第一章 緒論
1.1 前言
日本廣島大學於 2003 年成立牙齒銀行，在 2007 年 [1] 發表的文 章中提出以 ABI Corporation Ltd. (Abiko, Japan) 公司研發的 “Cells Alive System” (CAS) 冷凍保存技術保存牙齒。冷凍保存後的牙周韌 帶 (periodontal ligament) 存活率可達 90%。目前日本牙齒銀行已儲 存大約 1600 顆成人牙齒並且已植回 106 顆。已植回牙齒的成功率為 92% 而存活率為 97%。
牙齒是由硬組織 (牙本質)、軟組織 (牙髓組織)與牙齒的支持組織 (牙周韌帶組織)所構成的器官 [2]。牙齒硬組織的完整性和牙周韌帶 的活性與牙齒再植後能否執行功能相關 [3]。近年來，施松濤團隊已 證實牙髓組織蘊含幹細胞 [4] [5]。牙髓幹細胞可分化為脂肪細胞 (adipocytes) 、 類 神 經 細 胞 (neural-like cells) 、 造 牙 母 細 胞 (odontoblasts) 與軟骨細胞 (chondrocyte)。其他文獻也提出牙髓幹細 胞具有高度增殖能力 [6]、取得容易與沒有胚胎幹細胞取得上的道德 問題等優點 [7]。
臺北醫學大學於 2008 年引進廣島大學的技術，成立台灣第一間 牙齒銀行。除了繼承廣島大學卓越的牙周韌帶保存方法，目前也於 牙髓組織冷凍保存技術上有重大初步發現與成果 [8]。
2 般半流動狀的玻璃態 (vitrification)。而玻璃態可以有效地防止冰晶 的形成，間接地減少細胞的傷害。實際上，慢速降溫在時間上的掌
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同磁鐵置於鐵砂中，鐵砂會順著磁極排列。整齊的水分子不容易聚 集成為冰種，更不易形成致命的冰晶。不容易形成冰種的過冷水分 子為一種過飽和狀態 [12]。此種過飽和狀態與不下雨的悶熱天氣相 似，只要有外力 (降溫，灑人工 AgNO3) 介入則會下雨。程式降溫 儀只要持續降低溫度，水分子仍然會凝結固化，但其溫度會低於平 常的凝固點。降低水分子凝固點的溫度，會延長降溫時間，也間接 延長細胞脫水的時間。為了防止細胞脫水時產生的傷害，就必須加 入冷凍保護劑以保護細胞膜與胞器並達成細胞內外電解質的和諧。
而細胞脫水最佳的方法即是加入冷凍保護液，增加細胞內溶質濃 度，讓水分子隨滲透壓排到細胞外。所以牙齒銀行最早的英文文獻 中建議在磁性冷凍下加入 10% DMSO 作為冷凍保護劑來保存牙周韌 帶細胞 [13]。
目 前 冷 凍 保 護 劑 主 要 有 分 兩 類 ： (1) 細 胞 內 的 冷 凍 保 護 劑 (penetrating / colligative)，(2)細胞外的冷凍保護劑 (non-penetrating / osmotic) [11]。雖然文獻上對冷凍保護劑的真正機制尚未完全瞭解，
但已知細胞內的冷凍保護劑 (如 DMSO) 對慢速冷凍法有較佳的效 果，而細胞外的冷凍保護劑 (如海藻醣) 則對快速回溫有較佳的效果 [14]。慢速冷凍與快速回溫方式為牙齒銀行所採用的冷凍與解凍方 法。以下將介紹此兩種冷凍保護劑。
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1.3 細胞內冷凍保護劑: DMSO
Dimethyl sulfoxide (DMSO) 是 1866 年 俄 國 科 學 家 Alexander Zaytsev 以人工合成 [15] 小分子量的物質。其分子式為(CH3)2SO。
