轉殖株之篩選 - 香蕉果實後熟相關基因MhDnaJ之啟動子活性與基因功能分析

植株完全乾燥後即可收取轉殖阿拉伯芥種子，秤取適量種子置於 1.5 mL 之微量離心管中，以清水浸泡 30 分鐘，再以無菌水清洗種子 3 次，加入1% 漂白水 (含 0.05% Tween-20)，震盪 20 分鐘後去除上清液，再以無菌

水清洗種子 3 次，加入種子量 2 倍體積之無菌水懸浮後，將種子均勻灑佈

於發芽培養基 (1/2 MS basel medium, 1% sucrose, 50 μg/mL Kanamycin, 50 mg/L Cefotaxime, 0.7% agar, pH 5.7)，1 週後即可區別未轉殖株與有抗性之 T1 擬轉殖株。

(八) 菸草基因轉殖及轉殖株篩選

1. 菸草葉圓片轉殖法

菸草葉圓片轉殖方法，係修改自 Horsch 等 (1985) 所提出之方法。將農桿菌 (Agobacterium tumerfaciens, LBA4404) 接種於含有 100 μg/mL Rifamycin、20 μg/mL Streptomycin 及 50 μg/mL Kanamycin 之 YEB 培養基，

於28℃下培養 24 小時，挑取單一菌落接種於含有 100 μg/mL Rifamycin、

20 μg/mL Streptomycin 及 50 μg/mL Kanamycin 之 YEB 液體培養基中，於 28℃下以 240 rpm 震盪培養 48 小時，菌液調整 OD600為 0.8，取 20 mL 菌液倒入玻璃培養皿，將菸草無菌苗葉片切成1.5 x 1.5 cm²的葉圓片，浸入農

桿菌菌液中 3-5 分鐘進行轉殖，取出葉圓片於無菌吸水紙上瀝乾後，放置

於N01B1 培養基 [MS (Murashige and Skoog, 1962), 0.1 mg/L 1-naphthyl acetic acid (NAA), 1 mg/L BA, 3% sucrose, pH 5.7, 0.7% agar] 上，於 25℃ 以 16 小時光照環境下共培養 2 天。

2. 轉殖株之篩選與再生

將共培養 2 天之菸草轉殖葉圓片取出，浸於含有 250 mg/L Cefotaxime

之N01B1 液體培養基中 1 分鐘，取出葉圓片於無菌吸水紙上瀝乾後，放置

於含有250 mg/L Cefotaxime 與 100 μg/mL Kanamycin 之 N01B1 培養基上，

於 25℃以 16 小時光照環境篩選 3 週，將抽出芽體之葉圓片移至含有 250 mg/L Cefotaxime 與 200 μg/mL Kanamycin 之 N01B1 培養基上，於 25℃以 16

小時光照環境下次篩選，切下約 1 公分長無白化之芽體，扦插於含有 250

mg/L Cefotaxime 與 200 μg/mL Kanamycin 之 MS 培養基上，於 25℃以 16 小時光照環境下培養，使其發根。

(九) 擬轉殖株之分析

1. 基因組 DNA 之抽取

基因組 DNA 之抽取方法，係修改自 Dellaporta 等 (1983) 所提出之方法。秤取0.5-1.0 g 植物材料，以液態氮研磨至粉末狀，加入 15 mL extraction buffer [100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA (pH 8.0), 500 mM NaCl、10 mM β-mercaptoethanol] 混合均勻，於冰上加入 1 mL 20% SDS，震盪後於 65℃水浴反應 10 分鐘，加入 5 mL 5 M KAOc 混合均勻，於冰上靜置 20 分鐘，於4℃以 10,800 rpm (Beckman J2-MC, JA-13.1) 離心 20 分鐘，將上

清液以尼龍網過濾至新的離心管中，加入10 mL -20℃異丙醇，混合均勻，

於-20℃靜置 30 分鐘，於 4℃以 10,800 rpm (Beckman J2-MC, JA-13.1) 離心 15 分鐘，去上清液，風乾後加入 700 μL High-TE [50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM Na2EDTA] 回溶 DNA，將溶液移至微量離心管，於 4℃以 13,200 rpm

(Eppendorf Centrifuge 5415D) 離心 10 分鐘，將上清液移至新的微量離心管，加入75 μL 3 M NaOAc (pH 5.2) 與 500 μL -20℃異丙醇，混合均勻，

