.】本實驗室目前研究的九元環衍生物與鑭系金屬（依離子半徑）水解常數關係圖29 La Ce Pr Nd Sm Eu Gd Tb Dy Ho Er Tm Yb Lu pK h 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 LnNO2A LnPhNO2A LnONO2A Ln3+