DMSO 擁有許多羥基 (poly-hydroxylated)，可同時溶解極性與非極性 物質 [16]，是一種相當好的萬能溶劑。DMSO 的硫原子與氧原子皆 為嗜核性 (nucleophilic)，與大多數冷凍保存液一樣可以破壞水分子 間的氫鍵。一旦水分子間的氫鍵被破壞，就不容易在低溫時形成冰 種、降低凝固點，也延長細胞在冷凍保存時之脫水時間。而且 DMSO 可以輕易地穿透皮膚而常用來促進藥物，如小型碳水化合物、聚合 體 (polymers)、胺基酸、無機鹽與氣體，滲透到體內 [17]。以冷凍 保護劑而言，DMSO 容易進出細胞，使水分子藉由增加的細胞內滲 透壓排到細胞外，所以適合作為慢速降溫冷凍方式 (脫水作用) 的冷 凍保護劑。
然而，文獻上發現高濃度的 DMSO 會促使胚胎幹細胞 (embryonic stem cell) 分 化 [18] ， 10% DMSO 會 使 幹 細 胞 植 體 (stem cell autograft) 內的 CD14+單核白血球凋亡 [19]，有些患者在接受殘存於 周 邊 血 液 造 血 前 驅 細 胞 (peripheral blood progenitors cell) 內 的 DMSO 會產生不適感 [20]。所以文獻上有數位學者嘗試以壓力 [21]，降溫速度 [22]，微波 (microwave) [23] 等物理方法來取代化學 性的冷凍保護劑，但礙於所需能量太大或組織導熱不易等問題而無 法廣泛被應用。
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1.4 細胞外的冷凍保護劑: 海藻醣
海藻醣 (trehalose)呈白色結晶形，為 1832 Wiggers 在黑麥麥角 (ergot of rye) 所發現 [24-26]。與蔗糖同樣是由兩個葡萄糖單糖組成 的雙糖，但海藻醣是由兩個 D-葡萄糖 (D-glucose) 分子所組成。海 藻 醣 的 分 子 式 (molecular formula) 為 C12H22O11， 結 構 式 為
，分子量為 342.31 [27]。在相同體積的情況下，海藻醣 與其他醣類比較，可以有較多的氫鍵 (H-bond)。可以捉住較多的水 分子，比較黏稠。同濃度下，海藻醣所佔體積是其他醣類的 2.5 倍 [28]。海藻醣是一種未還原雙糖，能讓生物分子，即油脂、酵素等其 他蛋白質，在惡劣環境中，保持穩定。並且可以保護某些抗旱植物 在乾枯期不受損害。
雖然高等的溫血動物尚未發現可以自行製造海藻醣，但生活在嚴 苛環境的生物體內常常具備海藻醣製造的能力 [27, 29-30]。日本學 者發現一種鋸蠅 (sawfly) 的蛹能從-40℃的環境下存活，其體內就含 有高濃度的海藻醣 [31]。Leslie 這位學者研究 Escherichia coli DH5 alpha 與 Bacillus thuringiensis HD-1 這兩株細菌以海藻醣或蔗糖作為 冷凍保護劑在乾燥冷凍 (freeze-drying) 處理後存活的狀況 [32]。
Leslie 發現雖然兩株細菌都能存活在兩種冷凍保護劑的作用，海藻醣 組的活性高於蔗醣組 15%，存活率也是海藻醣組較高。Leslie 認為海 藻醣具備安定蛋白質與酯雙層 (lipid bilayer) 的效果，所以為較佳的 冷凍保護劑。
海藻醣作為冷凍保護劑可幫助水分子玻璃態的形成。海藻醣也可
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作為水的替代品 [33]。當細胞降溫而脫水時，海藻醣為凝膠態 (gel) ， 可 保護 胞 器 間 的相 對位置並減少游 離 水分子 的 相對體積 [34]。此外海藻醣是很好的抗氧化劑 (antioxidant)，作為冷凍保護劑 時可以降低溶液的凝固點 (freezing point) 並保護細胞在脫水/水合 時 (dehydration/ re-hydration) 所受的傷害。 Crowe 研究能讓蛋白質 在冷凍或乾燥環境保存的物質，發現蛋白質作為冷凍保護劑會有專 一性的問題。特定蛋白質只能幫助某種特定蛋白質冷凍保存，但是 碳水化合物 (carbohydrate) 能幫助各種蛋白質度過乾燥及冷凍的考 驗 [35]。
