磁性冷凍下冷凍保護劑浸泡時間與牙髓組織接觸面積對冷凍保存效益之影響

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(1)臺北醫學大學口腔醫學院牙醫學系碩士班碩士論文 Graduate Institute of Dentistry College of Oral Medicine Taipei Medical University. 磁性冷凍下冷凍保護劑浸泡時間與牙髓組織接觸面積對冷凍保存效益之影響 Effect of cryoprotectant equilibration time and contact surface area under novel magnetic freezing technology on dental pulp tissue cryopreservation. 指導教授:. 李勝揚博士 (Sheng-Yang Sean Lee, D.D.S., Ph.D.). 共同指導教授:. 楊維中博士 (Wei-Chung Vivian Yang, Ph.D.). 研究生:. 孫釗炫. (Chao-Hsuan Benson Sun, D.D.S.)撰. 中華民國九十九年七月 July, 2010.

(2) Abstract. Cryopreservation of dental tissues, unlike cells, will inevitably encounter ineffective permeation due to limited cryoprotectant contact surface area and unavoidably prolonged cryoprotectant （DMSO） incubation time. Effective cryopreservation of dental pulp tissue is difficult due to surrounding hard tissue which further restricts pulp tissue’s exterior connection. This study has demonstrated the effectiveness of using magnetic field to promote vitrification, maintaining post thaw pulp tissue morphology and viability. Removing dental hard tissue is an alternative mean for improving pulp tissue viability. Trehalose as cryoprotectant addictive, on contrary, does not ameliorate post thaw pulp viability. In addition, under magnetic freezing, 5% DMSO with 15 min incubation time is ideal for preserving pulp tissue. post-thaw. viability.. This. study. provides. an. cryopreservation condition for dental pulp tissue preservation.. Keywords: Cryopreservation, Dental pulp, Tooth bank. I. improved.

(3) 論文摘要. 日本廣島大學使用 10% DMSO 作為冷凍保護劑並以磁性冷凍抑制冰晶的形成，使得牙齒再植後成功率為 92%。臺北醫學大學沿襲相同的牙齒儲存流程以 10% DMSO 作為冷凍保護劑冷凍保存整顆牙齒，結果顯示解凍後 73% 牙齒可培養出牙髓間葉幹細胞。本研究試圖在磁性冷凍下，增加冷凍保護劑接觸面積、添加海藻醣冷凍保護劑與降低 DMSO 使用濃度與浸泡時間，以期提升整顆牙齒冷凍解凍後牙髓活性。動物大鼠實驗分為牙齒整顆冷凍組與牙髓裸露組。牙齒整顆冷凍組為一端開口的大鼠門齒，而牙髓裸露組則為無牙齒硬組織包覆的大鼠門齒牙髓組織。以「5% DMSO」、「10% DMSO」、「5% DMSO + 0.3 M 海藻醣」與「10% DMSO + 0.3 M 海藻醣」作為冷凍保護劑。整顆牙齒冷凍組分別浸泡以上冷凍保護劑中 15 分鐘、30 分鐘與 60 分鐘。牙髓裸露組則浸泡在「5% DMSO」與「10% DMSO」中 15 分鐘、30 分鐘與 60 分鐘。將浸泡完的整顆牙齒與裸露牙髓依各組別分別以(1)有磁性的降溫與(2)無磁性降溫處理。解凍後以(1)組織切片(H & E staining): 觀察牙髓組織牙冠端(閉口)與牙根端(開口) 的形態與(2)外植片體活性分析法評估牙髓的牙冠端、中間與牙根端活性。結果顯示，外植片體活性分析法中，不論是整顆牙齒冷凍組或牙髓裸露組在磁性冷凍下，可有效降低 DMSO 濃度至 5%，且浸泡時間僅需 15 分鐘，即可達到最佳的解凍後活性。以磁場破壞水分子間的氫鍵有助於降低冰晶的形成，減少 DMSO 使用濃度與浸泡時 II.

(4) 間，在組織切片分析中發現磁性冷凍法有效減少組織形態的破壞。不論是外植片體活性分析法或組織切片形態觀察下，以 0.3 M 海藻醣添加劑對牙髓組織冷凍保存沒有幫助。據此，磁性冷凍下，增加冷凍保護劑接觸面積時，可降低 DMSO 濃度與縮短浸泡時間，而能有效提升整顆牙齒冷凍解凍後牙髓活性與組織形態的完整。此一結果可作為日後牙齒冷凍儲存的重要參考。. 關鍵字: 冷凍保存，牙髓，牙齒銀行. III.

(5) 誌謝感恩李勝揚所長在臨床與研究上對我的照顧，三年來引領我從矯正到冷凍科學的殿堂。釗炫在此要特別謝謝李所長。感謝楊維中老師不時的討論與指導，讓我在實驗上有了方向與動力。這三年中，非常謝謝蔡吉陽老師、林利香老師、蘇志鵬老師、許必靈老師、蔣金玉老師與王蔚南老師悉心的教導，使我在臨床知識上獲益匪淺。本論文亦得感謝台灣大學牙醫學系鄭景暉老師、台灣大學獸醫學系郭宗甫老師、臺北醫學大學生化學系黃彥華老師、臺北醫學大學公衛學系葉錦瑩老師與臺北醫學大學生工學系黃豪銘老師的幫助及提醒，使得本論文能夠更完整而嚴謹。也要感謝熊兆男小姐在報告與行政事務上的大力協助與鼓勵。劉為麟學長從最初的實驗操作到論文盲點的指示都非常費心的給我幫忙，在這要特別謝謝他。張憲汛助人而不求回報，讓我深深體會慈濟人大愛的精神。實驗室的瑜萱、書君、彥志、Lisa、陳怡、采真、志喬與曉玲，謝謝你們時時給我協助與建議。也要謝謝同甘共苦三年的國維，我們是該休息一下了。此外，更要感謝矯正科諸位對我的體諒與鼓勵。本實驗而犧牲的大鼠們，因為你們的奉獻，本研究才可以順利完成。最後，要謝謝父親，母親長年的辛勞與栽培，你們一直是我的支柱。也要謝謝雅珊、盈年、釗源與新竹的姚醫師和陳醫師，有你們的支持與鼓勵釗炫才能走到這裡。. IV.

(6) 目錄. Abstract ................................................................................................... I 論文摘要 ...............................................................................................II 誌謝 ..................................................................................................... IV 目錄 ...................................................................................................... V 圖目錄 ................................................................................................. IX 表目錄 ................................................................................................. XI 附錄目錄 ............................................................................................ XII 第一章. 緒論.................................................................................. 1. 1.1. 前言.................................................................................. 1. 1.2. 牙齒銀行冷凍保存原理 .................................................. 2. 1.3. 細胞內冷凍保護劑: DMSO ............................................. 4. 1.4. 細胞外的冷凍保護劑: 海藻醣........................................ 5. 1.5. 冷凍保護劑使用在組織保存的考量因素 ....................... 7. 1.6. 牙髓組織的冷凍保存 ...................................................... 8. 第二章. 研究動機 .......................................................................... 9. 第三章. 研究目的 ........................................................................ 10. 第四章. 研究假說 ........................................................................ 11. 第五章. 研究方法 ........................................................................ 12. 5.1. 研究對象 ........................................................................ 12. 5.2. 實驗動物的準備 ............................................................ 13 V.

(7) 5.3. 大鼠門齒的冷凍與解凍方法......................................... 14. 5.4. 外植片體活性分析 (explant viability assay) ................. 15. 5.5. 5.6. 5.4.1. 外植片體活性分析實驗材料 ................................... 15. 5.4.2. 外植片體活性分析實驗步驟 ................................... 16. 5.4.3. 外植片體活性分析結果的統計方法 ....................... 17. 組織切片分析(histological analysis) .............................. 18 5.5.1. 組織切片分析的實驗材料....................................... 18. 5.5.2. 組織切片分析的實驗步驟....................................... 19. 藥品製備 ........................................................................ 21 5.6.1. DMEM培養基.......................................................... 21. 5.6.2. PBS (phosphate buffered saline)溶液 ....................... 21. 5.6.3. 10% 或 5% DMSO (Dimethyl sulfoxide) 冷凍保護. 劑…................................................................................ 22 5.6.4 「10% DMSO + 0.3 M trehalose」或「5% DMSO + 0.3 M trehalose」 ................................................................. 22 5.6.5. 4% 多聚甲醛 (paraformaldehyde) .......................... 22. 5.6.6. 10% EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) ........... 23. 第六章. 實驗結果 ........................................................................ 24. 6.1. 外植片體活性分析 ........................................................ 24 6.1.1. 以 5%或 10% DMSO浸泡大鼠整顆門齒 15、30 與 60. 分鐘後，在有無磁場冷凍處理下，對解凍後活性的影響…................................................................................ 24 6.1.2. 以 5%或 10% DMSO浸泡大鼠整顆門齒 15、30 與 60. 分鐘後，在有無磁場冷凍處理下，對牙根端片段活性的 VI.