於4℃以 13,200 rpm 離心 10 分鐘，去上清液，先後加入 70%酒精與 100%

酒精，於4℃以 13,200 rpm 離心 5 分鐘，去上清液，風乾後加入 100 μL 含有10 mg/mL RNase A 之 TE (pH 8.0) 回溶 DNA，於-20℃貯藏備用。

2. 樣品製備

取20 μg 基因組 DNA 進行限制酶，於 75℃處理 10 分鐘終止反應，加入1/10 倍體積之 4M NaCl 與 2.5 倍體積之 100% 酒精，於-80℃沉澱 30 分鐘，於4℃以 13,200 rpm 離心 10 分鐘，去上清液，先後加入 70%酒精與 100%酒精，於 4℃以 13,200 rpm 離心 5 分鐘，去上清液，風乾後加入 25 μL TE (pH 8.0) 回溶 DNA，再加入 10 X DNA loading dye，以 0.7%瓊指膠體進行電泳分離。膠體依序以200 mL 0.25 N HCl、變性緩衝液 (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH)、中和緩衝液 [1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 M EDTA (pH 8.0)] 各浸泡處理 15 分鐘二次，以 200 mL 10 x SSC 緩衝液 (1.5 M NaCl、0.15 M trisodium citrate) 進行轉漬 16-18 小時，將 DNA 轉漬至 Hybond-N 膜上，以 120 mJ/cm² UV (Spectrolinker XL-1500) 進行 cross-linking 後，於 80℃真空烘箱乾燥 1 小時，於防潮箱貯藏備用。

3. 探針製備

探針之製備方法，參照 Feinberg 與 Vogelstein (1983) 所提出之 radom primer labeling 方法。取 25-62.5 ng 變性之 DNA 當作模板，加入 10 X labeling buffer {50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 5 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.2 M N-[2-hydroxyethy]piperazine-N’-2-[ethanesul-fonic acid] (HEPES), 26 A260

units/mL random hexadeoxyribonicleotides}、25 μM dATP、25 μM dTTP、25 μM dGTP、400 μg/μL bovine serium albumin (BSA)、50 μCi [α-³²P] dCTP (333

nM) 與 5 units Klenow polymerase，反應總體積為 50 μL，於 37℃反應 2 小時，加入2 μL 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) 終止反應，再加入 8 μL 追蹤染劑 (50% glycerol, 0.25% bromophenol blue) 混合均勻後，將反應液加入 Sephadex-G50 層析管柱，以微量離心管接取通過之溶液，並使用液態閃爍計數器 (Beckman LS1801) 測量放射性同位素讀值，選取最高值做為探針。

4. 南方氏雜交分析

南方氏雜交方法，係修改自 Southern (1975) 所提出之方法。將 Hybond-N 轉漬膜放入預雜交溶液 [6 X SSPE (1 X SSPE: 0.15 M NaCl, 10 mM NaH2PO4, 1 mM Na2EDTA, pH 7.4), 5 X BFP (1 X BFP: 0.02% BSA, 0.02% Ficoll-400000, 0.02% PVP-360000), 1% SDS, 10% dextran sulfate, 50 μg/mL salmon sperm DNA]，於 65℃水浴以 20 rpm 震盪反應至少 2 小時，

將預雜交溶液倒出，加入雜交溶液 [6 X SSPE, 5 X BFP, 0.5% SDS, 250 μg/mL salmon sperm DNA, 10% dextran sulfate, 3 x 10⁶ cpm/mL 之變性核酸探針]，於 65℃水浴以 20 rpm 震盪反應 16-18 小時，將雜交溶液倒出，於室溫以Wash buffer I 溶液 (2 X SSPE, 0.1% SDS) 20 rpm 震盪處理 15 分鐘，重複兩次，在於65℃水浴以 Wash buffer II 溶液 (1 X SSPE, 0.1% SDS) 20 rpm 震盪處理 15 分鐘，重複兩次，即可於-80℃進行 X 光片壓片 (Kodak XAR film)。

5. GUS 活性組織化學染色法

GUS 活性組織化學染色之方法，係修改自 Jefferson (1987) 所提出之方法。植物材料浸泡於含有Triton X-100 之緩衝液 [50 mM NaPO4 (pH 6.8), 1%

