農桿菌質體 DNA 之小量製備 - 香蕉果實後熟相關基因MhDnaJ之啟動子活性與基因功能分析

農桿菌質體 DNA 之小量製備方法，係修改自 Sambrook (1989) 所提出之方法。接種單一菌落於50 mL 含有適當抗生素之 YEB 液體培養基中，

於28℃下以 240 rpm 震盪培養 48 小時，置於冰上 15 分鐘快速降溫後，於 4℃下以 3,700 rpm (Beckman J2-MC, JS13.1 rotor) 離心 20 分鐘，倒去上清液並加入1 mL 冰冷之 TE (pH 8.0) 懸浮菌體，將菌液移至 1.5 mL 之微量離心管，於室溫下以13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 1 分鐘，倒去上清液後，加入200 μL 之 Lysozyme [25 mg/mL in solution I (25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM Na2EDTA, 50 mM glucose) ]，震盪 (vortex) 5 分鐘混合均勻，於冰上加入400 μL 之 solution II (0.2N NaOH, 1% SDS ) 混合均勻後於冰上靜置9-13 分鐘，再加入 300 μL 之 solution III (3 M KOAc) 混合均勻後於冰上靜置13-16 分鐘，於 4℃下以 13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 10 分鐘，吸取上清液至新的 1.5 mL 之微量離心管，加入 500 μL 冰冷的isopropanol 混合均勻，於-80℃下靜置 5 分鐘，於 4℃下以 13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 10 分鐘，倒去上清液，加入 135 μL 之 TE (pH 8.0) 回溶 DNA，加入 100 μL 之 PCI 進行萃取，震盪 1 分鐘混合均勻，於室溫下以13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 1 分鐘，吸取上層液至新的微量離心管，再加入 100 μL 之 CI (Chloroform/isoamyl

alcohol, 24:1) 進行萃取，震盪 1 分鐘混合均勻，於室溫下以 13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 1 分鐘，吸取上層液至新的微量離心管，加入等體積之4 M ammonia acetate 與 500 μL 之 100%酒精混合均勻，

於-80℃下靜置 5 分鐘沉澱 DNA，於 4℃下以 13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 10 分鐘，倒去上清液，加入 200 μL 之 70%酒精，

於室溫下以13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 5 分鐘，倒去上清液，再加入 200 μL 之 100%酒精，於室溫下以 13,200rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 5 分鐘，倒去上清液後將微量離心管倒置風乾，風乾後以10-20 μL 無菌水回溶，於 4℃下貯藏備用。

(七) 阿拉伯芥基因轉殖及轉殖株篩選

1. 阿拉伯芥花序浸潤轉殖法

將阿拉伯芥種子播種於滅菌介質 (泥炭土：珍珠石：蛭石 = 8：1：1)

中，於23℃、16 小時光照與溼度 75%之生長箱培養，當植株長出第二對子

葉，開始每星期施用一次1 mg/L 之花寶 2 號，並剪除提早抽出之花梗，3-4 週後開始摘心，摘心2-3 次後花序長約 7-15 公分即可進行轉殖。阿拉伯芥之基因轉殖方法，係修改自 Bechtold (1993) 所提出之方法。將農桿菌 (Agobacterium tumerfaciens, EHA105) 接種於含有 100 μg/mL Rifamycin 及 50 μg/mL Kanamycin 之 YEB 培養基，於 28℃下培養 24 小時，挑取單一菌落接種於含有100 μg/mL Rifamycin 及 50 μg/mL Kanamycin 之 YEB 液體培養基中，於28℃下以 240rpm 震盪培養 48 小時，再取出 5 mL 菌液加入 500 mL 含有，100 μg/mL Rifamycin 及 50μg/mL Kanamycin 之 YEB 液體培養基中，於28℃下以 240 rpm 震盪培養至 OD600為0.8，將菌液於 4℃下以 6,000 rpm (Beckman J2-MC, JA-10 rotor) 離心 10 分鐘，倒去上清液，加入 250 mL 之 infiltration 液體培養基 [1/2 MS basal medium (Murashige and Skoog,

1962), 5% sucrose, 2 mg/mL BA, 0.01% Silwet L-77, pH 5.7] 懸浮菌體，轉殖前先剪除已開的小花與果莢，將植株倒置使所有小花苞都浸泡於菌液中進

行轉殖，將植株殘留的菌液滴乾，用塑膠袋套住植株保持溼度，於23℃低

光照環境下處理24 小時，即可拆除塑膠袋並置於生長箱內培養，待第一個

果莢開始褐化即可套袋，約3 週後即可收種子。

2. 轉殖株之篩選

植株完全乾燥後即可收取轉殖阿拉伯芥種子，秤取適量種子置於 1.5 mL 之微量離心管中，以清水浸泡 30 分鐘，再以無菌水清洗種子 3 次，加入1% 漂白水 (含 0.05% Tween-20)，震盪 20 分鐘後去除上清液，再以無菌