(8) 影響................................................................................ 25 6.1.3. 以 5%或 10% DMSO浸泡大鼠門齒裸露牙髓 15、30. 與 60 分鐘後，在有無磁場冷凍處理下，對解凍後活性的影響............................................................................ 26 6.1.4. 以 5%或 10% DMSO浸泡大鼠門齒裸露牙髓 15、30. 與 60 分鐘後，在有磁場冷凍處理下，對解凍後各片段活性的影響 .................................................................... 27 6.1.5. 以 5%或 10% DMSO浸泡大鼠門齒裸露牙髓 15、30. 與 60 分鐘後，在無磁場冷凍處理下，對解凍後各片段活性的影響 .................................................................... 27 6.1.6. 以 5%或 10% DMSO添加 0.3 M trehalose浸泡大鼠整. 顆門齒 15、30 與 60 分鐘後，在有無磁場冷凍處理下，對解凍後活性的影響 .................................................... 28 6.1.7. 有無使用海藻醣添加劑浸泡大鼠整顆門齒，在磁性. 冷凍處理下，對整顆大鼠門齒解凍後活性的影響...... 28 6.1.8. 有無使用海藻醣添加劑，在無磁場冷凍處理下，對. 整顆大鼠門齒解凍後活性的影響 ................................. 29 6.2. 組織切片分析 ................................................................ 30. 第七章. 討論................................................................................ 31. 7.1. 外植片體活性分析 ........................................................ 31 7.1.1. 外植片體活性分析的檢測方法 ............................... 31. 7.1.2. 磁性冷凍下，冷凍保護劑浸泡濃度與時間的影響 32. 7.1.3. 磁性冷凍下，冷凍保護劑接觸面積對牙髓活性的影. 響…................................................................................ 34 VII.

(9) 7.1.4. 海藻醣冷凍保護劑 .................................................. 35. 7.2. 組織切片分析 ................................................................ 37. 第八章. 結論................................................................................ 39. 第九章. 參考文獻 ........................................................................ 40. 第十章. 實驗圖表 ........................................................................ 47. 第十一章. 附錄................................................................................ 80. VIII.

(10) 圖目錄. 圖一: 外植片體活性分析法實驗流程圖............................................ 47 圖二: 以 5% 或 10% DMSO 浸泡大鼠整顆門齒 (A) 15 分鐘、(B) 30 分鐘與 (C) 60 分鐘後，在有無磁場冷凍處理下對解凍後牙髓活性的影響。 .............................................................................. 49 圖三: 以 5% 與 10% DMSO浸泡大鼠整顆門齒 15、30 與 60 分鐘後，在有磁場冷凍處理下，對解凍後牙根端牙髓活性的影響。 ..................................................................................................... 50 圖四: 以 5% 與 10% DMSO浸泡大鼠整顆門齒 15、30 與 60 分鐘後，在無磁場冷凍下對解凍後牙根端牙髓活性的影響。 ........ 51 圖五: 以 5% 或 10% DMSO 浸泡大鼠門齒裸露牙髓 (A) 15 分鐘、(B) 30 分鐘與 (C) 60 分鐘後，在有無磁場冷凍處理下，對解凍後活性的影響。 .................................................................. 53 圖六: 以 5% 或 10% DMSO 浸泡大鼠門齒裸露牙髓 15、30 與 60 分鐘後，在有磁場冷凍處理下對 (A) 牙冠端 (B) 中間及 (C) 牙根端活性的影響。 .................................................................. 55 圖七: 以 5% 或 10% DMSO浸泡大鼠門齒裸露牙髓 15、30 與 60 分鐘後，在無磁場冷凍處理下對 (A) 牙冠端 (B) 中間及 (C) 牙根端活性的影響。 ...................................................................... 57 圖八:以 5% 或 10% DMSO (D) 及添加 0.3 M海藻醣 (T) 冷凍保護劑浸泡大鼠整顆門齒 (A) 15 分鐘、(B) 30 分鐘與 (C) 60 分鐘 IX.

(11) 後，在有無磁場冷凍處理下對解凍後活性的影響。 ............... 59 圖九:以 5% 或 10% DMSO (D) 及有無添加 0.3 M海藻醣 (T) 冷凍保護劑浸泡大鼠整顆門齒 (A) 15 分鐘、(B) 30 分鐘與 (C) 60 分鐘後，在有磁場冷凍處理下對解凍後活性的影響。 ............... 61 圖十:以 5% 或 10%. DMSO (D) 及有無添加 0.3 M海藻醣 (T) 冷. 凍保護劑浸泡大鼠整顆門齒 (A) 15 分鐘、(B) 30 分鐘與 (C) 60 分鐘後，在無磁場冷凍處理下對解凍後活性的影響。............ 63 圖十一組織切片處理方法流程圖 .................................................... 64 圖十二: 大鼠門齒在有磁場 (+ MF) 與無磁場 (－MF) 冷凍情況下之組織切片圖 (H & E staining)。 .............................................. 65 圖十三大鼠門齒整顆浸泡 15 分鐘冷凍保護劑後再冷凍之切片圖 66 圖十四大鼠門齒整顆浸泡 30 分鐘冷凍保護劑後再冷凍之切片圖 68 圖十五大鼠門齒整顆浸泡 60 分鐘冷凍保護劑後再冷凍之切片圖 70 圖十六大鼠門齒牙髓浸泡 15 分鐘冷凍保護劑後再冷凍之切片圖 72 圖十七大鼠門齒牙髓浸泡 30 分鐘冷凍保護劑後再冷凍之切片圖 74 圖十八大鼠門齒牙髓浸泡 60 分鐘冷凍保護劑後再冷凍之切片圖 76. X.

(12) 表目錄. 表一: 大鼠門齒裸露牙髓與整顆牙齒冷凍後的外植片體活性分析整理 ................................................................................................. 78 表二: 以 5%或 10% DMSO有無添加 0.3 M海藻醣冷凍保護劑浸泡 15、30 與 60 分鐘後，在有無磁場冷凍處理下的外植片體活性分析整理 ......................................................................................... 79. XI.

(13) 附錄目錄. 附錄一: 臺北醫學大學動物實驗管理小組審查同意書 .................... 80. XII.

(14) 第一章緒論. 1.1 前言. 日本廣島大學於 2003 年成立牙齒銀行，在 2007 年 [1] 發表的文章中提出以 ABI Corporation Ltd. (Abiko, Japan) 公司研發的 “Cells Alive System” (CAS) 冷凍保存技術保存牙齒。冷凍保存後的牙周韌帶 (periodontal ligament) 存活率可達 90%。目前日本牙齒銀行已儲存大約 1600 顆成人牙齒並且已植回 106 顆。已植回牙齒的成功率為 92% 而存活率為 97%。牙齒是由硬組織 (牙本質)、軟組織 (牙髓組織)與牙齒的支持組織 (牙周韌帶組織)所構成的器官 [2]。牙齒硬組織的完整性和牙周韌帶的活性與牙齒再植後能否執行功能相關 [3]。近年來，施松濤團隊已證實牙髓組織蘊含幹細胞 [4] [5]。牙髓幹細胞可分化為脂肪細胞 (adipocytes) 、類神經細胞. (neural-like cells) 、造牙母細胞. (odontoblasts) 與軟骨細胞 (chondrocyte)。其他文獻也提出牙髓幹細胞具有高度增殖能力 [6]、取得容易與沒有胚胎幹細胞取得上的道德問題等優點 [7]。臺北醫學大學於 2008 年引進廣島大學的技術，成立台灣第一間牙齒銀行。除了繼承廣島大學卓越的牙周韌帶保存方法，目前也於牙髓組織冷凍保存技術上有重大初步發現與成果 [8]。. 1.

(15) 1.2 牙齒銀行冷凍保存原理. 生物體內大約有百分之七十到八十的水分，水分子為生命不可或缺的一份子。水分子在自然界中有氣態，液態，玻璃與固態四項。冷凍保存和液態，玻璃與固態三項較有關係。根據 Mazur [9]在其書中的陳述:當降溫速度太快，細胞內的水分會來不及排出細胞外，細胞內相對的有較多的水分子。因為細胞內有較多的水分子，所以當溫度降低時，水分子與水分子間互相形成冰晶的機會增加。初期的冰晶稱為冰種 (seed)，一旦冰種形成後，水分子就會快速聚集，造成冰晶體積快速增加。快速降溫時，因為水分子來不及跑到細胞外，細胞內外都會有相當機率產生冰晶。增加細胞內的冰晶容易破壞細胞膜並造成細胞死亡。相對的，當降溫速度較慢，細胞外有較多的水分子，形成細胞外的冰晶比較容易。水分子慢慢的由細胞內流到細胞外造成細胞脫水。脫水的細胞因為胞內濃度較高，比較不容易結冰。但當溫度持續下降到一定程度時，整體細胞會形成如同玻璃般半流動狀的玻璃態 (vitrification)。而玻璃態可以有效地防止冰晶的形成，間接地減少細胞的傷害。實際上，慢速降溫在時間上的掌握是很困難的。速度稍快些，容易形成細胞內的冰晶。速度稍慢些，細胞會因為溶質濃度過高而死亡。Mazur [10]認為組織不易導熱，相較於快速冷凍，組織應使用慢速冷凍法處理。目前較普遍使用的慢速降溫速度是－0.5~－1℃/min [11]。牙齒銀行採用了先進的 CAS 冷凍保存技術，提高冷凍保存後的存活率。其原理是以慢速程式降溫系統為藍圖，導入磁場以降低冰晶的形成。水分子具有極性，磁場能將水分子依極性排列整齊，如 2.