Triton X-100]，37℃下處理 2 小時，以緩衝液 (50 mM NaPO4, pH 6.8) 沖洗三次，加入含X-gluc 之緩衝液 [50 mM NaPO4 (pH 6.8), 1 mM X-gluc]，以 25 inch-Hg 真空抽氣 5 分鐘二次，回壓後置於 37℃下反應 24 小時，最後以

70%酒精終止酵素反應及褪去葉綠素，並於室溫下浸泡保存。

(十) 轉殖株之啟動子活性與誘導分析

1. 無菌播種

於無菌操作台，將阿拉伯芥或菸草種子放入微量離心管，加入 70%酒精震盪清洗1 分鐘，再以 1%漂白水 (含 0.05% Tween-20) 震盪清洗 15 分

鐘，以無菌水沖洗漂白水3 次，每次 5 分鐘，加入等體積之無菌水懸浮種

子，播種於含有抗生素 (50 μg/mL Kanamycin) 之 1/2 MS (含 1% sucrose) 固體培養基，培養於25℃、16 小時光照及 8 小時黑暗環境。

2. 不同發育階段之啟動子活性分析

取無菌播種後 5、10、15、20、25、30 天大與開花之菸草轉殖株，進行GUS 活性組織化學染色。

3. 不同非生物性逆境誘導處理

取無菌播種後21 天大菸草 T1 轉殖株，以下所列出之逆境進行處理，

除了高溫、低溫與低溫黑暗處理，其他處理皆於25℃、光照 16 小時、黑暗

8 小時之培養室進行，處理後以 GUS 活性組織化學染色，觀察啟動子表現情形。

(1) 高溫逆境處理

將菸草 T1 轉殖株含培養基，放入生長箱以 37、42、45℃處理 24 小時。

(2) 乾旱逆境處理

將菸草 T1 轉殖株置於乾的濾紙上，處理 3 小時。

(3) 低溫處理

將菸草 T1 轉殖株含培養基，放入冰箱以 4℃處理 24 小時。

(4) 黑暗處理

將菸草 T1 轉殖株含培養基，以鋁箔紙包覆避光處理 24 小時。

(5) 低溫與黑暗處理

將菸草 T1 轉殖株含培養基，以鋁箔紙包覆避光，放入冰箱以 4℃處理 24 小時。

(6) 鹽分逆境處理

將菸草 T1 轉殖株置於以 300 mM NaCl 浸潤之濾紙上，處理 3 小時。

(7) 淹水逆境處理

將菸草 T1 轉殖株自培養基取出，放入小試管以無菌水淹蓋處理 24 小時。

(8) 機械創傷處理

以解剖刀劃傷菸草 T1 轉殖株之葉片製造創傷，再置於以含 1% soucrose 之1/2 MS 液態培養基浸潤之濾紙上，處理 0.5 或 1 小時。

4. 不同生長調節劑誘導處理

生長調節劑誘導處理試驗，係修改自Tsuchisaka 與 Theologis (2004) 及 Wang (2005) 所提出之方法。取無菌播種後 21 天大菸草 T1 轉殖株，置於

以含有以下不同濃度生長調節劑之1/2 MS 液態培養基浸潤之濾紙上進行處

理24 小時，處理皆於 25℃、光照 16 小時、黑暗 8 小時之培養室進行，處

理後以GUS 活性組織化學染色，觀察啟動子表現情形。

(1) Auxin：20 μM indole-3-acetic acid (IAA) (2) Benzyadenine：20 μM BA

(3) Gibberellin：20 μM GA3

(4) Abscisic acid：100 μM ABA (5) Methyl jasmonate：50 μM MeJA (6) Salicylic acid：1 mM SA

(7) Ethylene：50 μM 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC)

肆、結果

一、香蕉MhDnaJ 基因結構分析

(一) 香蕉 MhDnaJ 基因序列分析

將 λMACS38 基因序列與 pMACS38 cDNA 序列比對，顯示香蕉 MhDnaJ 基因含5 個顯子及 4 個隱子 (圖五)，轉譯起始密碼子於第一個顯子，轉譯終止密碼子於第五個顯子，而顯子與隱子連接處之胺基酸序列，均符合 GT-AG rule (表一)。基因組選殖系 λMACS38 與 pMACS38 分別轉譯出 273