水清洗種子 3 次，加入種子量 2 倍體積之無菌水懸浮後，將種子均勻灑佈

於發芽培養基 (1/2 MS basel medium, 1% sucrose, 50 μg/mL Kanamycin, 50 mg/L Cefotaxime, 0.7% agar, pH 5.7)，1 週後即可區別未轉殖株與有抗性之 T1 擬轉殖株。

(八) 菸草基因轉殖及轉殖株篩選

1. 菸草葉圓片轉殖法

菸草葉圓片轉殖方法，係修改自 Horsch 等 (1985) 所提出之方法。將農桿菌 (Agobacterium tumerfaciens, LBA4404) 接種於含有 100 μg/mL Rifamycin、20 μg/mL Streptomycin 及 50 μg/mL Kanamycin 之 YEB 培養基，

於28℃下培養 24 小時，挑取單一菌落接種於含有 100 μg/mL Rifamycin、

20 μg/mL Streptomycin 及 50 μg/mL Kanamycin 之 YEB 液體培養基中，於 28℃下以 240 rpm 震盪培養 48 小時，菌液調整 OD600為 0.8，取 20 mL 菌液倒入玻璃培養皿，將菸草無菌苗葉片切成1.5 x 1.5 cm²的葉圓片，浸入農

桿菌菌液中 3-5 分鐘進行轉殖，取出葉圓片於無菌吸水紙上瀝乾後，放置

於N01B1 培養基 [MS (Murashige and Skoog, 1962), 0.1 mg/L 1-naphthyl acetic acid (NAA), 1 mg/L BA, 3% sucrose, pH 5.7, 0.7% agar] 上，於 25℃ 以 16 小時光照環境下共培養 2 天。

2. 轉殖株之篩選與再生

將共培養 2 天之菸草轉殖葉圓片取出，浸於含有 250 mg/L Cefotaxime

之N01B1 液體培養基中 1 分鐘，取出葉圓片於無菌吸水紙上瀝乾後，放置

於含有250 mg/L Cefotaxime 與 100 μg/mL Kanamycin 之 N01B1 培養基上，

於 25℃以 16 小時光照環境篩選 3 週，將抽出芽體之葉圓片移至含有 250 mg/L Cefotaxime 與 200 μg/mL Kanamycin 之 N01B1 培養基上，於 25℃以 16

小時光照環境下次篩選，切下約 1 公分長無白化之芽體，扦插於含有 250

mg/L Cefotaxime 與 200 μg/mL Kanamycin 之 MS 培養基上，於 25℃以 16 小時光照環境下培養，使其發根。

(九) 擬轉殖株之分析

1. 基因組 DNA 之抽取

基因組 DNA 之抽取方法，係修改自 Dellaporta 等 (1983) 所提出之方法。秤取0.5-1.0 g 植物材料，以液態氮研磨至粉末狀，加入 15 mL extraction buffer [100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA (pH 8.0), 500 mM NaCl、10 mM β-mercaptoethanol] 混合均勻，於冰上加入 1 mL 20% SDS，震盪後於 65℃水浴反應 10 分鐘，加入 5 mL 5 M KAOc 混合均勻，於冰上靜置 20 分鐘，於4℃以 10,800 rpm (Beckman J2-MC, JA-13.1) 離心 20 分鐘，將上

清液以尼龍網過濾至新的離心管中，加入10 mL -20℃異丙醇，混合均勻，

於-20℃靜置 30 分鐘，於 4℃以 10,800 rpm (Beckman J2-MC, JA-13.1) 離心 15 分鐘，去上清液，風乾後加入 700 μL High-TE [50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM Na2EDTA] 回溶 DNA，將溶液移至微量離心管，於 4℃以 13,200 rpm

(Eppendorf Centrifuge 5415D) 離心 10 分鐘，將上清液移至新的微量離心管，加入75 μL 3 M NaOAc (pH 5.2) 與 500 μL -20℃異丙醇，混合均勻，

於4℃以 13,200 rpm 離心 10 分鐘，去上清液，先後加入 70%酒精與 100%

酒精，於4℃以 13,200 rpm 離心 5 分鐘，去上清液，風乾後加入 100 μL 含有10 mg/mL RNase A 之 TE (pH 8.0) 回溶 DNA，於-20℃貯藏備用。

