胺基酸序列分析 - 香蕉果實後熟相關基因MhDnaJ之啟動子活性與基因功能分析

將 MhDnaJ 胺基酸序列，以 predictprotein 網站資料庫 (https://www.predictprotein.org/) 預測二級結構。

pMACS38

Fig. 3. The construction

strategy

of plasmid pGKU35STJgfp for protein localization analysis.

GFP: Green fluorescence protein. GUS: β-glucuronidase protein. LB:

Left border. NPTII: neomycin phosphotransferase II gene. P: CaMV 35S promoter. 2 X P: 2-times CaMV 35S promoter. RB: Right border. T: nopaline synthase terminator sequence. TL: tobacco etch virus translation enhancer.

GUS P

Fig. 4. Schematic diagram of the plasmids for MhDnaJ gene function analysis.

(A) Overexpression. (B) and (C) Gene silencing. (D) Protein localization. (E) Promoter activity. GFP: Green fluorescence protein. GUS: β-glucuronidase protein. LB: Left border. mCherry: modify cherry fluorescence protein. NPTII:

neomycin phosphotransferase II gene. P: CaMV 35S promoter. 2 X P: 2-times CaMV 35S promoter. pA: CaMV 35S polyA terminator. PU6: At-C5-U6 snRNA gene promoter. RB: Right border. T: nopaline synthase terminator sequence. TL:

tobacco etch virus translation enhancer. Bars = 1 Kb.

(A)

(B)

(C)

(D)

(E)

(二) 轉殖質體之構築

1. 質體 DNA 之小量製備

質體 DNA 之小量製備方法，係修改自 Sambrook (1989) 所提出之方法。挑取單一菌落接種於5 mL 含抗生素 (50 μg/mL kanamycin or ampicillin ) 之LB [10 g/L bacto-tryptone, 5g/L bacto-yeast extract, 5 g/L NaCl (pH 7.5)] 液體培養基，於37℃以 120 rpm 旋轉培養 12-16 小時，取 1.5 mL 菌液倒入微量離心管，於室溫下以13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 1 分鐘，倒去上清液，再重複一次。加入 400 μL STET [8% sucrose, 50 mM Na2EDTA, 5% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)] 與 30 μL 10 mg/mL Lysozyme [in TEN: 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM Na2EDTA]，混合均勻後於室溫下反應 10 分鐘，以沸水處理 1 分鐘，立即置於冰上，於4℃以 13,200 rpm 離心 30 分鐘，以滅菌牙籤挑出沉澱物，加入500 μL -20℃之 isopropanol 混合均勻，置於-80℃ 5 分鐘，於 4℃以 13,200 rpm 離心 10 分鐘，倒去上清液並倒置微量離心管風乾，加入 20-40 μL TE 7.5 [10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM Na2EDTA] 回溶，於 4℃貯藏備用。

2. DNA 片段回收

取 1 μg 質體 DNA 經限制酶酶切後，以瓊脂膠體 (agarose) 進行電泳分離，於UV 365 nm 波段下照射膠體，並切下欲回收之 DNA 片段於微量離心管，秤所切下之膠體重量後，以UltraClean TM 15 DNA Purification kit (MO BIO) 將膠體溶解使 DNA 釋出，並以 glass beads 回收，最後回溶 10 μL TE 7.5 [10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM Na2EDTA]，於 4℃貯藏備用。

3. 連接反應

將欲接合之基因片段 (insert) 與載體 (vector) 完全酶切，跑電泳回收

後，以適當之比例混合，加入1/10 體積之緩衝液 (ligation buffer) 與 T4 DNA 連接酶 (ligase)，於 16℃反應 16-24 小時。

4. 大腸桿菌勝任細胞之製備

大腸桿菌勝任細胞之製備方法，係修改自 Alexander (1987) 所提出之方法。將大腸桿菌JM109 菌種接種於 M9 (10 g/L Na2HPO4‧7H2O, 3 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 0.5 M MgSO4, 50mM CaCl2, 0.2%

glucose, 0.2% thiamine, 30 g/L agar) 固體培養基，於 37℃以培養 24 小時，

挑取單一菌落接種於 25 mL LB 液體培養基，於 37℃水浴以 240 rpm 震盪培養16-18 小時，取出 1 mL 菌液接種於 100 mL LB 液體培養基，於 37℃

