使用核酸自動定序儀 ABI sequencer 377，進行 DNA 定序，以獲得基因 默化與蛋白質定位轉殖質體之構築。
(三) 質體 DNA 之大量製備
質體 DNA 之大量製備之方法，係修改自 Sambrook 等 (1989) 所提出 之方法。將大腸桿菌菌種接種於 LB 固體培養基，於 37℃以培養 12-16 小 時，挑取單一菌落接種於 10 mL 含有抗生素 (50 μg/mL kanamycin or ampicillin) 之 LB 液體培養基，於 37℃以 120 rpm 旋轉培養 12-16 小時，將 10mL 菌液接種於 1 L 含有抗生素 (50 μg/mL kanamycin or ampicillin) 之 LB 液體培養基，於37℃水浴以 240 rpm 震盪培養 24-36 小時。菌液於 4℃以 6,000 rpm (Beckman J2-MC, JA-10 rotor) 離心 15 分鐘，去上清液，加入 18 mL solution I [50 mM glucose, 10 mM Na2EDTA, 25 mM Tris-HCl (pH 8.0)]
懸浮菌體，加入2 mL lysozyme [10 mg/mL in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)] 與 40 mL solution II (0.2 N NaOH, 1% sodium dodecyl sulfate) 混合均勻，於室 溫靜置5 分鐘，再加入 20 mL 預冷之 solution III (3M KOAc, 115 mL/L acetic acid) 混合均勻，於冰上靜置 10 分鐘後，於 4℃以 7,000 rpm (Beckman J2-MC, JA-10 rotor) 離心 15 分鐘，將上清液以尼龍網 (nylon mesh) 過濾，加入 0.6 倍體積之飽和異丙醇 (NaCl-saturated isopropanol) 混合均勻，於冰上靜置 5 分鐘後，於4℃以 6,000 rpm (Beckman J2-MC, JA-10 rotor) 離心 15 分鐘，
去上清液，先後加入 2 mL 70%酒精與 100%酒精，於 4℃以 5,000 rpm (Beckman J2-MC, JA-10 rotor) 離心 5 分鐘，去上清液，風乾後以 10 mL TE 8.0 [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM Na2EDTA] 回溶 DNA，加入氯化銫 (Cesium chloride, CsCl) 調整密度至 1.57-1.59 g/mL，再加入溴化乙錠 (Ethidium bromide, EtBr) 使總濃度為 38.6 μg/mL，將溶液加入超高速離心
管，於20℃以 50,000 rpm (Beckman L8-M, NVT65 rotor) 離心 16 小時後，
以針頭將DNA 抽出，加入等體積之飽和異丙醇混合均勻，於室溫下以 4,000 rpm (Beckman Allegra X-12R Centrifuge, SX4750) 離心 3 分鐘，去除上層 EtBr。將溶液裝入透析模內，於 4 L TE (pH 8.0) 中透析 16 小時，去除 CsCl 後，加入1/10 體積之 3 M NaOAc (pH 5.2) 與 2.5 倍體積之 100%酒精混合 均勻，於4℃以 7,000 rpm (Beckman J2-MC, JA-13.1 rotor) 離心 10 分鐘，去 上清液，先後加入2 mL 70%酒精與 100%酒精，於 4℃以 5,000 rpm (Beckman J2-MC, JA-13.1 rotor) 離心 5 分鐘，去上清液，風乾後以 TE 7.5 回溶 DNA，
定量後於-20℃貯藏備用。
(四) 阿拉伯芥原生質體轉殖
