研究目的與方法

PAA 長度和加熱方式等對 SiO2表面PAA 修飾量的影響。其次針對最 佳PAA 修飾量的 SiO2顆粒，觀察其對lysozyme 吸附脫附現象與溶液 環境的關係，主要研究的參數為pH 值和離子強度的影響。研究最後，

乃是參考PAA 官能基化 SiO2粒子的研究結果，將毛細管柱內壁以 PAA 加以修飾，實際進行 lysozyme 的濃縮研究，並與未修飾的管柱 進行比較。

第二章 實驗材料與方法

Potassium dihydrogen

phosphate Merck 99% 136 Dipotassium hydrogen

phosphate Merck 99% 174 Poly(acrylic acid) Aldrich 35% 250000 Poly(acrylic acid) Aldrich 99% 1800 3-Aminopropyl-trimethoxy

silan(APTMS) Aldrich 97% 179

Lysozyme Sigma >95% 14300 Sodium chloride Showa 99% 58

Acetonitrile Mallinckrodt

Chemicals 99% 41 Dichloromethane Fluka 99% 84 N,N-Dimethylformamide Echo 99% 73

Silica gel (63 - 200 μm) Merk 99% 60 Silica gel (5 - 20 μm) Merk 99% 60

實驗中所使用的蛋白質lysozyme溶液的配置方法為：取30 mg的

lysozyme在10 mL定量瓶中以去離子水或10 mM已調整pH值的緩衝溶 液稀釋到刻度，配置成3000 ppm的濃度，配置完成的溶液放置於冰箱 中保存，等待後續實驗使用。其餘溶液的配置方式，將在實驗方法中 敘述之。

2.2 儀器裝置

傅氏轉換紅外線光譜儀(FT-IR)：PerkinElmer Spectrum RXI FT-IR，使 用前先將樣品與乾燥KBr 粉末依 1/20 到 1/50 比例置於研缽中研磨成 細粉，再置入油壓打片機中打片成形，最後放入紅外線光譜儀中測 量，量測範圍由400 cm^-1到4000 cm^-1。

熱重分析儀(TGA)：LABSYS^TM SETARAM Thermograimetric

Analyzer，取 0.02 g 的乾燥樣品在氮氣下以 5 ^oC/min 的加熱速率由 25

oC 加熱到 800 ^oC。

元素分析儀(EA)：PerkinElmer 2400 SeriesⅡCHNS/O Analyzer，取約 0.002 g 的乾燥樣品以鋁箔杯承載後揉成球狀並紀錄重量，在機器 CHN 模式下分析各元素含量，以重量百分比表示。

高效率液相層析儀(HPLC)：Hitachi D-7100、Hitachi D-4500，分離層 析管柱Thermo BDS Hypersil(3.0 mm ID)，流速 0.7 mL/min，使用前

先以D-4500 系列 HPLC 的 diode array detector(DAD)了解分析物最大 吸收波長以後，再使用D-7100 HPLC/UV 來做定量分析，實驗中蛋白 質偵測UV 波長設定在 280 nm。

毛細管電泳儀(CE)：BeckmanCoulter P/ACE MDQ，偵測器搭配 photo diode array detector 可同時紀錄時間波長跟吸收度等三維資料，資料 處裡和收集是藉由32 Karat Software 來達成。

微波加速反應系統(Microwave)：CEM MARS-5，取適量反應溶劑和 欲反應SiO2顆粒於鐵氟龍反應瓶中密封，放入微波腔體後，調整輸 出功率在300w 以及適當的時間來合成材料。