水浴以240 rpm 震盪培養至 O.D.600介於0.45-0.05 之間，置於冰水浴急速冷卻30 分鐘，於 4℃以 5,000 rpm (Beckman J2-MC, JA-18 rotor) 離心 10 分鐘，

去上清液，加入與原菌液等體積之Trituration buffer [100 mM CaCl2, 70 mM MgCl2, 40 mM NaOAc (pH 5.5)] 懸浮菌體後，於冰上靜置 15 分鐘，再於 4℃

以4,5000 rpm (Beckman J2-MC, JA-18 rotor) 離心 10 分鐘，去上清液，加入與原菌液1/10 體積之 Trituration buffer 懸浮菌體，分裝 184 μL 菌液至微量離心管後加入16 μL dimethyl sulfoxide (DMSO)，以液態氮急速冷凍後保存於-80℃貯藏備用。

5. 轉型反應

轉型反應之方法，係修改自 Hanahan (1983) 所提出之方法。將連接反應之產物與200 μL 大腸桿菌勝任細胞混合，於冰上靜置 30 分鐘，於 42℃

水浴進行熱休克 (heat shock) 1 分鐘，置於冰上 1 分鐘後，加入 1 mL LB 液態培養基，於37℃水浴以 100 rpm 震盪培養 1 小時，取菌液塗抹於含有抗生素 (50 μg/mL kanamycin or ampicillin) 之固態培養基上，於 37℃培養

12-16 小時。

6. 聚合酶連鎖反應

聚合酶連鎖反應之方法，係修改自 Jayaraman 等 (1991) 所提出之方法。取50 ng 質體 DNA 當作模板，加入 0.25 μM 引子、緩衝液 [10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.001% (w/v) gelatin]、dNTP (800 mM)、3 units DNA 聚合酶 (polymerase)，反應總體積為 50 μL，反應條件為，98℃2 分鐘一個循環，98℃ 30 秒、50℃ 30 秒、72℃ 90 秒共 40 個循環，72℃ 10 分鐘一個循環 (GeneAmp PCR system 2400, Perkin Elmer)，聚合酶連鎖反應之產物於 4℃貯藏備用。

使用之引子：

DnaJF (5’-TAACCATGGGACCGGCGT-3’) M13F (5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’) 5GFP (5’-ATGGGTAAAGGAGAAGAACT-3’) 35S polyA ter (5’-CTACTCACACATTATTCTGG-3’)

7. DNA 5’ 末端突出補平反應

參照 Promega 產品說明，1-4 μg 經酶切後之 DNA，加入 0.5 mM dNTP/μg DNA 與 1 Unit Klenow enzyme/μg DNA，於 30℃反應 30 分鐘，加入 0.8 μL 0.5 M EDTA 終止反應。

8. DNA 3’ 末端突出切平反應

參照 Promega 產品說明，每 1-4 μg 經酶切後之 DNA，加入 0.5 mM dNTP/μg DNA 與 1 Unit Klenow enzyme/μg DNA，於 30℃反應 15 分鐘，加入1 μL 0.5 M EDTA 終止反應。

9. DNA 定序

使用核酸自動定序儀 ABI sequencer 377，進行 DNA 定序，以獲得基因默化與蛋白質定位轉殖質體之構築。

(三) 質體 DNA 之大量製備

質體 DNA 之大量製備之方法，係修改自 Sambrook 等 (1989) 所提出之方法。將大腸桿菌菌種接種於 LB 固體培養基，於 37℃以培養 12-16 小時，挑取單一菌落接種於 10 mL 含有抗生素 (50 μg/mL kanamycin or ampicillin) 之 LB 液體培養基，於 37℃以 120 rpm 旋轉培養 12-16 小時，將 10mL 菌液接種於 1 L 含有抗生素 (50 μg/mL kanamycin or ampicillin) 之 LB 液體培養基，於37℃水浴以 240 rpm 震盪培養 24-36 小時。菌液於 4℃以 6,000 rpm (Beckman J2-MC, JA-10 rotor) 離心 15 分鐘，去上清液，加入 18 mL solution I [50 mM glucose, 10 mM Na2EDTA, 25 mM Tris-HCl (pH 8.0)]