(16) 同磁鐵置於鐵砂中，鐵砂會順著磁極排列。整齊的水分子不容易聚集成為冰種，更不易形成致命的冰晶。不容易形成冰種的過冷水分子為一種過飽和狀態 [12]。此種過飽和狀態與不下雨的悶熱天氣相似，只要有外力 (降溫，灑人工 AgNO3) 介入則會下雨。程式降溫儀只要持續降低溫度，水分子仍然會凝結固化，但其溫度會低於平常的凝固點。降低水分子凝固點的溫度，會延長降溫時間，也間接延長細胞脫水的時間。為了防止細胞脫水時產生的傷害，就必須加入冷凍保護劑以保護細胞膜與胞器並達成細胞內外電解質的和諧。而細胞脫水最佳的方法即是加入冷凍保護液，增加細胞內溶質濃度，讓水分子隨滲透壓排到細胞外。所以牙齒銀行最早的英文文獻中建議在磁性冷凍下加入 10% DMSO 作為冷凍保護劑來保存牙周韌帶細胞 [13]。目前冷凍保護劑主要有分兩類： (1) 細胞內的冷凍保護劑 (penetrating / colligative)，(2)細胞外的冷凍保護劑 (non-penetrating / osmotic) [11]。雖然文獻上對冷凍保護劑的真正機制尚未完全瞭解，但已知細胞內的冷凍保護劑 (如 DMSO) 對慢速冷凍法有較佳的效果，而細胞外的冷凍保護劑 (如海藻醣) 則對快速回溫有較佳的效果 [14]。慢速冷凍與快速回溫方式為牙齒銀行所採用的冷凍與解凍方法。以下將介紹此兩種冷凍保護劑。. 3.

(17) 1.3 細胞內冷凍保護劑: DMSO. Dimethyl sulfoxide (DMSO) 是 1866 年俄國科學家 Alexander Zaytsev 以人工合成 [15] 小分子量的物質。其分子式為(CH3)2SO。 DMSO 擁有許多羥基 (poly-hydroxylated)，可同時溶解極性與非極性物質 [16]，是一種相當好的萬能溶劑。DMSO 的硫原子與氧原子皆為嗜核性 (nucleophilic)，與大多數冷凍保存液一樣可以破壞水分子間的氫鍵。一旦水分子間的氫鍵被破壞，就不容易在低溫時形成冰種、降低凝固點，也延長細胞在冷凍保存時之脫水時間。而且 DMSO 可以輕易地穿透皮膚而常用來促進藥物，如小型碳水化合物、聚合體 (polymers)、胺基酸、無機鹽與氣體，滲透到體內 [17]。以冷凍保護劑而言，DMSO 容易進出細胞，使水分子藉由增加的細胞內滲透壓排到細胞外，所以適合作為慢速降溫冷凍方式 (脫水作用) 的冷凍保護劑。然而，文獻上發現高濃度的 DMSO 會促使胚胎幹細胞 (embryonic stem cell) 分化 [18] ， 10% DMSO 會使幹細胞植體 (stem cell autograft) 內的 CD14+單核白血球凋亡 [19]，有些患者在接受殘存於周邊血液造血前驅細胞 (peripheral blood progenitors cell) 內的 DMSO 會產生不適感 [20]。所以文獻上有數位學者嘗試以壓力 [21]，降溫速度 [22]，微波 (microwave) [23] 等物理方法來取代化學性的冷凍保護劑，但礙於所需能量太大或組織導熱不易等問題而無法廣泛被應用。. 4.

(18) 1.4 細胞外的冷凍保護劑: 海藻醣. 海藻醣 (trehalose)呈白色結晶形，為 1832 Wiggers 在黑麥麥角 (ergot of rye) 所發現 [24-26]。與蔗糖同樣是由兩個葡萄糖單糖組成的雙糖，但海藻醣是由兩個 D-葡萄糖 (D-glucose) 分子所組成。海藻醣的分子式 (molecular formula) 為 C12H22O11 ，結構式為，分子量為 342.31 [27]。在相同體積的情況下，海藻醣與其他醣類比較，可以有較多的氫鍵 (H-bond)。可以捉住較多的水分子，比較黏稠。同濃度下，海藻醣所佔體積是其他醣類的 2.5 倍 [28]。海藻醣是一種未還原雙糖，能讓生物分子，即油脂、酵素等其他蛋白質，在惡劣環境中，保持穩定。並且可以保護某些抗旱植物在乾枯期不受損害。雖然高等的溫血動物尚未發現可以自行製造海藻醣，但生活在嚴苛環境的生物體內常常具備海藻醣製造的能力 [27, 29-30]。日本學者發現一種鋸蠅 (sawfly) 的蛹能從-40℃的環境下存活，其體內就含有高濃度的海藻醣 [31]。Leslie 這位學者研究 Escherichia coli DH5 alpha 與 Bacillus thuringiensis HD-1 這兩株細菌以海藻醣或蔗糖作為冷凍保護劑在乾燥冷凍 (freeze-drying) 處理後存活的狀況 [32]。 Leslie 發現雖然兩株細菌都能存活在兩種冷凍保護劑的作用，海藻醣組的活性高於蔗醣組 15%，存活率也是海藻醣組較高。Leslie 認為海藻醣具備安定蛋白質與酯雙層 (lipid bilayer) 的效果，所以為較佳的冷凍保護劑。海藻醣作為冷凍保護劑可幫助水分子玻璃態的形成。海藻醣也可 5.

(19) 作為水的替代品 [33]。當細胞降溫而脫水時，海藻醣為凝膠態 (gel)，可保護胞器間的相對位置並減少游離水分子的相對體積 [34]。此外海藻醣是很好的抗氧化劑 (antioxidant)，作為冷凍保護劑時可以降低溶液的凝固點 (freezing point) 並保護細胞在脫水/水合時 (dehydration/ re-hydration) 所受的傷害。 Crowe 研究能讓蛋白質在冷凍或乾燥環境保存的物質，發現蛋白質作為冷凍保護劑會有專一性的問題。特定蛋白質只能幫助某種特定蛋白質冷凍保存，但是碳水化合物 (carbohydrate) 能幫助各種蛋白質度過乾燥及冷凍的考驗 [35]。近年來，有研究指出以海藻醣作為冷凍保護劑可以穩定細胞與組織的相對關係並保護細胞膜的雙酯層[36-38]。以細胞外冷凍保護劑如海藻醣作為 DMSO 冷凍保護劑的添加物，不但能提升冷凍保存後的存活率 [39] [40]，也可以降低細胞內冷凍保護劑如 DMSO 的使用量 [41]。. 6.

(20) 1.5 冷凍保護劑使用在組織保存的考量因素. 冷凍保護劑使用在組織保存時要考量的因素有以下幾項(1)溫度、(2)時間、(3)種類、(4)濃度、(5)滲透速度與(6)接觸面積 [42]。以熱力學的觀點來看，增加溫度會增加冷凍保護劑的活性與滲透速度。溫度低於 4℃則反應過慢無法滲透組織且有結冰的可能性 [43]。Newton [44] 建議在降溫處理前，應先浸泡 4℃冷凍保護劑，方能達到組織冷凍保存效果。提高冷凍保護劑作用溫度雖然可以縮短反應時間，增加組織滲透速度，相對低也增加冷凍保護劑的細胞毒性與微生物的感染機會 [45]。DMSO 使用濃度過高與作用時間過久也會有細胞毒性。建議 DMSO 使用濃度為 5~10% [14]。Perry [46] 在其實驗中使用 10% DMSO 浸泡整顆牙齒一小時以保存其位在牙齒硬組織內的牙髓。ATCC 建議的 DMSO 作用時間為 15~60 分鐘。海藻醣為天然的冷凍保護劑，其細胞毒性比 DMSO 為低。文獻上不建議冷凍保存時只單獨使用海藻醣作為冷凍保護劑 [14] [38]。在搭配細胞內冷凍保護劑之下，海藻醣的建議使用濃度為 0.2~0.4 M [14]。. 7.

(21) 1.6 牙髓組織的冷凍保存. 儲存在牙齒銀行的牙齒有兩種軟組織被保存。這兩種軟組織被硬組織 (齒質) 所隔離而與冷凍保護劑有不同面積的接觸。被覆在齒質外的軟組織為牙周韌帶 (PDL)，它可以充分地與冷凍保護劑接觸。目前已有眾多文獻討論牙周韌帶保存與再植成功率的增加 [47-56]。而包埋在齒質內的牙髓其存活與否則鮮少文獻著墨。牙髓為一細長型軟組織，包覆著一層堅固的硬組織，而位在細長軟組織一端的牙根尖開口負責血液與神經和外界交流。文獻上有研究團隊將冷凍後的牙冠與牙根端牙髓皆放入組織分解素來檢測牙髓整體冷凍後的組織活性 [46]，但牙髓為長條狀組織，而牙髓內富含幹細胞，將牙冠與牙根片段牙髓一起培養無法分辨牙冠端或牙根端哪一個片段具有活性。故在實驗設計上應將冷凍保護劑接觸端與非接觸端分開觀察，方能客觀評估牙髓活性結果。相較於冷凍保存細胞，組織因為冷凍保護劑滲透不易而須考量浸泡時間與接觸面積的問題。冷凍保存牙髓組織比一般組織更為困難，因為其外覆蓋著緻密的牙齒硬組織。日本廣島大學以慢速冷凍法導入磁場的方式保存牙齒硬組織外的牙周韌帶 [13]，使牙齒整顆冷凍解凍後再植成功率為 92%。牙齒硬組織內的牙髓組織解凍後存活率為 73% [8]。本研究希望進一步開創在磁性冷凍下能有更好的牙髓組織冷凍條件，以作為未來牙齒銀行牙髓儲存的參考。. 8.