1. 原生質體之抽取新鮮配製 10 mL 酵素溶液 (1% cellulose R10, 0.25% macerozyme R10, 0.4 M mannitol, 20 mM KCl, 20 mM MES)，於 55℃水浴加熱 10 分鐘後，使 溶液冷卻至室溫，加入10 mM CaCl2與0.1% BSA。以無痕膠帶將阿拉伯 芥葉片下表皮去除，置於酵素溶液，以50 rpm 搖晃 1.5-2 小時，將原生質 體吸到小試管，於室溫以100 g 離心 3 分鐘，去除上清液，加入 2 mL W5 solution (3 M NaCl, 1M CaCl2, 0.2M KCl, 0.1 M MES, 0.1 M glucose)，輕輕 混勻，於室溫以100 g 離心 1 分鐘，重複三次，去除上清液，加 2 mL W5，
輕輕混勻，於冰上靜置30 分鐘。加入 1% BSA 於 well 中進行 coating，30 分鐘後將其倒出。取原生質體懸浮液以血球計數器估算數量，進行轉殖 前，加入MMg solution [0.8 M mannitol, 1M MgCl2, 0.1 M MES (pH5.7)]，
使原生質體總數為2-5 × 105/mL。
2. 原生質體之轉殖
阿拉伯芥原生質體 PEG 轉殖之方法，係修改自 Yoo (2007) 所提出之方
法。取200 μL 原生質體加入 20 μg DNA (1 μg/μL)，再加入 220 μL PEG [PEG 4000 (Fruka), 0.8 M mannitol, 1 M CaCl2] 混合均勻，於室溫靜置 5 分鐘，加 入2 mL W5 solution 終止反應，於室溫以 100 g 離心 1 分鐘，吸去上清液，
重複二次，加入1 mL W5 solution 懸浮原生質體，於 25℃光照培養 18-24 小時，加入細胞核染劑DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 染色 30 分鐘，
加入1 mL W5 solution，於室溫以 100 g 離心 1 分鐘，吸去上清液，重複二 次，以共軛焦顯微鏡 (Leica TCS SP5 Confocal) 觀察。
(五) 基因槍法暫時性表現
1. 微粒子製備與 DNA 包裹微粒子製備方法，係修改自 Klein 等 (1987) 所提出之方法。秤取 60 mg 直徑1 μm 之金粒子，加入 1 mL 70%酒精震盪 5 分鐘，靜置 15 分鐘，於室 溫下以13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 5 分鐘，去上清液，
加入 1 mL 無菌水震盪 1 分鐘，靜置 1 分鐘，於室溫下以 13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 1 分鐘，重複三次，去上清液，加入 1 mL 50%甘油 (glycerol) 於-20℃貯藏備用。取出 50μL，依序加入 5 μg DNA、
50 μL 2.5M CaCl2、20 μL 0.1 M spermidine，震盪 5 分鐘，靜置 1 分鐘，於 室溫下以13,200 rpm 離心 1 分鐘，去上清液，先後加入 140 μL 70%酒精與 100%酒精，於室溫下以 13,200 rpm 離心 1 分鐘，去上清液，最後加入 48 μL 100%酒精，貯藏備用，每次槍擊使用 6 μL。
2. 洋蔥表皮細胞之基因轉殖
以洋蔥鱗莖第 2-4 層表皮組織為材料，使用 Bio-Rad 之氣壓式粒子槍 (PDS-1000/He partical gun)，槍擊條件為 gap 飛行距離 3/8 inch，microcarrier 飛行距離8 mm，25 inches-Hg，1100 psi 壓力片，材料距離 stop screen 6 cm，
槍 擊 後 於 黑 暗 培 養 18-24 小 時 ， 加 入 細 胞 核 染 劑 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 染色 30 分鐘，以共軛焦顯微鏡 (Leica TCS SP5 Confocal)觀察。
(六) 農桿菌轉型
1. 農桿菌勝任細胞之製備