液相層析質譜儀(LC-MS)：Micromass Q-TOF liquid

chromatography-mass spectrometer，ESI 游離源，正電模式，以注射針 幫浦控制流速在90 μL/h 下連續注射樣品。

三次，離心抽乾後放置烘箱中以100 ^oC乾燥24小時準備後續實驗使 用。自烘箱中取經洗淨乾燥後0.8 g的SiO2加入含有1.92 mL APTMS和 7.68 mL toluene的溶液中攪拌均勻，再將此混合物移至100 mL的三頸 瓶中，在氮氣的保護下以110 ^oC迴流24小時。反應結束後利用toluene 清洗產物SiO2@APTMS三次，去除未反應之APTMS，再以CH2Cl2清 洗產物兩次置換toluene，抽乾後放入烘箱以100 ^oC乾燥24小時後準備 下一階段使用。

取0.4 g SiO2@APTMS 和 0.4 mL PAA 溶液以及 6 mL DMF 混合攪 拌均勻後加入100 mL 的三頸瓶，在氮氣的保護下以 150 ^oC 迴流 24 小時。反應完成以DMF 清洗產物三次，去除未鍵結 PAA 分子，離心 抽乾後再以MeOH 清洗產物 SiO2@PAA 兩次置換 DMF，最後抽乾並 放入烘箱中以100 ^oC 乾燥 24 小時。

OH Si NH

₂

@APTMS Poly(acrylic acid)

DMF

之APTMS，再以CH2Cl2清洗產物兩次置換toluene，抽乾後放入烘箱

中以100 ^oC乾燥24小時。

PAA 溶液注滿，再以 septum 密封，在微波功率 300w 下反應 10 分鐘，

反應完成後再以methanol 清洗毛細管，並放入烘箱中乾燥。

2.3.3 蛋白質的吸附脫附

SiO2@PAA顆粒對蛋白質的吸附脫附量是藉由材料和蛋白質溶液 接觸一段時間後，將溶液離心抽取上層澄清的溶液，以HPLC/UV定 量分析剩餘在溶液中蛋白質的濃度來推算。實驗前先利用不同濃度標 準的lysozyme溶液製作檢量線，檢量線濃度範圍從10 ppm – 3000 ppm，此檢量線R² = 0.9979，重複七次計算分離方式再現性在樣品濃 度為100 ppm時，訊號滯留時間的RSD = 1.2%訊號面積RSD = 0.6%。

第三章 結果與討論

由於SiO2@PAA在蛋白質萃取應用上，其效果應與PAA在SiO2表 面的修飾量有直接的關係，因此本研究首先比較分析以傳統加熱和微 波加熱方式所得的SiO2@PAA於修飾量上有何不同。SiO2@PAA表面 修飾的定性和定量分析乃是藉助IR、EA和TGA資料的比較。IR光譜 可用來快速判斷SiO2表面經APTMS或PAA反應後有無化學鍵的形 成，EA或TGA則可用來分析修飾量的多寡。傳統材料表面分析可使 用SEM或TEM探討表面型態(morphology)的變化，在本研究中並未使 用。

SiO2@PAA於蛋白質純化上的應用研究中，我們比較了不同PAA 鏈長對蛋白質的吸脫附現象，針對相同鏈長則比較溶液離子強度和pH 值的影響。統整分析離線實驗結果後，選取最佳條件進一步以微波加 熱法於SiO2毛細管內壁修飾PAA，觀察修飾前後的毛細管對lysozyme 的吸附脫附能力有何不同。

3.1 SiO

2

@PAA合成條件與修飾量的關係

表面官能基化的變化，乃選用IR 光譜追蹤 SiO2表面化學鍵結的變化。

首先觀察三種不同粒徑，未經任何修飾的SiO2顆粒IR 圖，發現 任一種粒徑皆有三個明顯的吸收峰(圖 3-1)，分別來自 SiO2上 O-H 的 stretching(~ 3490 cm^-1)和 Si-O stretching(~ 1648 cm^-1和~ 1100 cm^-1)。

圖 3-1 不同顆粒大小 SiO2的IR 圖：(A) 7 nm；(B) 20 μm；(C) 200 A

Intensit y

B

C

Wavenumber (cm ^-1 )