(22) 第二章研究動機. 牙髓為埋藏在牙齒硬組織內細長的軟組織，而位在細長軟組織一端的牙根尖開口負責和外界交流。Perry [46] 將整顆牙齒浸泡 10% DMSO 一小時後，冷凍保存其位在牙齒硬組織內的牙髓。但因冷凍保護劑浸泡過久會有細胞毒性，Laureys [57] 施行牙根尖切除術來增加冷凍保護劑接觸面積，且增加冷凍保護劑滲透效果，用以減少浸泡時間來達到更佳的牙髓解凍後活性。日本廣島大學使用 10% DMSO 作為冷凍保護劑並以慢速冷凍法導入磁場的方式達到玻璃化冷凍 [13]，抑制了冰晶的形成，使得牙齒再植後成功率為 92%。臺北醫學大學牙齒銀行沿襲廣島大學牙齒儲存標準流程，以 10% DMSO 作為冷凍保護劑直接冷凍保存整顆牙齒，結果顯示解凍後 73% 牙齒可培養出牙髓細胞 [8]。本研究試圖在磁性冷凍下，增加冷凍保護劑接觸面積，但降低 DMSO 使用濃度與浸泡時間，以期提升整顆牙齒冷凍解凍後牙髓活性，並希望本研究結果能做為未來牙齒銀行牙齒儲存標準流程的依據。. 9.

(23) 第三章研究目的. 本研究試圖在牙齒銀行標準處理流程下，觀察增加牙髓與冷凍保護劑接觸面積、添加海藻醣、降低 DMSO 使用濃度並改變冷凍保護劑浸泡時間等變因，找出在磁性冷凍下保存牙髓組織之最佳條件，並作為未來牙髓保存的標準流程。. 10.

(24) 第四章研究假說. (1)牙齒硬組織會影響冷凍保護劑對牙髓組織的浸泡效率 (2)增加牙髓與冷凍保護劑接觸面積可以提升牙髓組織解凍後的活性 (3)以磁性刺激來破壞水分子間的氫鍵，並降低冰晶的形成，以 5% DMSO 浸泡 15 分鐘能達到最佳的牙髓組織冷凍保存效果 (4)磁性冷凍下，添加海藻醣冷凍保護劑可增加解凍後的活性. 11.

(25) 第五章研究方法. 5.1 研究對象. 實驗選取威斯達品系雄性大鼠 (Wistar rat)，實驗動物由樂斯科生物科技股份有限公司提供。實驗大鼠為八週年齡大，體重約為 271~300 公克重。實驗動物飼養於臺北醫學大學實驗動物中心，實驗鼠房維持每日 13:11 小時 light-dark cycle (07:00 AM to 08:00 PM lights on)，維持恆定溫度 (22℃ ± 2℃) 和空氣濕度 (40% ~ 70%)。實驗大鼠在進住後 3 日內進行實驗。實驗主要分為兩部分進行。(一)組織形態分析實驗 (N = 2) 使用 2 隻大鼠為無冷凍組、12 隻大鼠為無磁場冷凍組與 12 隻大鼠為有磁場冷凍組。(二)外植片體活性分析實驗 (N = 3) 使用 3 隻大鼠為無冷凍組(control)、27 隻大鼠為無磁場冷凍組與 27 隻大鼠為有磁場冷凍組。. 12.

(26) 5.2. 實驗動物的準備. 本實驗計畫經過臺北醫學大學動物實驗倫理委員會審核批准 (LAC-99-0008)，並遵守實驗動物照顧及實驗準則 (如附錄一)。八週大 Wistar 大鼠，首先將其昏迷後再以頸椎脫臼方式將其犧牲，以 chlorhexidine (Parmason Gargle, Taiwan) 清洗牙齒再以 PBS 沖洗口腔。利用大剪刀將大鼠頭部與軀體分離。在處理組織的負壓式無菌操作台 (lamina flow cabinet)內，以組織剪將大鼠上下顎分離。利用無菌紗布剝離肌肉與其他軟組織。再以拔牙箝與碳化鎢低速切割盤將大鼠門齒週邊的硬組織移除。取下的門齒，以剪刀移除 apical bud 的軟組織，此即為整顆大鼠門齒。牙髓裸露組與解凍後的整顆牙齒之牙髓取出方法是利用顯微組織剪延牙齒背部 (dorsal side) 的長軸剪開，以鎳子將牙髓取出。. 13.

(27) 5.3. 大鼠門齒的冷凍與解凍方法. 有磁場冷凍組依照牙齒銀行所提供之牙齒冷凍標準作業程序操作 [13]。操作上先將整顆牙齒或裸露牙髓浸泡在不同時間的冷凍保護液後，再放入配備有“Cells Alive System”(CAS) 磁場設備的降溫儀 (ABI Co., Chiba, Japan) 降溫儀應事先運轉，溫度保持在-5℃。以每分鐘下降 0.5℃的速率降溫至-32℃。故降溫時間為 54 分鐘。降溫完成後將冷凍小管直接放入-150℃冰箱冷凍保存，經冷凍保存一週後，再將冷凍小管解凍進行後續實驗。無磁場冷凍組則是將冷凍小管(Corning #430659, U.S.A.).置入冷凍保存盒 (Nalgene 5100-0001, U.S.A.) 之中，再將冷凍保存盒放入 -80℃冰箱，隔夜後 (至少經過 12 個小時) 將冷凍小管移入-150℃冰箱 (MDF-11561, Sanyo, Osaka, Japan) 中冷凍保存，經冷凍保存一週後，再將冷凍小管解凍進行後續實驗。解凍時，先將牙齒從-150℃冰箱取出。再轉移到 37℃水浴快速解凍，待瓶中固態之冷凍保存液轉為液態時取出牙齒 (約 3 分鐘) [3]。冷凍保護液分兩次稀釋到 100%培養液。牙齒冷凍組在解凍後，依前述方法取出牙髓。. 14.

(28) 5.4 外植片體活性分析 (explant viability assay). 5.4.1 外植片體活性分析實驗材料. 8 週大威斯達大鼠 (Wistar rat) 乙醚 (ethyl ether) 百分之七十濃度的乙醇 (70% ethanol) 消毒過的 2x2 公分無菌紗布 (gauze) 碳化鎢低速切割盤 (low speed carbide wheel) 拔牙箝 (dental extraction forcept) 末端無齒的組織夾 (tissue plier without teeth) 顯微組織剪 (microscopic scissor) 簽字筆 (oil based marker) 磷酸緩衝液 (phosphate buffer saline) 最低必需培養基 (DMEM/F-12 Medium) 攝氏四度的百分之十與百分之五之二甲基亞碸 (10% or 5% DMSO @4℃) 攝氏四度且含有 0.3 M 海藻醣的百分之十與百分之五之二甲基亞碸 (0.3 M trehalose and 5% DMSO，0.3 M trehalose and 10% DMSO @4 ℃) 可控溫的水浴箱 (water bath) 2 毫升冷凍小管 (cryovial) 六個空間的培養皿 (6-well culture dish) 15.

(29) 5.4.2 外植片體活性分析實驗步驟. 實驗大鼠分為牙齒整顆冷凍組與牙髓裸露組。牙齒整顆冷凍組為一端開口的大鼠門齒，而牙髓裸露組則為無牙齒硬組織包覆的大鼠門齒牙髓組織。預先製備好「5% DMSO」、「10% DMSO」、「5% DMSO + 0.3 M trehalose」與「10% DMSO + 0.3 M trehalose」冷凍保護劑並置放在 4℃冰箱。整顆牙齒冷凍組分別浸泡以上冷凍保護劑中 15 分鐘、30 分鐘與 60 分鐘。牙髓裸露組則浸泡在「5% DMSO」與「10% DMSO」中 15 分鐘、30 分鐘與 60 分鐘。浸泡前先在 2.5% DMSO， 5% DMSO， 7.5% DMSO 內過洗，再提高到各組別濃度 [58]。將處理完的牙齒與牙髓置入已標號且加入 1.3 mL 冷凍保護液的 2 mL 冷凍小管。依各組別分別以 (1)有磁場的降溫儀，(2)無磁場的冷凍保存盒進行降溫處理。最後置入 -150℃冰箱儲存一週[8]。再依前述方法解凍。以簽字筆在 6 well culture dish (Corning 3516, U.S.A.) 各個 well 背面標記 well 的中心點。以銳利的顯微組織剪在有尺規的背景下，剪取下顎門齒牙髓的牙冠 (閉口端 / coronal)、中間 (middle) 與牙根端 (開口端 / root) 三塊 1.5 mm 平方的組織塊，並以 PBS 沖洗。將牙冠、中間與牙根端的三小塊置入 6 well culture dish 內不同 well 已標記的中心位置。將 6 well culture dish 在 37℃，5% CO2 培養箱中靜置 10 分鐘。加入 0.65 mL 培養液後，再放進 37℃，5％ CO2 incubator 內培養。各個 well 每天更換 0.65 mL 的培養液。培養 8 天，以倒立顯微鏡 (Optima BI-503, Taiwan) 40× 放大倍率作紀錄，再以 Image-J 軟體測量組織塊到細胞爬離最遠的距離。每個組織團塊分 3 個位置取 16.