與217 個胺基酸，比較基因序列與相對應之 cDNA 序列，有一個核苷酸差

異，使第 190 個胺基酸由組胺酸變為精胺酸 (H134R)。比較香蕉 MhDnaJ 與其他物種如阿拉伯芥 (AtDnaJ, NP_565163) 、水稻 (OsDnaJ, NP_001060336) 、楊樹 (PtDnaJ, XP_002302268) 、蓖麻 (RcDnaJ, XP_002513851) 、葡萄 (VvDnaJ, XP_002285821) 和玉米 (ZmDnaJ, NP_001140575) DnaJ 胺基酸序列的相似性，介於 65.9% - 71.6% 之間，而

與葡萄相似性最高，為71.6% (表二)。胺基酸序列分析顯示，香蕉、阿拉

伯芥、水稻、楊樹、蓖麻、葡萄和玉米都具有J-protein 特有的 J-domain，

另外還有Nuclear localization signal (NLS) 與 Nuclear export signal (NES) (圖六)。親緣樹狀圖分析結果顯示，香蕉 MhDnaJ 在演化上和水稻與玉米的同源性較高 (圖七)。

(二) 香蕉 MhDnaJ 基因啟動子序列分析

分析已取得之香蕉MhDnaJ 基因啟動子序列，以 PlantCARE 資料庫比 對，預測 TATA box 位於於轉譯起始點上游 287-291 bp，序列為 TAATAA，

CAAT box 則位於轉譯起始點上游 518-522 bp，序列為 CAAAT。根據比對

ggatccagtaaggacaaacccgagcgaccgcccggagcccgaggtattatctccggattt -3261 HSE

aacggactccctacgagcccagctactctttctttggcagcggctcgatgaactagagaa -3201 ggagtttcgcaactcgaagggagagctcggggtggacacatatcgaggatctccgttcac -3141 accagagatacgagatcacgcggttcccccgaatttccagctcacttctatggacgcata -3081

MBS

cgacggctccattgacctagcggaccatgtcgccgctttccgtgcccaactggcactata -3021 AuxRR-core

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MBS HSE

cgggctaactgatacatcatagcggaggcctgggcgcggcgcgaggagaagggacgacct -2601 ccgaccgtgggctccatgagagaggccaagcatccgcggtggctacccgatgtactcatg -2541

HSE

aaaagaaatctaagccctgccttagtctcttctgagcgaaggttcagtatctgcctgacc -2481 cccttttcggctcgcggttggccccagcttaaacccttctgaatctaaatgccttggcca -2421 tggactgcccgggtccacctcagcgaggcctgcccggcctaagttgtgtccctcggcctg -2361

G-box

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ttgtgtccctcggcccgagccacgtccctcggccatgcactgcccgagtccacctcagcg -2241 cggcctacccgcctgagccatgtccctcggtcgcactctgcccaagtccacctcagcgcg -2181 gactatccgcctgagccaagggtcccccgagtccacctctacttggcttgctgaccgagt -2121 tgcgctcctcgactacatgttgcccgggcccatgcctgcgcggctagccccgctgcgccg -2061 tgctcctcggctgcgtgttgcccaagactacacctacgcggcctgcccgcctgcgtcgtg -2001 ttccttagctccatggcctccgagacacacctgcgcggcctgcccacctgcgtcgtgctc -1941 ctcggccccatgacccgagacacacctttgcggccagcccgcctgtgtcgtgctcctcgg -1881 ctacatgttgcccgagaccacgcctgcgcggcctgcccgtctgcgccgtgttcctcggtc -1821 gcacgttgtccgaggccgcaacctctactcggcttcccgacttagttgggctcctcgacc -1761 ccatttcccgagccacacctgagcggccagcacgcctacatcgtgctcctcggctccatg -1701 ttgcccgagaccacacttgcgcggccagtccgcctgcgtcgtgctcctcggttacacatt -1641

CGTCA-motif

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gaagccatgcatcagactcctcttatacaacaaccgacgcatagctcctttcaggggggg -1461 GATA-motif CGTCA-motif

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CGTCA-motif

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CGTCA-motif

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HSE

ctttctatacgcagaagatattcgattcctgagttgactcggacgagtttggtatgggag 0-561 (Countinued)