近年來，有研究指出以海藻醣作為冷凍保護劑可以穩定細胞與組 織的相對關係並保護細胞膜的雙酯層[36-38]。以細胞外冷凍保護劑 如海藻醣作為 DMSO 冷凍保護劑的添加物，不但能提升冷凍保存後 的存活率 [39] [40]，也可以降低細胞內冷凍保護劑如 DMSO 的使用 量 [41]。
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1.5 冷凍保護劑使用在組織保存的考量因素
冷凍保護劑使用在組織保存時要考量的因素有以下幾項(1)溫 度、(2)時間、(3)種類、(4)濃度、(5)滲透速度與(6)接觸面積 [42]。
以熱力學的觀點來看，增加溫度會增加冷凍保護劑的活性與滲透 速度。溫度低於 4℃則反應過慢無法滲透組織且有結冰的可能性 [43]。Newton [44] 建議在降溫處理前，應先浸泡 4℃冷凍保護劑，
方能達到組織冷凍保存效果。提高冷凍保護劑作用溫度雖然可以縮 短反應時間，增加組織滲透速度，相對低也增加冷凍保護劑的細胞 毒性與微生物的感染機會 [45]。DMSO 使用濃度過高與作用時間過 久也會有細胞毒性。建議 DMSO 使用濃度為 5~10% [14]。Perry [46]
在其實驗中使用 10% DMSO 浸泡整顆牙齒一小時以保存其位在牙齒 硬組織內的牙髓。ATCC 建議的 DMSO 作用時間為 15~60 分鐘。海 藻醣為天然的冷凍保護劑，其細胞毒性比 DMSO 為低。文獻上不建 議冷凍保存時只單獨使用海藻醣作為冷凍保護劑 [14] [38]。在搭配 細胞內冷凍保護劑之下，海藻醣的建議使用濃度為 0.2~0.4 M [14]。
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1.6 牙髓組織的冷凍保存
儲存在牙齒銀行的牙齒有兩種軟組織被保存。這兩種軟組織被硬 組織 (齒質) 所隔離而與冷凍保護劑有不同面積的接觸。被覆在齒質 外的軟組織為牙周韌帶 (PDL)，它可以充分地與冷凍保護劑接觸。
目 前 已 有 眾 多 文 獻 討 論 牙 周 韌 帶 保 存 與 再 植 成 功 率 的 增 加 [47-56]。而包埋在齒質內的牙髓其存活與否則鮮少文獻著墨。牙髓 為一細長型軟組織，包覆著一層堅固的硬組織，而位在細長軟組織 一端的牙根尖開口負責血液與神經和外界交流。文獻上有研究團隊 將冷凍後的牙冠與牙根端牙髓皆放入組織分解素來檢測牙髓整體冷 凍後的組織活性 [46]，但牙髓為長條狀組織，而牙髓內富含幹細胞，
將牙冠與牙根片段牙髓一起培養無法分辨牙冠端或牙根端哪一個片 段具有活性。故在實驗設計上應將冷凍保護劑接觸端與非接觸端分 開觀察，方能客觀評估牙髓活性結果。
相較於冷凍保存細胞，組織因為冷凍保護劑滲透不易而須考量浸 泡時間與接觸面積的問題。冷凍保存牙髓組織比一般組織更為困 難，因為其外覆蓋著緻密的牙齒硬組織。日本廣島大學以慢速冷凍 法導入磁場的方式保存牙齒硬組織外的牙周韌帶 [13]，使牙齒整顆 冷凍解凍後再植成功率為 92%。牙齒硬組織內的牙髓組織解凍後存 活率為 73% [8]。本研究希望進一步開創在磁性冷凍下能有更好的牙 髓組織冷凍條件，以作為未來牙齒銀行牙髓儲存的參考。
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