(30) 紀錄，以平均值作為該團塊的活性分析 [59]。(如圖二). 5.4.3 外植片體活性分析結果的統計方法. 本研究運用統計學判定，在冷凍保護劑浸泡後以有磁場或無磁場冷凍保存的變化來觀察大鼠門齒牙髓活性有無差異。所有的實驗組測定數據均與無冷凍組做比較，並以百分比形式呈現。觀察結果均以平均值 ± 標準差 (SD) 表示，主效應使用單因子變異數分析 (One-way ANOVA) 及 Scheffe' test 比較實驗組間的差異。再以雙因子變異數分析檢定 2 個自變項與 1 個應變項的交互作用。使用 SPSS13.0 版統計套裝軟體 (SPSS Inc, Chicago, U.S.A) 進行統計分析。以 p 值<0.05 表示統計學上的差異。. 17.

(31) 5.5 組織切片分析(histological analysis). 5.5.1 組織切片分析的實驗材料. 8 週大威斯達大鼠 (Wistar rat) 乙醚 (ethyl ether) 百分之七十濃度的乙醇 (70% ethanol) 消毒過的 2×2 公分無菌紗布 (gauze) 碳化鎢低速切割盤 (low speed carbide wheel) 拔牙箝 (dental extraction forcept) 末端無齒的組織夾 (tissue plier without teeth) 顯微組織剪 (microscopic scissor) 簽字筆 (oil based marker) 磷酸緩衝液 (phosphate buffer saline) 最低必需培養基 (DMEM / F-12 medium) 攝氏四度的百分之十與百分之五之二甲基亞碸 (10% or 5% DMSO @4℃) 攝氏四度且含有 0.3 M 海藻醣的百分之十與百分之五之二甲基亞碸 (0.3 M trehalose and 5% DMSO, 0.3 M trehalose and 10% DMSO @4 ℃) 可控溫的水浴箱 (water bath) Petri Dish 2 毫升冷凍小管 (cryovial) 18.

(32) 六個空間的培養皿 (6-well culture dish) 4%Paraformaldehyde @ 4℃ 10%EDTA in PBS @ 4℃ 數位 X 光機與底片. 5.5.2 組織切片分析的實驗步驟. 實驗大鼠分為牙齒整顆冷凍組與牙髓裸露組。牙齒整顆冷凍組為一端開口的大鼠門齒，而牙髓裸露組則為無牙齒硬組織包覆的大鼠門齒牙髓組織。預先製備好「5% DMSO」、「10% DMSO」、「5% DMSO + 0.3 M trehalose」與「10% DMSO + 0.3 M trehalose」冷凍保護劑並置放在 4℃冰箱。牙髓裸露組與整顆牙齒冷凍組分別浸泡以上冷凍保護劑中 15 分鐘、30 分鐘與 60 分鐘。浸泡前先在 2.5% DMSO， 5% DMSO， 7.5% DMSO 內過洗，再提高到各組別濃度 [58]。將處理完的牙齒與牙髓置入已標號且加入 1.3 mL 冷凍保護液的 2 mL 冷凍小管。依各組別分別以 (1)有磁場的降溫儀，(2)無磁場的冷凍保存盒進行降溫處理。最後置入 -150℃ 冰箱儲存一週。再依前述方法解凍。將大鼠門齒分別置於已標示的 6 well culture dish (Corning 3516, U.S.A.) 內。加入 4℃ 6 mL 4% Paraformaldehyde (Sigma P6148, U.S.A.)於 6-well culture dish 內的每個 well，每天更換且固定 2 天。再以 4°C 6 mL pH 7~7.4 的 10% ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA-2Na) (Choneye, Tawian) in PBS 每天更換且脫鈣 3~4 周 [48]。以數位 X 光機評估牙齒硬組織脫鈣是否完畢。. 19.

(33) PBS 沖洗脫鈣後的牙齒組織 2 次，轉送病理科脫水及石蠟包埋。包埋好的牙齒與牙髓石蠟塊，延中心矢狀平面 (mid-sagittal plane) 切開，故同一切片上可觀察到牙冠端與牙根端的牙髓組織。切片厚度為 2 μm。再以 Hematoxylin and Eosin (H & E) 染色。之後使用倒立顯微鏡 (Optima BI-503, Taiwan) 觀察牙冠端 (閉口端 / coronal) 與牙根端 (開口端 / root) 牙髓組織形態的差異。組織切片處理的完整方法如圖十一。. 20.

(34) 5.6 藥品製備. 5.6.1 DMEM 培養基. 實驗中所使用之培養基為 DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium) (Gibco 31600-034, U.S.A.)，提供大鼠前牙牙髓細胞生長所需之養分。配製方法為將小包裝 (可配成一公升培養基) 的 DMEM 粉末以二次蒸餾水溶解，並加入碳酸氫鈉 2.2 g / 1 L (Sigma S-5761, U.S.A.)、10% 的胎牛血清 (FBS) (HyClone SH30071, U.S.A.) 和加入 penicillin-streptomycin 10 mL / 1 L 〔10,000 units / mL penicillin ＋ 10,000 μg / mL streptomycin〕(Gibco 15140-122, U.S.A.)，以 4 N HCL 將 pH 值調整至 7.4，並以 0.2 μm 過濾膜過篩，保存在 4℃冰箱中供使用。. 5.6.2 PBS (phosphate buffered saline)溶液. PBS 為一種磷酸緩衝生理食鹽水，此種緩衝溶液以生物體內常見的離子所構成，乃無毒性之等張溶液，可作為洗淨組織與配製試藥之用。本試藥將 137 mM NaCl (J.T.Baker, U.S.A.)、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4 (J.T.Baker, U.S.A.)與 2 mM / 1 L KH2PO4 (Mallinckrodt, U.S.A.) 以二次蒸餾水溶解配製成 pH 為 7.0 的溶液，保存於 4℃冰箱中供使用。. 21.

(35) 5.6.3 10% 或 5% DMSO (Dimethyl sulfoxide) 冷凍保護劑. DMSO 為一種小分子的無色液體，其滲透力強，可增加細胞膜通透性，為常用的細胞內冷凍保護劑。配製方法為將 1 mL / 0.5 mL DMSO (Sigma, U.S.A) 加入 9 mL / 9.5 mL DMEM 培養基，保存於 4 ℃冰箱中供使用。. 5.6.4「10% DMSO + 0.3 M trehalose」或「5% DMSO + 0.3 M trehalose」. 海藻醣 (trehalose) 是由兩個葡萄糖單糖組成的白色結晶粉末，相較於其他醣類可與水分子形成較多的氫鍵，為細胞外冷凍保護劑。配製方法為將 2.84 g 海藻醣 (Fluka 90208, U.S.A.) 倒入 22.5 mL / 23.75 mL DMEM 培養基，再加入 2.5 mL / 1.25 mL DMSO (Sigma, U.S.A)，以 0.2μm 過濾膜過篩，保存在 4℃冰箱中供使用。. 5.6.5 4% 多聚甲醛 (paraformaldehyde). 多聚甲醛為一種組織固定液，可保存良好的組織結構，不會造成細胞間隙擴大現象。配 4 g / 100 mL paraformaldehyde (Sigma, U.S.A.) 之濃度前，先取 4 g paraformaldehyde 溶於 60~70 mL PBS 內，加熱至 70℃十分鐘，以 stir bar 攪拌直到完全溶解，調整 pH 到 7.2，再以 PBS 加滿到全部體積為 100 mL。待冷卻後，保存於 4℃冰箱中供使用。 22.

(36) 5.6.6 10% EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid). EDTA 是一種良好的脱鈣螯合劑，它對組織破壞極小，不產生氣泡，不影響染色。將 10 g EDTA (Choneye，Taiwan) 溶於 60~70 mL PBS 內，以攪拌棒 (stir bar) 攪拌直到完全溶解，調整 pH 到 7.4，再以 PBS 加滿到全部體積為 100 mL。保存於 4℃冰箱中供使用。. 23.