CATA-box

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ccattcggttactgtctcggtgattgaaacacgtgatggccccatcttaatcagtagaca 0-441 CGTCA-motif G-box

agtcggccgtcaagtaacgcacaaacgtcgactaaaagatgaagcacgtcccgcttctgc 0-381 agctacggccaactcggacaccaactcatgaagtgttcttcatatcgtgtctttcgtacg 0-321

CGTCA-motif TATA-box

cagtccccacgtcagatcgaaatggttcataataatactcgactctcacgaccttttgag 0-261 gcggaacgagcaacaaagcacagcaccatacagcatttacatcgatcgaggaagcgccac 0-201 gtacgacgtacagacaccaaatgattcggtcctctcgttcctcgggagacattcctcggg 0-141 ggagacatttccgtcacgaatctcccaacctccgagccccggaaaaaactcctctcccgg 00-81 ccatctatttcttcccccaaatcgaaaccgtaacccttaattccaatttccccttctcct 0OO-21 ttcctcctactgctctcaggATGAGCAGTCTGAGAGTGATTTGCCGCCCGCACGTGGTCG 00+40

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ATCCTATGAAGgtacatattataattttgtatattcgtttacattcttaatctaattatt +1780 NOOPOOMOOK

atgcccattttattgactactttttaattaaccattccatgtcttgtaatgagaggttat +1840 gaggttgtttntgctacctcaatcttgccaaaatttctttgtgattattgtttttgtgac +1900 caagatgtgtcaaactgactcttttttatctcattcctcttacaatagaaatgttataga +1960 gatactttaggaatttacaatacccttgtgtatttaaaaagacttgagaaaataaagttg +2020 tgtatttaaaaaggaaaataactaagaagttcatagtataagttttgaatcaaatctaaa +2080 taaatattaaataatataattttgtaattttttttgttataaaattgacgaaggatttat +2140 (Countinued)

ttttgacaataaattcataatgtattgtttacaattaattaataacttagtttttaaaat +2200 caatgaatgcaaaaaaattaataatttagtttctgaaaccaattgatattttcttaatac +2260 cttatcaattgtaggagaattcttaatcagtatcctaaagttgatggaacatcaactgat +2320 gctctaaagttaataaaatattactatttacgtgataggatagcctatagttagtgtttc +2380 agatggaagtatatattatagacattgtagatgttaatataaagtttgtgtcacagggtt +2440 gtaggttcttagttatatcctgttaaatgtcatggaaagtgacccatgaatttgtcaaag +2500 taaaccttaatagagagaaatatgtggtacctaagtttgtaacttgcggagcttttctat +2560 gcccttgagcaactgaacaggtccaaaagatatgctaaaaataacaatagtgaagcttcc +2620 aagttagtcagtttaaagcagttttatttgcttctgttttatgaaattcctacactgtat +2680 atgatctcaaaactatatttatcaggggctaaatataaaaatataaattaatttgaagat +2740 ccaacaatggagcgatagggaacacttatattaataccttctcaacacaattagaaagaa +2800 aaagaataacattgcacataccataataaaacagctcagttaggttatataaaagtaacc +2860 tgtgcatacagaattagcatttgtagttaaccttattaaagagtttatagataatatatt +2920 aaaaagttttactgatttaaacttgagaaagcaatccaaatatgcctgtctaccaaaagt +2980 gcctccctagagaaagaccgatgatttaatccatatagactttttgtgtaataaaagagg +3040 aaggccatatatgtcagcctcacagttggctctgctggccttcaactcttgttaacaaag +3100 tagtttactattatgatggtaaccgagagagagatgcagagatacgacacaaccttcaag +3160 gtgcataaaggaaagcgagggaggcgagagtgcctcttggccccatttcctctaccctga +3220 tatagatacaggttttaaggacatttctcattgccaacactttgattcaactcttttgtg +3280 ttattggaaaatttcaccataaatttaattgtatggacatctttataattaatgctatac +3340 caaaaatgtgaaatatttgtcatatacaggtgcattactatcagcctcttttattttaga +3400 agtaaatggttttctttgtataaattccaacattctttgtgtttgcacctatcagGCTTC +3460 OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOAOOS

CCAGGCATGGATGGAATGGGTGATGAAAAAGCAAAAAGCATTTGATCAGCGTGGTGATAT +3520 OOQOOAOOWOOMOOEOOWOOVOOMOOKOOKOOQOOKOOAOOFOODOOQOOROOGOODOOM

GGCAATTGCTGCTTGGGCTGAACAGCAGCAACATGAGATGAATCTCCGAGCACGTCGTCT +3580 OOAOOIOOAOOAOOWOOAOOEOOQOOQOOQOOHOOEOOMOONOOLOOROOAOOROOROOL

TTCTCGTTCAAAGgtttataagtacattatattatatacaagaatttgtcttgggactgc +3640 OOSOOROOSOOK

ttgaatgccagcaaatagctaactggcacctcattaattcattactgaatgtgcattctt +3700 gtggagttgattgacccaaagcttttttcataccattaaataaagacaattttttttgac +3760 ataaggactaatgagtagatccattttttaaaaaatgagtgtttaattgtttagtttgac +3820 ttactttcaatcctgtgtttctggtgctttactgatgaacgacactccattttattactt +3880 tgtcatagcttttacctacttcattgttagtcgcagtctgtcatattaactccaagtagt +3940 ataaatcatgatttttgaagtgtgaaaaccatgattactgagtcaattggtctcacgtcg +4000 tcgttcattttgttgaaacactatttcattatttttgaatttttgtttgaaatgcaattt +4060 agatgtttctaactagatactttctgttttcttcgtattttcattttttcttttttgtcg +4120 tcatctgagatgctcccttcatatggctgacactcctgtggtcagggttttactctttta +4180 ctgctctcctttcagtgcttattcggcagcattactttcttcctcttaggttcactagca +4240 cttggtaaatgtcaccatatttcagATTGATCCTGAAGAAGAGAGGAAGATTTTGGCAAA +4300 OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOIOODOOPOOEOOEOOEOOROOKOOIOOLOOAOOK

GGAGAAGAAAGCATCCATGGAGTACTTCACCAATACCCTGAGAAGACATACACTTGTTCT +4360 OOEOOKOOKOOAOOSOOMOOEOOYOOFOOTOONOOTOOLOOROOROOHOOTOOLOOVOOL

GAAGAAGAGAGATTTAATGCGGAAAAAGGCAGAGGAAGACAAGAAAAGGGTCATTAGTCA +4420 OOKOOKOOROODOOLOOMOOROOKOOKOOAOOEOOEOODOOKOOKOOROOVOOIOOSOOQ

GCTTTTAGCGGCGGAAGGTCTCGAGCTTGATACAGACGATGATGATGAAGCTGTATGATG +4480 OOLOOLOOAOOAOOEOOGOOLOOEOOLOODOOTOODOODOODOODOOEOOAOOVOO*

AATTGTTCATCATATGGGAAAATTTGTTGTACATACAGAGATCTCTTTATTTCTGGTCAT +4540 GGAAAGCAGGTAATGAAATCTGTCTAATATTTTTCTCTTAACTGTATCCTATGATATATA +4600 TCATTGTTTTATCGGTATAATCTGAAATCAGTACATCTAAATAGAATGATCGAAAATTAG +4660 CATGACCCAAcccagtgtttgtcaagtacaaattgttctgattggtctcaatctttcgta +4720 tgggtgaagattcaattactgaatgtaatatgaccgcactagca .+4764

圖五、香蕉MhDnaJ基因之核苷酸及演繹胺基酸序列

Fig. 5. The nucleotide and deduced amino acid sequences of the MhDnaJ gene from banana. The first nucleotide of putative translation start site is denoted by

+1. The numbers for the nucleotide are shown on the right. Starting at the translation start site nucleotides in the structural gene sequence are indicated by positive numbers, whereas those in the 5’-flanking region are by negative numbers. Lowercase letters indicate introns and part of the flanking regions.

ABRE: abscisic acid responsive element. AuxRR-core: auxin responsive element. CGTCA-motif: MeJA-responsive element. GATA-motif: part of a light responsive element. G-box: light responsive element. HSE: heat stress responsive element. MBS: MYB binding site involved in drought-inducibility. *:

stop codon.

表一、香蕉MhDnaJ 基因之顯子與隱子連接部位核苷酸及胺基酸序列

Table 1. MhDnaJ splice-junction nucleotide sequences. The size of each exon and intron were determined from the exon-intron boundaries by comparing the nucleotide sequence of genomic DNA with the cDNA sequence and according to the GT/AG rule of splice junctions.