農桿菌勝任細胞之製備方法，係修改自 Hofgen 與 Willmiter (1988) 所 提出之方法。將農桿菌 (Agobacterium tumerfaciens) LBA4404 與 EHA105 分別接種於20 mL 含有 100 μg/mL Rifamycin 及 20 μg/mL Streptomycin 與 100 μg/mL Rifamycin 之 YEB 液體培養基 (5 g/L beef extract, 1 g/L yeast extract, 5 g/L peptone, 5 g/L mannitol, 0.5 g/L MgSO4, adjusted with 1N NaOH to pH 7.5) 中，於 28℃下以 240 rpm 震盪培養 24 小時。分別取出震盪培養 24 小時後之 5 mL 菌液加入 200 mL 含有 100 μg/mL Rifamycin 及 20 μg/mL Streptomycin 與 100 μg/mL Rifamycin 之 YEB 液體培養基中，於 28℃下以 240 rpm 震盪培養至 OD600 為0.5，將菌液倒入離心管，於 4℃下以 4,200 rpm (Beckman J2-MC, JA-10 rotor) 離心 20 分鐘，倒去上清液，以 200 mL 預冷 之無菌水回溶，於4℃下以 4,200 rpm (Beckman J2-MC, JA-10 rotor) 離心 20 分鐘，重複一次後以 100 mL 預冷之無菌水回溶，再重複一次後以 50 mL 預冷之無菌水回溶，最後菌體以2 mL 之預冷的 10%甘油回溶，並以 50 μL
為一轉型單位分裝至 1.5 mL 之微量離心管，以液態氮急速冷凍後保存於
-80℃貯藏備用。
2. 電穿孔轉型反應
農桿菌電穿孔轉型方法，係修改自 Shen 與 Forde (1989) 及所提出之方 法。將農桿菌勝任細胞由-80℃凍箱取出置於冰上解凍後，加入 100 ng 之質
體DNA 於冰浴中混合均勻，全部移入 electroporation cuvette (sample volume 20-70 μL) 中，以 Eelectroporation Amplitude-1.44KV, Pulse Width-99 μsec, Number of pulses-10 進行電穿孔，電穿孔後立刻加入 500 μL 於 28℃預熱之 YEB 液體培養基進入 electroporation cuvette 中，吸放數次後全部移入玻璃
小試管中，於28℃下培養 1 小時，取出菌液均勻塗抹於含有適當抗生素之
YEB 培養基，於 28℃下培養 48 小時。
3. 農桿菌質體 DNA 之小量製備
農桿菌質體 DNA 之小量製備方法，係修改自 Sambrook (1989) 所提 出之方法。接種單一菌落於50 mL 含有適當抗生素之 YEB 液體培養基中，
於28℃下以 240 rpm 震盪培養 48 小時，置於冰上 15 分鐘快速降溫後，於 4℃下以 3,700 rpm (Beckman J2-MC, JS13.1 rotor) 離心 20 分鐘，倒去上清 液並加入1 mL 冰冷之 TE (pH 8.0) 懸浮菌體，將菌液移至 1.5 mL 之微量 離心管，於室溫下以13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 1 分 鐘，倒去上清液後，加入200 μL 之 Lysozyme [25 mg/mL in solution I (25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM Na2EDTA, 50 mM glucose) ]，震盪 (vortex) 5 分鐘 混合均勻，於冰上加入400 μL 之 solution II (0.2N NaOH, 1% SDS ) 混合均 勻後於冰上靜置9-13 分鐘，再加入 300 μL 之 solution III (3 M KOAc) 混合 均勻後於冰上靜置13-16 分鐘，於 4℃下以 13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 10 分鐘，吸取上清液至新的 1.5 mL 之微量離心管，加入 500 μL 冰冷的isopropanol 混合均勻，於-80℃下靜置 5 分鐘，於 4℃下以 13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 10 分鐘，倒去上清液，加入 135 μL 之 TE (pH 8.0) 回溶 DNA，加入 100 μL 之 PCI 進行萃取，震盪 1 分鐘混合均 勻，於室溫下以13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 1 分鐘，吸 取上層液至新的微量離心管，再加入 100 μL 之 CI (Chloroform/isoamyl