(37) 第六章實驗結果 6.1 外植片體活性分析. 6.1.1 以 5%或 10% DMSO 浸泡大鼠整顆門齒 15、30 與 60 分鐘後，在有無磁場冷凍處理下，對解凍後活性的影響. 大鼠門齒整顆浸泡 5%或 10% DMSO 冷凍保護劑後再冷凍處理。解凍後，其牙根端部位牙髓 (root) 在外植片體活性分析下與無磁場冷凍處理組作比較，以 5%或 10% DMSO 浸泡 15、30 與 60 分鐘的情況下，有磁場冷凍組的解凍後活性皆優於無磁場冷凍組 (p<0.05) (如圖二 (A) (B) (C))。不論有無磁場以 5%或 10% DMSO 浸泡大鼠整顆門齒 15、30 與 60 分鐘的情況下，牙冠端牙髓皆沒有觀察到解凍後的活性現象 (如圖二 (A) (B) (C))。無磁場冷凍下，大鼠門齒中間片段牙髓皆沒有觀察到解凍後的活性現象，但以 10% DMSO 浸泡 30 與 60 分鐘的情況下，有磁場冷凍組的中間片段牙髓會有解凍後活性現象 (如圖二 (B) (C))。以 10% DMSO 浸泡大鼠整顆門齒 60 分鐘後，其牙根端片段會有牙髓組織解凍後活性降低現象 (如圖二 (C))，而以 5% DMSO 浸泡 30 分鐘組其解凍後活性最佳 (如圖二 (B))。但在磁場冷凍下，以 5% 或 10% DMSO 浸泡 15 與 30 分鐘，其解凍後活性沒有顯著差異(如圖二 (A) (B))。以 5% DMSO 浸泡 15 分鐘在有磁場冷凍下其解凍後活 24.

(38) 性與 10% DMSO 浸泡 15 分鐘組無顯著差異，但在無磁場冷凍下 10% DMSO 顯著優於 5% DMSO 浸泡 15 分鐘組 (p<0.05) (如圖二 (A))。. 6.1.2 以 5%或 10% DMSO 浸泡大鼠整顆門齒 15、30 與 60 分鐘後，在有無磁場冷凍處理下，對牙根端片段活性的影響. 有磁場冷凍下，大鼠整顆門齒解凍後，牙根端片段活性以 10% DMSO 浸泡 60 分鐘組顯著低於 5% DMSO 浸泡 30 與 60 分鐘的組別 (p<0.05)。牙根端片段活性以 10% DMSO 浸泡 60 分鐘組也顯著低於 10% DMSO 浸泡 15 與 30 分鐘的組別 (p<0.05). (如圖三)。. 無磁場冷凍下，以 10% DMSO 浸泡 60 分鐘組顯著的低於 5% DMSO 浸泡 30 與 60 分鐘的組別 (p<0.05)。牙根端片段活性以 10% DMSO 浸泡 60 分鐘組也顯著低於 10% DMSO 浸泡 15 與 30 分鐘的組別 (p<0.05)。另一方面，在無磁場冷凍下，5% DMSO 浸泡 15 分鐘組也顯著的低於 5% DMSO 浸泡 30 分鐘或 10% DMSO 浸泡 15 與 30 分鐘的組別 (p<0.05) (如圖四)。不論是有無磁場冷凍下，以 10% DMSO 浸泡 60 分鐘會有牙根端牙髓組織解凍後活性降低現象，而以 5% DMSO 浸泡 30 分鐘後其解凍後活性最佳 (如圖三，圖四)。以 5% DMSO 浸泡 15 分鐘在有磁場冷凍下其解凍後活性與 10% DMSO 浸泡 15 分鐘組無顯著差異 (如圖三)，但在無磁場冷凍下 10% DMSO 顯著地優於 5% DMSO 浸泡 15 分鐘組 (p<0.05) (如圖四)。. 25.

(39) 6.1.3 以 5%或 10% DMSO 浸泡大鼠門齒裸露牙髓 15、30 與 60 分鐘後，在有無磁場冷凍處理下，對解凍後活性的影響. 大鼠門齒裸露牙髓以 5% 或 10% DMSO 浸泡 15、30 與 60 分鐘後再以磁場冷凍處理，其牙冠部位牙髓 (coronal) 皆有活性反應。(以 5% DMSO 浸泡 15 分鐘並以無磁場冷凍處理的組別除外，此組別的牙冠端片段沒有觀察到解凍後的活性現象) (如圖五 (A))。其他牙髓冷凍組皆有觀察到中間片段與牙根端片段活性 (如圖五 (A) (B) (C))。以 5%或 10% DMSO 浸泡 15、30 與 60 分鐘的情況下，大鼠門齒牙髓的牙根片段以有磁場冷凍處理組優於無磁場冷凍處理組。大鼠門齒牙髓中間與牙冠端片段以有磁場冷凍及 5% DMSO 冷凍保護劑的組別有最佳冷凍效果 (如圖五 (A) (B) (C))。以 5% DMSO 浸泡 30 與 60 分鐘的情況下，大鼠門齒牙髓的牙冠端片段以有磁場冷凍降溫處理組皆優於無磁場冷凍處理組，但 5% DMSO 與 10% DMSO 組之間無顯著差異 (如圖五(A)(B))。以 5%與 10% DMSO 浸泡 15、30 與 60 分鐘的組別，在有磁場冷凍處理下皆沒有顯著差異(如圖五(A)(B)(C))，但大鼠門齒牙髓牙根端片段以 10% DMSO 浸泡 60 分鐘的組別，其解凍後活性顯著低於 5% DMSO 組 (p<0.05) (如圖五(C))。. 26.

(40) 6.1.4 以 5%或 10% DMSO 浸泡大鼠門齒裸露牙髓 15、30 與 60 分鐘後，在有磁場冷凍處理下，對解凍後各片段活性的影響. 大鼠裸露牙髓組在磁場冷凍解凍後之牙髓活性以牙根端為最佳，中間與牙冠端次之 (如圖六 (A) (B) (C))。不論是牙冠片段，中間片段或牙根片段牙髓組織，以 10% DMSO 浸泡 60 分鐘會有牙髓組織解凍後活性降低現象(除了 5% DMSO 浸泡 15 分鐘組以外)，而以 5% DMSO 浸泡 30 分鐘組其解凍後活性最佳 (如圖六 (A) (B) (C))。裸露牙髓組的牙冠、中間與牙根片段，以 5% DMSO 浸泡 15 或 30 分鐘，在有磁場冷凍下其解凍後活性與 10% DMSO 浸泡 15 或 30 分鐘組無顯著差異 (如圖六 (A) (B) (C))。 (牙冠端牙髓的 Odontoblast layer 較厚，且 Odontoblast 不易從組織爬離細胞)。. 6.1.5 以 5%或 10% DMSO 浸泡大鼠門齒裸露牙髓 15、30 與 60 分鐘後，在無磁場冷凍處理下，對解凍後各片段活性的影響. 大鼠裸露牙髓組在無磁場冷凍解凍後之牙髓活性以牙根端為最佳，中間與牙冠端次之 (如圖七 (A) (B) (C))。無磁場冷凍下，以 10% DMSO 浸泡 60 分鐘組在牙根端片段其活性皆低於其他時間與濃度的組別 (除了 5% DMSO 浸泡 15 分鐘組以外) (如圖七 (A) (B) (C))。無磁場冷凍下，以 10% DMSO 浸泡 15 分鐘比 5% DMSO 浸泡 15 分鐘組為佳 (如圖七 (A) (B) (C))。. 27.

(41) 6.1.6 以 5%或 10% DMSO 添加 0.3 M trehalose 浸泡大鼠整顆門齒 15、30 與 60 分鐘後，在有無磁場冷凍處理下，對解凍後活性的影響. 使用海藻醣作為冷凍保護劑添加劑時，以「10% DMSO + 0.3 M 海藻醣」浸泡大鼠整顆門齒 30 與 60 分鐘後，大鼠門齒牙髓中間與牙冠端片段，並沒有觀察到活性現象 (如圖八 (A) (B) (C))。除了「10% DMSO + 0.3 M」海藻醣浸泡 60 分鐘組沒有顯著差異外，使用海藻醣作為冷凍保護劑添加劑時，大鼠門齒牙根端活性以有磁場冷凍處理優於無磁場冷凍處理 (如圖八 (A) (B) (C))。「5% DMSO + 0.3 M」海藻醣在有磁場冷凍處理下不論浸泡時間多長其牙根端片段活性皆顯著優於無磁場冷凍 (p<0.05) (如圖八 (A) (B) (C))。有磁場冷凍下，以「5% DMSO + 0.3 M」海藻醣浸泡 30 分鐘會顯著優於以「10% DMSO + 0.3 M 海藻醣」浸泡 30 分鐘 (如圖八 (B)). 6.1.7 有無使用海藻醣添加劑浸泡大鼠整顆門齒，在磁性冷凍處理下，對整顆大鼠門齒解凍後活性的影響. 添加 0.3 M 海藻醣在 5%或 10% DMSO 冷凍保護劑並浸泡大鼠整顆門齒 30 與 60 分鐘後，在有磁場冷凍處理下，大鼠牙髓中間與牙冠端片段，並沒有觀察到活性現象 (如圖九 (B) (C))。但以沒有添加 0.3 M 海藻醣的 10% DMSO 浸泡大鼠整顆門齒 30 與 60 分鐘的情況 28.