Exon No.

Exon size

(bp) 3’Exon junction 5’Exon junction Exon No.

1 370 CCCTTGgtaatt-- (intron 1, 246 bp) --atgcagAACTGG 2 . ...L E O.L

2 75 CAGATGgtttct-- (intron 2, 1014 bp) --ctaaagTTTATG 3 ..P D VO. Y

3 140 ATGAAGgtacat-- (intron 3, 1724 bp) --tatcagGCTTCC 4 .M

.

K A ..S

4 138 TCAAAGgtttat-- (intron 4, 672 bp) --tttcagATTGAT 5 .SO^..K .I ..D

5 405

*. Bases from exons are shown in capital letters and those from introns in small letters.

--. Indicates the remaining nucleotides in introns.

表二、香蕉、阿拉伯芥、水稻、楊樹、蓖麻、葡萄與玉米DnaJ 胺基酸序列相似性

Table 2. Pairwise comparison (%) of the deduced amino acid sequences among DnaJ from Musa spp. Hsien Jin Chiao (MhDnaJ), Arabidopsis thaliana (AtDnaJ, accession number: NP_565163), Oryza sativa Japonica type (OsDnaJ, accession number: NP_001060336), Populus trichocarpa (PtDnaJ, accession number:

XP_002302268), Ricinus communis (RcDnaJ, accession number:

XP_002513851), Vitis vinifera (VvDnaJ, accession number: XP_002285821), and Zea mays (ZmDnaJ, accession number: NP_001140575). Amino acid sequence were aligned using the AlignX program of Vector NTI 10.0 software.

MhDnaJ

AtDnaJ OsDnaJ PtDnaJ RcDnaJ VvDnaJ ZmDnaJ

MhDnaJ

100

AtDnaJ

68.8 100

OsDnaJ

66.3 61.8 100

PtDnaJ

66.9 67.5 58.0 100

RcDnaJ

66.7 68.2 61.2 72.3 100

VvDnaJ

72.0 70.3 62.5 71.4 70.8 100

ZmDnaJ

68.7 62.9 84.2 59.7 62.9 63.5 100

圖六、不同作物之DnaJ胺基酸序列比較

Fig. 6. Comparison of the amino acid sequences among DnaJ from Musa spp.

Helix I Helix II

Helix III Helix IV HPD

NES NLS

J domain

Hsien Jin Chiao (MhDnaJ), Arabidopsis thaliana (AtDnaJ, accession number:

NP_565163), Oryza sativa Japonica type (OsDnaJ, accession number:

NP_001060336), Populus trichocarpa (PtDnaJ, accession number:

XP_002302268), Ricinus communis (RcDnaJ, accession number:

XP_002513851), Vitis vinifera (VvDnaJ, accession number: XP_002285821), and Zea mays (ZmDnaJ, accession number: NP_001140575). Amino acid sequences were aligned using the AlignX program of Vector NTI 10.0 software.

Shadings indicate the degree of homology at each position: black= 100%; dark gray= 80%; light gray= 60%. Number at the end of each sequence refers to the number of amino acid in the sequence. The black lines indicate J domain, red lines indicate helix (I-IV), green lines indicate HPD motif (HPD), and blue lines indicate nuclear localization signal (NLS) and nuclear export signal (NES) conserved amino acid.

PtDnaJ RcDnaJ AtDnaJ VvDnaJ MhDnaJ OsDnaJ ZmDnaJ

0 5

10 15

圖七、不同作物之DnaJ胺基酸序列親緣性分析

Fig. 7. Phylogenetic analysis of the deduced amino acid sequences (from No.

66-273 amino acid of MhDnaJ) among DnaJ from Musa spp. Hsien Jin Chiao (MhDnaJ), Arabidopsis thaliana (AtDnaJ, accession number: NP_565163), Oryza sativa Japonica type (OsDnaJ, accession number: NP_001060336), Populus trichocarpa (PtDnaJ, accession number: XP_002302268), Ricinus communis (RcDnaJ, accession number: XP_002513851), Vitis vinifera (VvDnaJ,

在文檔中香蕉果實後熟相關基因MhDnaJ之啟動子活性與基因功能分析 (頁 37-0)