懸浮菌體，加入2 mL lysozyme [10 mg/mL in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)] 與 40 mL solution II (0.2 N NaOH, 1% sodium dodecyl sulfate) 混合均勻，於室溫靜置5 分鐘，再加入 20 mL 預冷之 solution III (3M KOAc, 115 mL/L acetic acid) 混合均勻，於冰上靜置 10 分鐘後，於 4℃以 7,000 rpm (Beckman J2-MC, JA-10 rotor) 離心 15 分鐘，將上清液以尼龍網 (nylon mesh) 過濾，加入 0.6 倍體積之飽和異丙醇 (NaCl-saturated isopropanol) 混合均勻，於冰上靜置 5 分鐘後，於4℃以 6,000 rpm (Beckman J2-MC, JA-10 rotor) 離心 15 分鐘，

去上清液，先後加入 2 mL 70%酒精與 100%酒精，於 4℃以 5,000 rpm (Beckman J2-MC, JA-10 rotor) 離心 5 分鐘，去上清液，風乾後以 10 mL TE 8.0 [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM Na2EDTA] 回溶 DNA，加入氯化銫 (Cesium chloride, CsCl) 調整密度至 1.57-1.59 g/mL，再加入溴化乙錠 (Ethidium bromide, EtBr) 使總濃度為 38.6 μg/mL，將溶液加入超高速離心

管，於20℃以 50,000 rpm (Beckman L8-M, NVT65 rotor) 離心 16 小時後，

以針頭將DNA 抽出，加入等體積之飽和異丙醇混合均勻，於室溫下以 4,000 rpm (Beckman Allegra X-12R Centrifuge, SX4750) 離心 3 分鐘，去除上層 EtBr。將溶液裝入透析模內，於 4 L TE (pH 8.0) 中透析 16 小時，去除 CsCl 後，加入1/10 體積之 3 M NaOAc (pH 5.2) 與 2.5 倍體積之 100%酒精混合均勻，於4℃以 7,000 rpm (Beckman J2-MC, JA-13.1 rotor) 離心 10 分鐘，去上清液，先後加入2 mL 70%酒精與 100%酒精，於 4℃以 5,000 rpm (Beckman J2-MC, JA-13.1 rotor) 離心 5 分鐘，去上清液，風乾後以 TE 7.5 回溶 DNA，

定量後於-20℃貯藏備用。

(四) 阿拉伯芥原生質體轉殖

1. 原生質體之抽取

新鮮配製 10 mL 酵素溶液 (1% cellulose R10, 0.25% macerozyme R10, 0.4 M mannitol, 20 mM KCl, 20 mM MES)，於 55℃水浴加熱 10 分鐘後，使溶液冷卻至室溫，加入10 mM CaCl2與0.1% BSA。以無痕膠帶將阿拉伯芥葉片下表皮去除，置於酵素溶液，以50 rpm 搖晃 1.5-2 小時，將原生質體吸到小試管，於室溫以100 g 離心 3 分鐘，去除上清液，加入 2 mL W5 solution (3 M NaCl, 1M CaCl2, 0.2M KCl, 0.1 M MES, 0.1 M glucose)，輕輕混勻，於室溫以100 g 離心 1 分鐘，重複三次，去除上清液，加 2 mL W5，

輕輕混勻，於冰上靜置30 分鐘。加入 1% BSA 於 well 中進行 coating，30 分鐘後將其倒出。取原生質體懸浮液以血球計數器估算數量，進行轉殖前，加入MMg solution [0.8 M mannitol, 1M MgCl2, 0.1 M MES (pH5.7)]，