(42) 下，有磁場冷凍組的牙髓中間片段會有牙髓活性現象 (如圖九(B) (C))。整顆牙齒冷凍下，牙根端片段以沒有添加海藻醣的 10% DMSO，浸泡 15 與 30 分鐘的情況下皆優於有添加海藻醣的 10% DMSO 組別 (如圖九 (A) (B))。沒有添加海藻醣的 5% DMSO 浸泡 30 與 60 分鐘的情況下優於有添加海藻醣的 5% DMSO 之解凍後大鼠門齒牙根端活性結果 (如圖九 (B) (C))。在浸泡 60 分鐘的組別中，使用 5% DMSO 顯著優於相同浸泡時間下的其他冷凍保護劑組別 (p<0.05) (如圖九 (C))。. 6.1.8 有無使用海藻醣添加劑，在無磁場冷凍處理下，對整顆大鼠門齒解凍後活性的影響. 無磁場冷凍下，添加 0.3 M 海藻醣在 5% 或 10% DMSO 冷凍保護劑中並將大鼠整顆門齒浸泡 30 與 60 分鐘後，大鼠牙髓中間與牙冠端片段，並沒有觀察到活性現象 (如圖十 (B) (C))。整顆牙齒在無磁場冷凍下，以 10% DMSO 添加 0.3 M 海藻醣其解凍後牙根端活性皆劣於其他冷凍保護劑組別 (如圖十 (A) (B) (C))。而 5% DMSO 添加 0.3 M 海藻醣其解凍後牙根端活性也與 5%或 10% DMSO 浸泡 15 與 30 分鐘的組別無顯著差異 (如圖十 (A) (B) (C))。 5% DMSO 浸泡 60 分鐘組解凍後大鼠門齒牙根端活性顯著優於相同浸泡時間下的其他冷凍保護劑組別 (p<0.05) (如圖十 (C))。. 29.

(43) 6.2 組織切片分析. 大鼠門齒整顆牙齒進行冷凍解凍後，大鼠門齒牙冠端 (coronal) 的組織結構在無磁場冷凍組有組織裂解的現象，但大鼠門齒牙根端 (root) 的組織結構，不論是有無磁場冷凍，沒有觀察到組織裂解的現象 (如圖十三 (A)、圖十四(A) 與圖十五(A))。整顆牙齒進行冷凍解凍後，以添加海藻醣和沒有磁場冷凍組可觀察到明顯組織裂解現象 (如圖十三 (B)、圖十四(B) 與圖十五(B))。大鼠門齒裸露牙髓進行冷凍解凍後，牙冠端的組織結構，在沒有硬組織包覆的情況下並沒有組織裂解增加的現象 (如圖十六 (A)、圖十七 (A) 與圖十八 (A))。與整顆牙齒冷凍組相同，添加海藻醣和沒有磁場冷凍組可觀察到明顯組織裂解增加現象 (如圖十六 (B)、圖十七 (B) 與圖十八 (B))。磁性冷凍下，增加冷凍保護劑接觸面積，可提升對大鼠門齒的牙髓冷凍解凍後之組織完整性。. 30.

(44) 第七章討論. 7.1 外植片體活性分析. 7.1.1 外植片體活性分析的檢測方法. 外植片體活性分析可被使用在體外 (in-vitro) 評估組織或器官對毒性、生長因子及荷爾蒙的反應，也可以用來評估生長能力、分化能力、組織的健康狀況與解凍後的活性反應 [59-62]。本研究所採用的外植片體活性分析 (explant viability test) 與 Price [59] 和 Takashima [63] 所使用的 protocol 不同。這兩位學者提出的方法皆添加組織分解素 (dispase 或 trypsin) 促使纖維母細胞游離出組織團塊。本研究與 Price [59] 和 Escande-Beillard 在 Primary fibroblast culture from tissue biopsies 所使用的 protocol 相同，都不加入組織分解素。本研究所採用的外植片體活性分析法為較嚴苛的檢測方法。即便本實驗的牙髓組織在冷凍後仍具有活性，當纖維母細胞不具有足夠活力爬出組織團塊，就不會被檢測出正向實驗結果 [即外植片體活性分析結果為零]。本研究所採用的檢測方法不但細胞要存活－“Alive”`，也必須保有足夠功能－“Function”。文獻上指出 3~4 天就可以看到細胞爬離組織團塊 [64]，從組織團塊爬出的纖維母細胞 9~12 天會聚滿 (confluence) [65]。而組織經過冷凍後，其細胞爬離速度較慢，因此本實驗統一採取在培養 8 天後 31.

(45) 才進行外植片體活性分析的測量，並維持每天更換新鮮培養液以求實驗數據的一致性。. 7.1.2 磁性冷凍下，冷凍保護劑浸泡濃度與時間的影響. DMSO 為具有細胞毒性的冷凍保護劑，但組織與細胞最大的不同為組織具有厚度。而牙齒硬組織的包覆更降低冷凍保護劑的滲透。找出適當的冷凍保護劑之使用濃度與浸泡時間一直是冷凍科學的一大難題。Fahy [66] 嘗試以> 6 M 的冷凍保護劑來冷凍保存器官，但因濃度太高而失敗。因為器官與組織有厚度，當冷凍保護劑滲透到內部組織時，其內部濃度會比外圍濃度低 [67]，所以在當時無法避免使用高濃度冷凍保護劑來達到器官與組織的冷凍保存。本研究的實驗數據顯示，在有磁場冷凍下整顆牙齒以 10% DMSO 浸泡 60 分鐘組的活性顯然較低 (如圖三)，而 5% DMSO 浸泡 30 分鐘組的活性雖然為最佳，但與浸泡 15 分鐘組無顯著差異 (如圖三)。文獻上也指出冷凍保護劑浸泡時間太短會有組織滲透不易的問題，太長則會降低組織活性的現象。故理想的冷凍保護劑浸泡，應選擇浸泡時間短但有效者，以避免冷凍保護劑毒性 [68]。本研究顯示，在磁場冷凍下，整顆牙齒以 5% DMSO 浸泡 15 分鐘為最理想的組合。 1950 年 Workman-Reynolds 指出當水分子聚集成冰晶的過程會有微弱的電流產生，此現象稱為 Workman-Reynolds effect [69]。後來 Muldrew [70] 認為此微弱的電流會破壞細胞膜的磷脂質所組成的雙層架構 (phospholipid bilayers) 並造成細胞在冷凍過程的傷害。已知利用磁場來產生玻璃化可以避免冰晶形成 [12]。是否玻璃化也可以 32.

(46) 減少此一電流的產生且避免細胞膜的破壞，則為文獻上尚未被討論的議題。本研究顯示有磁場冷凍組皆優於無磁場冷凍組，故推測以磁性冷凍避免冰晶形成與防止細胞膜因冷凍時所產生的破壞有關 (如圖二)。本研究所使用的檢測方法為分段式的活性測量方法 (分牙冠、中間與牙根端片段)，與文獻上將牙齒冷凍後，整個牙髓放入組織分解素來檢測牙髓整體活性的方法不同 [46] [71]。牙髓為長條狀組織，僅有一端開口。將牙髓前後段一起培養無法分辨具有活性的一端與不具有活性的一端，不易客觀評估實驗結果。本研究觀察到，不論是有無磁場冷凍整顆牙齒後，牙根端 (Root) 牙髓為皆有活性 (如表一，表二)。整顆牙齒在無磁場冷凍下，中段牙髓在浸泡冷凍保護液 60 分鐘的組別沒有顯示活性。而以 10% DMSO 浸泡 30 或 60 分鐘後再以磁場冷凍整顆牙齒的組別有顯示中段牙髓 (middle) 冷凍後活性 (如圖二 (B) (C))。DMSO 在哺乳類的組織滲透速度為 2 x 10-5 cm/s ~ 3 x 10-5 cm/s [43]，也就是約 1.2 mm/hr。此距離在本實驗設計上是難以到達中間片段 (牙根端片段約為 1.5 mm)。整顆牙齒冷凍解凍後的中段牙髓 (middle) 所顯示之正向活性，則可能是因為磁場效應降低此區段冰晶的形成並保留其解凍後活性。任何生物組織從生物體上移除時，由於缺乏血流的滋養，其活性都會隨時間有降低的現象。所以整顆牙齒浸泡冷凍保護劑 60 分鐘後其活性也有降低現象 (如圖三，圖四)。然而在浸泡 60 分鐘的組別中，10% DMSO 組的活性又比 5% DMSO 組為低，據此推測 10% DMSO 相較於 5% DMSO 呈現較高的細胞毒性 (如圖三，圖四)。文獻上也指出，當冷凍保護劑濃度大於 1 mol/L 時就會對細胞造成傷害 33.

(47) [72]，亦即當 DMSO 濃度大於 7.8% 時就會對細胞有負面影響，且濃度高者毒性較大 [73]，本實驗結果與其相呼應。. 7.1.3 磁性冷凍下，冷凍保護劑接觸面積對牙髓活性的影響. 細長型的牙髓其外面包覆著緻密的硬組織，而位在細長軟組織一端的牙根尖開口負責血液與神經和外界交流。由於牙齒的形成是由牙胚、牙冠形成到牙根尖慢慢閉合。只有在牙根端與冷凍保護劑會有接觸。Laureys [57] 認為，人為的牙根尖開口加大可幫助牙齒的冷凍保存。Laureys 研究牙根未閉合的牙齒與牙根尖切除 (Apicoectomy) 過的已閉合牙齒。這兩組牙齒經過冷凍保存處理後，其再植成功率相似 [57]。雖然所研究的 sample 數量不多 (16 顆)，但仍足以顯示，牙根尖切除術可以增加冷凍保護劑與牙髓的接觸面積，且增加冷凍保護劑滲透效果，用以減少浸泡時間來達到更佳的牙髓解凍後活性。本研究所採用的大鼠門齒牙髓也是一細長圓錐狀軟組織，其外層包覆緻密的硬組織且只有一端開口。結果顯示，當移除包覆門齒牙髓的硬組織可以增加冷凍保護劑的接觸面積，也可以增加牙冠端牙髓組織冷凍解凍後的活性 (如圖五，表一)。文獻上將整顆牙齒冷凍後發現牙周韌帶解凍後成功率比牙髓為佳 [13] [8]。本實驗結果也可以間接推測，如果在採集牙髓樣本時沒有取得牙根端組織，其測量的成功率就會降低 [46, 74]。亦可合理推測，本研究團隊未來對牙髓取得應著重在牙根端片段。依此法施行，其解凍後可培養出牙髓細胞的成功率應可超過 73% [8]，並得到更佳的實驗結果。 34.