alcohol, 24:1) 進行萃取，震盪 1 分鐘混合均勻，於室溫下以 13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 1 分鐘，吸取上層液至新的微量離心 管，加入等體積之4 M ammonia acetate 與 500 μL 之 100%酒精混合均勻，
於-80℃下靜置 5 分鐘沉澱 DNA，於 4℃下以 13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 10 分鐘，倒去上清液，加入 200 μL 之 70%酒精，
於室溫下以13,200 rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 5 分鐘，倒去上 清液，再加入 200 μL 之 100%酒精，於室溫下以 13,200rpm (Eppendorf, Centrifuge 5415C) 離心 5 分鐘，倒去上清液後將微量離心管倒置風乾，風 乾後以10-20 μL 無菌水回溶，於 4℃下貯藏備用。
(七) 阿拉伯芥基因轉殖及轉殖株篩選
1. 阿拉伯芥花序浸潤轉殖法將阿拉伯芥種子播種於滅菌介質 (泥炭土：珍珠石：蛭石 = 8：1：1)
中，於23℃、16 小時光照與溼度 75%之生長箱培養，當植株長出第二對子
葉，開始每星期施用一次1 mg/L 之花寶 2 號，並剪除提早抽出之花梗，3-4 週後開始摘心，摘心2-3 次後花序長約 7-15 公分即可進行轉殖。阿拉伯芥 之基因轉殖方法，係修改自 Bechtold (1993) 所提出之方法。將農桿菌 (Agobacterium tumerfaciens, EHA105) 接種於含有 100 μg/mL Rifamycin 及 50 μg/mL Kanamycin 之 YEB 培養基，於 28℃下培養 24 小時，挑取單一菌 落接種於含有100 μg/mL Rifamycin 及 50 μg/mL Kanamycin 之 YEB 液體培 養基中，於28℃下以 240rpm 震盪培養 48 小時，再取出 5 mL 菌液加入 500 mL 含有，100 μg/mL Rifamycin 及 50μg/mL Kanamycin 之 YEB 液體培養基 中，於28℃下以 240 rpm 震盪培養至 OD600為0.8，將菌液於 4℃下以 6,000 rpm (Beckman J2-MC, JA-10 rotor) 離心 10 分鐘，倒去上清液，加入 250 mL 之 infiltration 液體培養基 [1/2 MS basal medium (Murashige and Skoog,
1962), 5% sucrose, 2 mg/mL BA, 0.01% Silwet L-77, pH 5.7] 懸浮菌體，轉殖 前先剪除已開的小花與果莢，將植株倒置使所有小花苞都浸泡於菌液中進
行轉殖，將植株殘留的菌液滴乾，用塑膠袋套住植株保持溼度，於23℃低
光照環境下處理24 小時，即可拆除塑膠袋並置於生長箱內培養，待第一個
果莢開始褐化即可套袋，約3 週後即可收種子。
2. 轉殖株之篩選
植株完全乾燥後即可收取轉殖阿拉伯芥種子，秤取適量種子置於 1.5 mL 之微量離心管中，以清水浸泡 30 分鐘，再以無菌水清洗種子 3 次，加 入1% 漂白水 (含 0.05% Tween-20)，震盪 20 分鐘後去除上清液，再以無菌
水清洗種子 3 次，加入種子量 2 倍體積之無菌水懸浮後，將種子均勻灑佈
於發芽培養基 (1/2 MS basel medium, 1% sucrose, 50 μg/mL Kanamycin, 50 mg/L Cefotaxime, 0.7% agar, pH 5.7)，1 週後即可區別未轉殖株與有抗性之 T1 擬轉殖株。
(八) 菸草基因轉殖及轉殖株篩選