2. 樣品製備

取20 μg 基因組 DNA 進行限制酶，於 75℃處理 10 分鐘終止反應，加入1/10 倍體積之 4M NaCl 與 2.5 倍體積之 100% 酒精，於-80℃沉澱 30 分鐘，於4℃以 13,200 rpm 離心 10 分鐘，去上清液，先後加入 70%酒精與 100%酒精，於 4℃以 13,200 rpm 離心 5 分鐘，去上清液，風乾後加入 25 μL TE (pH 8.0) 回溶 DNA，再加入 10 X DNA loading dye，以 0.7%瓊指膠體進行電泳分離。膠體依序以200 mL 0.25 N HCl、變性緩衝液 (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH)、中和緩衝液 [1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 M EDTA (pH 8.0)] 各浸泡處理 15 分鐘二次，以 200 mL 10 x SSC 緩衝液 (1.5 M NaCl、0.15 M trisodium citrate) 進行轉漬 16-18 小時，將 DNA 轉漬至 Hybond-N 膜上，以 120 mJ/cm² UV (Spectrolinker XL-1500) 進行 cross-linking 後，於 80℃真空烘箱乾燥 1 小時，於防潮箱貯藏備用。

3. 探針製備

探針之製備方法，參照 Feinberg 與 Vogelstein (1983) 所提出之 radom primer labeling 方法。取 25-62.5 ng 變性之 DNA 當作模板，加入 10 X labeling buffer {50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 5 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.2 M N-[2-hydroxyethy]piperazine-N’-2-[ethanesul-fonic acid] (HEPES), 26 A260

units/mL random hexadeoxyribonicleotides}、25 μM dATP、25 μM dTTP、25 μM dGTP、400 μg/μL bovine serium albumin (BSA)、50 μCi [α-³²P] dCTP (333

nM) 與 5 units Klenow polymerase，反應總體積為 50 μL，於 37℃反應 2 小時，加入2 μL 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) 終止反應，再加入 8 μL 追蹤染劑 (50% glycerol, 0.25% bromophenol blue) 混合均勻後，將反應液加入 Sephadex-G50 層析管柱，以微量離心管接取通過之溶液，並使用液態閃爍計數器 (Beckman LS1801) 測量放射性同位素讀值，選取最高值做為探針。

4. 南方氏雜交分析

南方氏雜交方法，係修改自 Southern (1975) 所提出之方法。將 Hybond-N 轉漬膜放入預雜交溶液 [6 X SSPE (1 X SSPE: 0.15 M NaCl, 10 mM NaH2PO4, 1 mM Na2EDTA, pH 7.4), 5 X BFP (1 X BFP: 0.02% BSA, 0.02% Ficoll-400000, 0.02% PVP-360000), 1% SDS, 10% dextran sulfate, 50 μg/mL salmon sperm DNA]，於 65℃水浴以 20 rpm 震盪反應至少 2 小時，

將預雜交溶液倒出，加入雜交溶液 [6 X SSPE, 5 X BFP, 0.5% SDS, 250 μg/mL salmon sperm DNA, 10% dextran sulfate, 3 x 10⁶ cpm/mL 之變性核酸探針]，於 65℃水浴以 20 rpm 震盪反應 16-18 小時，將雜交溶液倒出，於室溫以Wash buffer I 溶液 (2 X SSPE, 0.1% SDS) 20 rpm 震盪處理 15 分鐘，重複兩次，在於65℃水浴以 Wash buffer II 溶液 (1 X SSPE, 0.1% SDS) 20 rpm 震盪處理 15 分鐘，重複兩次，即可於-80℃進行 X 光片壓片 (Kodak XAR film)。

5. GUS 活性組織化學染色法

GUS 活性組織化學染色之方法，係修改自 Jefferson (1987) 所提出之方法。植物材料浸泡於含有Triton X-100 之緩衝液 [50 mM NaPO4 (pH 6.8), 1%

Triton X-100]，37℃下處理 2 小時，以緩衝液 (50 mM NaPO4, pH 6.8) 沖洗三次，加入含X-gluc 之緩衝液 [50 mM NaPO4 (pH 6.8), 1 mM X-gluc]，以 25 inch-Hg 真空抽氣 5 分鐘二次，回壓後置於 37℃下反應 24 小時，最後以

70%酒精終止酵素反應及褪去葉綠素，並於室溫下浸泡保存。

(十) 轉殖株之啟動子活性與誘導分析

1. 無菌播種

於無菌操作台，將阿拉伯芥或菸草種子放入微量離心管，加入 70%酒精震盪清洗1 分鐘，再以 1%漂白水 (含 0.05% Tween-20) 震盪清洗 15 分

鐘，以無菌水沖洗漂白水3 次，每次 5 分鐘，加入等體積之無菌水懸浮種

子，播種於含有抗生素 (50 μg/mL Kanamycin) 之 1/2 MS (含 1% sucrose) 固體培養基，培養於25℃、16 小時光照及 8 小時黑暗環境。