使原生質體總數為2-5 × 10⁵/mL。

2. 原生質體之轉殖

阿拉伯芥原生質體 PEG 轉殖之方法，係修改自 Yoo (2007) 所提出之方

法。取200 μL 原生質體加入 20 μg DNA (1 μg/μL)，再加入 220 μL PEG [PEG 4000 (Fruka), 0.8 M mannitol, 1 M CaCl2] 混合均勻，於室溫靜置 5 分鐘，加入2 mL W5 solution 終止反應，於室溫以 100 g 離心 1 分鐘，吸去上清液，

重複二次，加入1 mL W5 solution 懸浮原生質體，於 25℃光照培養 18-24 小時，加入細胞核染劑DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 染色 30 分鐘，

加入1 mL W5 solution，於室溫以 100 g 離心 1 分鐘，吸去上清液，重複二次，以共軛焦顯微鏡 (Leica TCS SP5 Confocal) 觀察。

(五) 基因槍法暫時性表現

1. 微粒子製備與 DNA 包裹

微粒子製備方法，係修改自 Klein 等 (1987) 所提出之方法。秤取 60 mg 直徑1 μm 之金粒子，加入 1 mL 70%酒精震盪 5 分鐘，靜置 15 分鐘，於室溫下以13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 5 分鐘，去上清液，

加入 1 mL 無菌水震盪 1 分鐘，靜置 1 分鐘，於室溫下以 13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 1 分鐘，重複三次，去上清液，加入 1 mL 50%甘油 (glycerol) 於-20℃貯藏備用。取出 50μL，依序加入 5 μg DNA、

50 μL 2.5M CaCl2、20 μL 0.1 M spermidine，震盪 5 分鐘，靜置 1 分鐘，於室溫下以13,200 rpm 離心 1 分鐘，去上清液，先後加入 140 μL 70%酒精與 100%酒精，於室溫下以 13,200 rpm 離心 1 分鐘，去上清液，最後加入 48 μL 100%酒精，貯藏備用，每次槍擊使用 6 μL。

2. 洋蔥表皮細胞之基因轉殖

以洋蔥鱗莖第 2-4 層表皮組織為材料，使用 Bio-Rad 之氣壓式粒子槍 (PDS-1000/He partical gun)，槍擊條件為 gap 飛行距離 3/8 inch，microcarrier 飛行距離8 mm，25 inches-Hg，1100 psi 壓力片，材料距離 stop screen 6 cm，

槍擊後於黑暗培養 18-24 小時，加入細胞核染劑 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 染色 30 分鐘，以共軛焦顯微鏡 (Leica TCS SP5 Confocal)觀察。

(六) 農桿菌轉型

1. 農桿菌勝任細胞之製備

農桿菌勝任細胞之製備方法，係修改自 Hofgen 與 Willmiter (1988) 所提出之方法。將農桿菌 (Agobacterium tumerfaciens) LBA4404 與 EHA105 分別接種於20 mL 含有 100 μg/mL Rifamycin 及 20 μg/mL Streptomycin 與 100 μg/mL Rifamycin 之 YEB 液體培養基 (5 g/L beef extract, 1 g/L yeast extract, 5 g/L peptone, 5 g/L mannitol, 0.5 g/L MgSO4, adjusted with 1N NaOH to pH 7.5) 中，於 28℃下以 240 rpm 震盪培養 24 小時。分別取出震盪培養 24 小時後之 5 mL 菌液加入 200 mL 含有 100 μg/mL Rifamycin 及 20 μg/mL Streptomycin 與 100 μg/mL Rifamycin 之 YEB 液體培養基中，於 28℃下以 240 rpm 震盪培養至 OD600 為0.5，將菌液倒入離心管，於 4℃下以 4,200 rpm (Beckman J2-MC, JA-10 rotor) 離心 20 分鐘，倒去上清液，以 200 mL 預冷之無菌水回溶，於4℃下以 4,200 rpm (Beckman J2-MC, JA-10 rotor) 離心 20 分鐘，重複一次後以 100 mL 預冷之無菌水回溶，再重複一次後以 50 mL 預冷之無菌水回溶，最後菌體以2 mL 之預冷的 10%甘油回溶，並以 50 μL