1. 菸草葉圓片轉殖法菸草葉圓片轉殖方法，係修改自 Horsch 等 (1985) 所提出之方法。將 農 桿 菌 (Agobacterium tumerfaciens, LBA4404) 接種於含有 100 μg/mL Rifamycin、20 μg/mL Streptomycin 及 50 μg/mL Kanamycin 之 YEB 培養基，
於28℃下培養 24 小時，挑取單一菌落接種於含有 100 μg/mL Rifamycin、
20 μg/mL Streptomycin 及 50 μg/mL Kanamycin 之 YEB 液體培養基中，於 28℃下以 240 rpm 震盪培養 48 小時，菌液調整 OD600為 0.8，取 20 mL 菌 液倒入玻璃培養皿，將菸草無菌苗葉片切成1.5 x 1.5 cm2的葉圓片，浸入農
桿菌菌液中 3-5 分鐘進行轉殖，取出葉圓片於無菌吸水紙上瀝乾後，放置
於N01B1 培養基 [MS (Murashige and Skoog, 1962), 0.1 mg/L 1-naphthyl acetic acid (NAA), 1 mg/L BA, 3% sucrose, pH 5.7, 0.7% agar] 上，於 25℃ 以 16 小時光照環境下共培養 2 天。
2. 轉殖株之篩選與再生
將共培養 2 天之菸草轉殖葉圓片取出，浸於含有 250 mg/L Cefotaxime
之N01B1 液體培養基中 1 分鐘，取出葉圓片於無菌吸水紙上瀝乾後，放置
於含有250 mg/L Cefotaxime 與 100 μg/mL Kanamycin 之 N01B1 培養基上，
於 25℃以 16 小時光照環境篩選 3 週，將抽出芽體之葉圓片移至含有 250 mg/L Cefotaxime 與 200 μg/mL Kanamycin 之 N01B1 培養基上，於 25℃以 16
小時光照環境下次篩選，切下約 1 公分長無白化之芽體，扦插於含有 250
mg/L Cefotaxime 與 200 μg/mL Kanamycin 之 MS 培養基上，於 25℃以 16 小時光照環境下培養，使其發根。
(九) 擬轉殖株之分析
1. 基因組 DNA 之抽取基因組 DNA 之抽取方法，係修改自 Dellaporta 等 (1983) 所提出之方 法。秤取0.5-1.0 g 植物材料，以液態氮研磨至粉末狀，加入 15 mL extraction buffer [100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA (pH 8.0), 500 mM NaCl、10 mM β-mercaptoethanol] 混合均勻，於冰上加入 1 mL 20% SDS，震盪後於 65℃水浴反應 10 分鐘，加入 5 mL 5 M KAOc 混合均勻，於冰上靜置 20 分鐘，於4℃以 10,800 rpm (Beckman J2-MC, JA-13.1) 離心 20 分鐘，將上
清液以尼龍網過濾至新的離心管中，加入10 mL -20℃異丙醇，混合均勻，
於-20℃靜置 30 分鐘，於 4℃以 10,800 rpm (Beckman J2-MC, JA-13.1) 離心 15 分鐘，去上清液，風乾後加入 700 μL High-TE [50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM Na2EDTA] 回溶 DNA，將溶液移至微量離心管，於 4℃以 13,200 rpm
(Eppendorf Centrifuge 5415D) 離心 10 分鐘，將上清液移至新的微量離心 管，加入75 μL 3 M NaOAc (pH 5.2) 與 500 μL -20℃異丙醇，混合均勻，
於4℃以 13,200 rpm 離心 10 分鐘，去上清液，先後加入 70%酒精與 100%
酒精，於4℃以 13,200 rpm 離心 5 分鐘，去上清液，風乾後加入 100 μL 含 有10 mg/mL RNase A 之 TE (pH 8.0) 回溶 DNA，於-20℃貯藏備用。
酒精，於4℃以 13,200 rpm 離心 5 分鐘，去上清液，風乾後加入 100 μL 含 有10 mg/mL RNase A 之 TE (pH 8.0) 回溶 DNA，於-20℃貯藏備用。