(48) 如果以整顆牙齒冷凍的方式儲存者，未來在萃取牙髓組織與幹細胞時，可以縮小樣本收集的範圍，僅採集牙根端片段即可。此方法也可以避免在取得整個牙髓組織的過程中過度破壞牙齒硬組織。基於道德規範理由，人體試驗前應先施行動物實驗，希望本實驗的發現可作為未來人類牙齒實驗的依據。. 7.1.4 海藻醣冷凍保護劑. 本研究觀察到，以整顆牙齒冷凍並添加海藻醣冷凍保護劑的情況下，僅有牙根端片段有活性表現 (如圖八)。而整顆牙齒冷凍並添加海藻醣冷凍保護劑的情況下，牙根端片段活性以有磁場冷凍組皆優於無磁場冷凍組 (如圖八)。以整顆牙齒冷凍的方法，同樣在有磁場冷凍下，牙根端片段活性以不添加海藻醣組優於添加海藻醣組 (如圖九)。加上組織切片實驗也顯示添加海藻醣的組別其組織裂解現象較明顯，可推測磁場物理性抑制冰晶的效果與海藻醣的作用方式不同。海藻醣為大分子的醣類，添加海藻醣會增加冷凍保護劑的黏稠度，也就是降低其水分子間的鍵結以促進玻璃化 [75]。但增加黏稠度也會促使含水量高的牙髓組織脫水，並推測會降低冷凍保護劑整體的滲透效率。所以本實驗在添加海藻醣後，以整顆牙齒冷凍的方法下，大鼠門齒牙髓中間片段並沒有觀察到解凍後活性現象 (如圖九)。海藻醣具備安定蛋白質與酯雙層 (lipid bilayer) 的效果 [76]，但其最佳作用方式是存在於細胞膜的兩側 [77]。由於高等動物無法自行產生海藻醣，加上海藻醣無法穿透細胞膜，故 Odintsova 利用胰島 35.

(49) 組織 (pancreatic islets) 在 5~9℃會增加細胞膜通透性的特質，利用 0.3 M 海藻醣與 11% DMSO 兩種冷凍保護劑來提升胰島組織冷凍保存的效果 [39]。另外有學者提出海藻醣可以防止細胞過分脫水 [78]，但 Papaccio [79] 指出人類牙髓組織為含水量較多的結締組織，其內部實驗發現添加海藻醣並不會增加牙髓組織冷凍後的活性。本實驗結果觀察到，不論有無磁場冷凍下添加 0.3 M 海藻醣冷凍保護劑保存整顆牙齒，與相同濃度 DMSO 不添加海藻醣的組別作比較，大鼠牙根端牙髓活性沒有更佳的效果 (如圖九，圖十)。. 36.

(50) 7.2 組織切片分析. 根據 Rabin 對冷凍處理後的組織形態研究，發現經過冷凍處理後的組織容易在細胞與細胞間出現大型的空腔現象。因冷凍處理而出現在組織裡的空腔會造成細胞死亡，而所破壞組織之完整性與解凍時堆積細胞外液體更會造成後續的組織裂解 [80]。此種裂解現象容易發生在不同組織組成的介面上，但不同組織組成的介面也往往是停止組織裂解擴大的地方。本研究所觀察到的組織裂解部位往往出現在不同組織組成的介面上 (以大鼠門齒而言，此介面為大鼠門齒的軟硬組織交界面)，此現象也與 Rabin 的研究相同 (如圖十二右下)。血管的組織切片也會形成組織中的空腔現象，所以常常會被誤判為冷凍處理時所產生的裂解。但血管的空腔邊界往往為平滑且顏色較深 (如圖十二左下)，而因冷凍處理產生的裂解，其邊界往往為不規則的形態 (如圖十二右上) [81]。磁性冷凍下是否會造成組織物理性的裂解，是文獻上尚未被討論到的議題。本研究發現，以整顆大鼠門齒冷凍後切片處理，大鼠門齒牙根端組織沒有觀察到裂解現象，但於牙冠端則有裂解增加現象 (如圖十二)。大鼠門齒牙髓冷凍組的牙冠端相較於整顆牙齒冷凍組有冰裂減少現象 (如圖十三、圖十四、圖十五與圖十六、圖十七、圖十八)。上述結果均顯示有磁場冷凍組的組織裂解較少，可證明磁性冷凍能有效地抑制冰晶形成的物理方法，並減少組織因機械性的空腔增大而破壞組織的完整性 (如圖十二)。 37.

(51) 海藻醣為大分子的冷凍保護劑，與其他醣類相比在相同體積下可以與水分子形成較多的氫鍵 (可以捉住較多的水分子)。相同濃度下，海藻醣所佔體積是其他醣類的 2.5 倍，所以比較黏稠 [82]。較大的親水性與黏稠度在慢速冷凍下可能會造成組織過度脫水，並破壞組織間的相對關係，形成切片上的空腔現象。本研究也觀察到，組織裂解現象以添加海藻醣的組別較多 (如圖十三(B)、圖十四(B) 與圖十五(B))。. 38.

(52) 第八章結論. 本研究顯示，磁性冷凍下，增加冷凍保護劑接觸面積時，可降低 DMSO 濃度與縮短浸泡時間，而能有效提升整顆牙齒冷凍解凍後牙髓活性與組織形態的完整。添加海藻醣對大鼠門齒牙髓組織冷凍保存沒有幫助。此一結果可作為日後牙齒儲存應用的重要參考。. 39.

(53) 第九章參考文獻. 1.. 2. 3. 4.. 5. 6.. 7.. 8.. 9. 10. 11. 12.. Kaku, M., et al., Cryopreservation of PDL cells by use of program freezer with magnetic field for teeth banking. Dentistry in Japan, 2007. 43: p. 82-86. Nanci, A., Ten Cate's oral histology: development, structure, and function. 2008: Mosby Inc. Andreasen, J., Atlas of replantation and transplantation of teeth. 1992: WB Saunders Company. Gronthos, S., et al., Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(25): p. 13625-13630. Gronthos, S., et al., Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J Dent Res, 2002. 81(8): p. 531-535. Papaccio, G., et al., Long-term cryopreservation of dental pulp stem cells (SBP-DPSCs) and their differentiated osteoblasts: a cell source for tissue repair. J Cell Physiol, 2006. 208(2): p. 319-25. Arora, V., P. Arora, and A.K. Munshi, Banking stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED): saving for the future. J Clin Pediatr Dent, 2009. 33(4): p. 289-294. Lee, S.Y., et al., Effects of cryopreservation of intact teeth on the isolated dental pulp stem cells. Journal of Endodontics, 2010. In press. Mazur, P., Principles of cryobiology. Life in the Frozen State, 2004: p. 3-66. Mazur, P., Cryobiology: the freezing of biological systems. Science, 1970. 168(934): p. 939-949. Day, J., et al., Conservation of bioresources at ultra low temperatures. 2008: p. 917-947. Rohatgi, P., S. Jain, and C. Adams Jr, Effect of magnetic and electrical fields on dendritic freezing of aqueous solutions of sodium chloride. Materials Science and Engineering, 1974. 15(2-3): p. 283-290. 40.

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(60) 第十章實驗圖表. 圖一: 外植片體活性分析法實驗流程圖. 47.

(61) A. 100. * *. * Explant Viability (%). 80. 60. 40. 20. No outgrowth. No outgrowth. 0 無磁凍有磁凍無磁凍有磁凍 5%DMSO 5%DMSO 10%DMSO 10%DMSO. Coronal. 無磁凍有磁凍無磁凍有磁凍 5%DMSO 5%DMSO 10%DMSO 10%DMSO. 無磁凍有磁凍無磁凍有磁凍 5%DMSO 5%DMSO 10%DMSO 10%DMSO. Middle. Root. *: the note indicates statistically significant (p<0.05) among the groups. B. *. *. *. *. 100. * *. Explant Viability (%). 80. 60. 40. 20. No outgrowth 0 無磁凍有磁凍無磁凍有磁凍 5%DMSO 5%DMSO 10%DMSO 10%DMSO. Coronal. 無磁凍有磁凍無磁凍有磁凍 5%DMSO 5%DMSO 10%DMSO 10%DMSO. Middle. 無磁凍有磁凍無磁凍有磁凍 5%DMSO 5%DMSO 10%DMSO 10%DMSO. Root. *: the note indicates statistically significant (p<0.05) among the groups. 48.