μm。

當SiO2與APTMS進行反應時，於反應時間4小時、12小時、24小 時所分離的產物以IR進行分析。發現反應4小時後於~ 2939 cm^-1有新 的吸收峰生成(圖3-2)，此一吸收峰可能源自APTMS上的C-H

stretching，隨著反應時間的增加2939 cm^-1、694 cm^-1位置的alkyl chains 特徵吸收峰強度隨著增加。同時原屬於未修飾SiO2表面O-H stretching 的吸收峰3490 cm^-1，其強度隨著反應時間的增加而降低，由於加熱12 小時和24小時產物的IR圖無明顯的差異，我們認為以傳統加熱方式合 成SiO2@APTMS時，在所選用的粒徑下加熱12小時即可。此外為了進 一步驗證所觀察到IR圖中吸收峰的變化，的確為表面化學鍵結的產 生，乃將SiO2與APTMS直接混合研磨後進行IR分析。發現以物理混合 SiO2和APTMS的IR光譜除了SiO2原有的三個特徵峰(~ 3490 cm^-1、~

1648 cm^-1和~ 1100 cm^-1)以外，還可以觀察到代表APTMS上C-H鍵 stretching和alkyl chains的特徵峰(~ 2922 cm^-1、~ 1548 cm^-1、~ 1456 cm^-1 和684 cm^-1)(圖3-3(C))，並由物理混合與實際化學反應產物間，IR吸收 峰的偏差可以證實，經反應後我們所得到的產物確實為化學鍵鍵結，

而非物理性的吸附或未清洗乾淨的殘留物。

A

Intensit y

B

C

D

Wavenumber (cm ^-1 )

圖3-2 傳統加熱法合成SiO₂@APTMS不同反應時間所得產物IR圖：(A) 未修飾的SiO₂；(B) 反應4小時；(C) 反應12小時；(D) 反應24 小時。

A

Intensit y

B

C

Wavenumber (cm ^-1 )

圖3-3 物理混合 APTMS 與 SiO₂的IR 光譜圖：(A) 未修飾的 SiO₂； (B) 純 APTMS；(C) SiO₂物理混合APTMS。

若將PAA與APTMS和SiO2進行物理混合(圖 3-4(C))，可發現SiO2

SiO2@PAA的IR圖，由於PAA中帶有許多的C=O官能基，而其中會與 SiO2@APTMS形成鍵結的數目應遠小於未鍵結的羧基，我們預期 SiO2@PAA的IR圖將會與物理混合的結果相似。

IR 光譜上特徵峰強度較其他三種 SiO2@PAA 都來的小且不明顯(圖 3-6(A))。由於 Mw 250000 PAA 分子量比 Mw 1800 大了許多，因此以 Mw 250000 PAA 合成所得 SiO2@PAA 有較強的特徵峰訊號並不代表 其修飾量較大，但相同的以Mw 1800 PAA 修飾 20 μm 和 200 μm SiO2

為基材的SiO2@PAA 卻顯示，較小的粒徑其 PAA 修飾量較低，這與 原先預期較小粒徑能有較大的表面積而提供較多修飾量不符，還必須 進一步以其他光學儀器探討原因，由於無法單純從IR 圖上判別 PAA 修飾量的多寡，因此後續進一步以EA 和 TGA 進行分析探討，結果 將在後續討論。

A

Intensit y

B

C

Wavenumber (cm ^-1 )

圖3-4 物理混合 IR 光譜圖：(A) 未修飾的 SiO₂；(B) SiO₂物理混合 APTMS；(C) SiO₂物理混合APTMS 與 PAA。

A

Intensit y

B

C

Wavenumber (cm ^-1 )

圖3-5 傳統加熱法下修飾PAA產物IR圖：(A) 純的SiO₂；(B) 經APTMS 修飾；(C) 經PAA修飾的SiO₂。

A

Intensit y

^B

C

D

Wavenumber (cm ^-1 )