為一轉型單位分裝至 1.5 mL 之微量離心管，以液態氮急速冷凍後保存於

-80℃貯藏備用。

2. 電穿孔轉型反應

農桿菌電穿孔轉型方法，係修改自 Shen 與 Forde (1989) 及所提出之方法。將農桿菌勝任細胞由-80℃凍箱取出置於冰上解凍後，加入 100 ng 之質

體DNA 於冰浴中混合均勻，全部移入 electroporation cuvette (sample volume 20-70 μL) 中，以 Eelectroporation Amplitude-1.44KV, Pulse Width-99 μsec, Number of pulses-10 進行電穿孔，電穿孔後立刻加入 500 μL 於 28℃預熱之 YEB 液體培養基進入 electroporation cuvette 中，吸放數次後全部移入玻璃

小試管中，於28℃下培養 1 小時，取出菌液均勻塗抹於含有適當抗生素之

YEB 培養基，於 28℃下培養 48 小時。

3. 農桿菌質體 DNA 之小量製備

農桿菌質體 DNA 之小量製備方法，係修改自 Sambrook (1989) 所提出之方法。接種單一菌落於50 mL 含有適當抗生素之 YEB 液體培養基中，

於28℃下以 240 rpm 震盪培養 48 小時，置於冰上 15 分鐘快速降溫後，於 4℃下以 3,700 rpm (Beckman J2-MC, JS13.1 rotor) 離心 20 分鐘，倒去上清液並加入1 mL 冰冷之 TE (pH 8.0) 懸浮菌體，將菌液移至 1.5 mL 之微量離心管，於室溫下以13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 1 分鐘，倒去上清液後，加入200 μL 之 Lysozyme [25 mg/mL in solution I (25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM Na2EDTA, 50 mM glucose) ]，震盪 (vortex) 5 分鐘混合均勻，於冰上加入400 μL 之 solution II (0.2N NaOH, 1% SDS ) 混合均勻後於冰上靜置9-13 分鐘，再加入 300 μL 之 solution III (3 M KOAc) 混合均勻後於冰上靜置13-16 分鐘，於 4℃下以 13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 10 分鐘，吸取上清液至新的 1.5 mL 之微量離心管，加入 500 μL 冰冷的isopropanol 混合均勻，於-80℃下靜置 5 分鐘，於 4℃下以 13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 10 分鐘，倒去上清液，加入 135 μL 之 TE (pH 8.0) 回溶 DNA，加入 100 μL 之 PCI 進行萃取，震盪 1 分鐘混合均勻，於室溫下以13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 1 分鐘，吸取上層液至新的微量離心管，再加入 100 μL 之 CI (Chloroform/isoamyl

alcohol, 24:1) 進行萃取，震盪 1 分鐘混合均勻，於室溫下以 13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 1 分鐘，吸取上層液至新的微量離心管，加入等體積之4 M ammonia acetate 與 500 μL 之 100%酒精混合均勻，

於-80℃下靜置 5 分鐘沉澱 DNA，於 4℃下以 13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 10 分鐘，倒去上清液，加入 200 μL 之 70%酒精，

於室溫下以13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 5 分鐘，倒去上清液，再加入 200 μL 之 100%酒精，於室溫下以 13,200rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 5 分鐘，倒去上清液後將微量離心管倒置風乾，風乾後以10-20 μL 無菌水回溶，於 4℃下貯藏備用。

(七) 阿拉伯芥基因轉殖及轉殖株篩選

1. 阿拉伯芥花序浸潤轉殖法

將阿拉伯芥種子播種於滅菌介質 (泥炭土：珍珠石：蛭石 = 8：1：1)

中，於23℃、16 小時光照與溼度 75%之生長箱培養，當植株長出第二對子

葉，開始每星期施用一次1 mg/L 之花寶 2 號，並剪除提早抽出之花梗，3-4

在文檔中香蕉果實後熟相關基因MhDnaJ之啟動子活性與基因功能分析 (頁 25-0)