2. 不同發育階段之啟動子活性分析

取無菌播種後 5、10、15、20、25、30 天大與開花之菸草轉殖株，進行GUS 活性組織化學染色。

3. 不同非生物性逆境誘導處理

取無菌播種後21 天大菸草 T1 轉殖株，以下所列出之逆境進行處理，

除了高溫、低溫與低溫黑暗處理，其他處理皆於25℃、光照 16 小時、黑暗

8 小時之培養室進行，處理後以 GUS 活性組織化學染色，觀察啟動子表現情形。

(1) 高溫逆境處理

將菸草 T1 轉殖株含培養基，放入生長箱以 37、42、45℃處理 24 小時。

(2) 乾旱逆境處理

將菸草 T1 轉殖株置於乾的濾紙上，處理 3 小時。

(3) 低溫處理

將菸草 T1 轉殖株含培養基，放入冰箱以 4℃處理 24 小時。

(4) 黑暗處理

將菸草 T1 轉殖株含培養基，以鋁箔紙包覆避光處理 24 小時。

(5) 低溫與黑暗處理

將菸草 T1 轉殖株含培養基，以鋁箔紙包覆避光，放入冰箱以 4℃處理 24 小時。

(6) 鹽分逆境處理

將菸草 T1 轉殖株置於以 300 mM NaCl 浸潤之濾紙上，處理 3 小時。

(7) 淹水逆境處理

將菸草 T1 轉殖株自培養基取出，放入小試管以無菌水淹蓋處理 24 小時。

(8) 機械創傷處理

以解剖刀劃傷菸草 T1 轉殖株之葉片製造創傷，再置於以含 1% soucrose 之1/2 MS 液態培養基浸潤之濾紙上，處理 0.5 或 1 小時。

4. 不同生長調節劑誘導處理

生長調節劑誘導處理試驗，係修改自Tsuchisaka 與 Theologis (2004) 及 Wang (2005) 所提出之方法。取無菌播種後 21 天大菸草 T1 轉殖株，置於

以含有以下不同濃度生長調節劑之1/2 MS 液態培養基浸潤之濾紙上進行處

理24 小時，處理皆於 25℃、光照 16 小時、黑暗 8 小時之培養室進行，處

理後以GUS 活性組織化學染色，觀察啟動子表現情形。

(1) Auxin：20 μM indole-3-acetic acid (IAA) (2) Benzyadenine：20 μM BA

(3) Gibberellin：20 μM GA3

(4) Abscisic acid：100 μM ABA (5) Methyl jasmonate：50 μM MeJA (6) Salicylic acid：1 mM SA

(7) Ethylene：50 μM 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC)

肆、結果

一、香蕉MhDnaJ 基因結構分析

(一) 香蕉 MhDnaJ 基因序列分析

將 λMACS38 基因序列與 pMACS38 cDNA 序列比對，顯示香蕉 MhDnaJ 基因含5 個顯子及 4 個隱子 (圖五)，轉譯起始密碼子於第一個顯子，轉譯終止密碼子於第五個顯子，而顯子與隱子連接處之胺基酸序列，均符合 GT-AG rule (表一)。基因組選殖系 λMACS38 與 pMACS38 分別轉譯出 273

與217 個胺基酸，比較基因序列與相對應之 cDNA 序列，有一個核苷酸差

異，使第 190 個胺基酸由組胺酸變為精胺酸 (H134R)。比較香蕉 MhDnaJ 與其他物種如阿拉伯芥 (AtDnaJ, NP_565163) 、水稻 (OsDnaJ, NP_001060336) 、楊樹 (PtDnaJ, XP_002302268) 、蓖麻 (RcDnaJ, XP_002513851) 、葡萄 (VvDnaJ, XP_002285821) 和玉米 (ZmDnaJ, NP_001140575) DnaJ 胺基酸序列的相似性，介於 65.9% - 71.6% 之間，而

與葡萄相似性最高，為71.6% (表二)。胺基酸序列分析顯示，香蕉、阿拉

伯芥、水稻、楊樹、蓖麻、葡萄和玉米都具有J-protein 特有的 J-domain，

另外還有Nuclear localization signal (NLS) 與 Nuclear export signal (NES) (圖六)。親緣樹狀圖分析結果顯示，香蕉 MhDnaJ 在演化上和水稻與玉米的同

在文檔中香蕉果實後熟相關基因MhDnaJ之啟動子活性與基因功能分析 (頁 35-0)