圖3-6 傳統加熱法下修飾4種不同種類SiO₂@PAA的材料：(A) 20 μm SiO₂@PAA 1800；(B) 200 μm SiO₂@PAA 1800；(C) 20 μm SiO₂@PAA 250000；(D) 200 μm SiO₂@PAA 250000。

為了進一步確認IR圖中1713 cm^-1的吸收峰乃源自於PAA，乃將 SiO2@PAA以0.1 N NaOH溶液加以水解，以切斷APTMS和SiO2之間的 Si-O-Si鍵。若水解後的IR圖與未修飾的SiO2 圖相似，則可以支持1713 cm^-1來自於SiO2@PAA表面的PAA。經過NaOH溶液清洗後的

SiO2@PAA IR圖中已無1713 cm^-1的訊號顯現(圖3-7(C))，2939 cm^-1強 度也較未清洗前降低，間接證實預期的SiO2@PAA確實是一表面有 PAA修飾的SiO2基材，此外上述實驗結果也意味著未來在SiO2@PAA 材料的應用上，應該避免置於鹼性過強的溶液。

A

Intensit y

B

C

Wavenumber (cm ^-1 )

圖3-7 SiO₂@PAA經NaOH溶液清洗：(A) 純的SiO₂；(B) SiO₂@PAA；

(C) 經0.1 N NaOH清洗的SiO₂@PAA。

為了克服IR圖無法提供有關SiO2@APTMS或SiO2@PAA修飾量的 問題，我們改用EA和TGA探討在不同合成條件下SiO2基材表面修飾 量的變化，首先針對研究中所用的20 μm和200 μm SiO2基材以EA進行 分析，觀察到兩者雖然經過清洗皆有約0.1.%左右的含碳量(表3-1)，

這些背景值可能是空氣中自然吸附於顆粒表面的有機物，或是SiO2本 身內部的雜質。隨後分析不同合成條件所得的SiO2@APTMS發現，其 碳氫氮的比例都提高了，合乎SiO2基材表面與APTMS鍵結的預期，也 和圖3-5(B)IR的結果一致。

為了得知SiO2@APTMS中APTMS的修飾量，乃將SiO2@APTMS 以EA分析所得%C、%H、%N數值扣除背景後，將%N乘以分析物總 重來得氮原子總重，進一步換算成氮原子的莫耳數；由於SiO2基材不 含氮而APTMS分子中只含有一氮原子，所以氮原子的莫耳數也等同 於APTMS分子的莫耳數，以APTMS的莫耳數換算出其重量，再除以 SiO2@PAA樣品總重則可推導出SiO2顆粒上APTMS的修飾量。此外由 於APTMS具有3個-OCH3基可與SiO2基材反應，依據EA實驗所得與理 論值比對，可推算出3個-OCH3基中平均有多少個-OCH3基可與SiO2形 成化學鍵(圖1-14)；每一種方式都會使最後碳氫氮元素比例不同。理 論值的計算是假定在EA燃燒SiO2@APTMS樣品的過程中，打斷所有 APTMS碳氫氮氧原子間的鍵結只留下SiO2和APTMS間的Si-O-Si鍵，

經理論推得三種方式會在EA中得到的比例和實際讀值比例比較結果 如表3-2，理論上APTMS與SiO2顆粒縮合時脫去的-OCH3基越多則碳 和氮所占的比重也越重，結果發現實際值與理論值間存在有誤差，無 法直接藉由這樣的方式確定元素間比例和了解APTMS分子可能的反 應方式，誤差的來源有可能是無法忽略的表面污染物或是儀器的誤差 導致，必須再以其它儀器的數據輔以說明。但若忽略上述的誤差可推 得，不論APTMS以何種方式與SiO2鍵結，在傳統加熱法下SiO2和 APTMS分子的比例約為10:1，意味在傳統加熱法下200 μm的SiO2每10

在文檔中 SiO2@PAA粒子的合成與其吸附脫附蛋白質能力的探討 (頁 34-0)