腸道細菌數目變化分析

4.2.1 腸道黏膜細胞內吞細菌(mucosal endocytosed bacteria)分析

將實驗動物之小腸(10 公分, mid-jejunum)及大腸(5 公分)縱剖開以無菌 PBS 洗 PI 第 7 天：

犧牲

PI 第 35 天：

犧牲 第 0 天：

經口餵食 0.2 ml 的 trophozoites 溶液或 PBS

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去食糜後，截切成每段為一公分之腸段。組織分別置於37 ℃， 10 ml 含有 1 mM 乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA, Sigma）及 5.55 mM 葡萄糖 (D-glucose, Sigma) 之無菌 PBS，於 37 ℃水浴槽中作用 10 分鐘。將腸道組織輕輕 pellet)後，將沉底細胞重新懸浮於 1 ml PBS (只含有 5.55 mM D-glucose)。取出少量 細胞懸浮液，與台盼藍染劑(trypan blue solution) 均勻混合 (細胞懸浮液最終含有 0.024 % trypan blue) ，並以血球計數器計數存活細胞之濃度。 光學顯微鏡物鏡觀 察到的腸道黏膜細胞中， 較大的細胞為上皮細胞；較小的細胞為其它在固有層 (lamina propria) 存在的細胞如纖維母細胞、白血球、紅血球等等。從小腸

（mid-jejunum）分離出之大細胞所佔的比例為 52 ±1.6 %，而從大腸分離出之大細 胞所佔的比例則為63.2 ± 2.7 %。將腸道黏膜細胞計數後，最終以0.8 x 10⁶ cells/ml 的濃度加入含有 300 μg/ml 慶大黴素(gentamicin, Invitrogen, CA, USA)及 5.55 mM D-glucose 的無菌 PBS，置於震盪器上以 55 rpm，37 ℃，作用 30 分鐘後，將凝聚

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平板（fresh blood agar plate）（Scientific Biotech Corp.），置於37℃培養。24 小時後，

計算細菌菌落形成單位（CFU）數目。最後將數據標準化為每 10⁶ 個腸黏膜細胞 中有多少菌落形成單位以呈現實驗結果(87, 88)。

4.2.2 腸道上皮表層細菌(superficial bacteria)量分析

取出小腸腸段5 公分(distal small intestine)，縱剖開以無菌之 PBS 將食糜清洗 乾淨及以無菌擦手紙吸走多餘水份後秤重。將腸道裁剪成每段約為1 公分之腸段 後，置入30 ml 之含有 0.016 % 二硫代蘇糖醇(Dithiothreitol, DTT, Sigma)之無菌 PBS 在室溫下作用 15 分鐘以去除腸道表面之黏液(mucus)。將腸道取出，加入無菌 PBS（比例為 0.01 g 的腸段加入 1 ml 無菌 PBS），以震盪搖晃 30 秒，以洗下腸道 表面的黏液和細菌。重複此清洗動作共兩次。將第三次清洗用之PBS，取出 200 μl 塗抹於非選擇性培養基之新鮮血液瓊脂平板（fresh blood agar plate）（Scientific Biotech Corp.），置於37℃培養 24 小時。24 小時後，計算細菌菌落形成單位（CFU）

數目。最後將數據標準化為每公克之腸組織的菌落形成單位數目 (CFU/g)。

4.2.3 腸段總細菌量(total bacteria)分析

以無菌剪刀及鑷子取出小腸及大腸各1 cm，縱剖開後置入無菌之 PBS 中將食 糜去除，再將腸段放入50 ml 無菌之 PBS 再做清洗，以確保食糜完全清除。將腸 段多餘的液體以滅過菌之擦手紙吸乾，加入無菌之PBS（比例為 1 公克組織加入 10 ml PBS）。將均質機和超音波震盪機依序以 75％酒精、兩次無菌 PBS 清洗過後 再使用。分別將小腸及大腸組織以每次10 秒，連續三次的方式將組織在冰上完全 均質化後，再以超音波震盪機破膜10 秒。將均質完後的組織液分別以適當比例稀 釋，取出200 μl 塗抹於非選擇性培養基之新鮮血液瓊脂平板（fresh blood agar plate）

（Scientific Biotech Corp.）中，置於 37℃培養。24 小時後，計算細菌菌落形成單 位（CFU）數目。將每個培養基其菌落形成單位數目分別除以 200μl 中所含組織公

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克數（0.02 公克）以將數據標準化為每公克之腸組織的菌落形成單位數目 (CFU/g)。