國立台灣大學醫學院生理學研究所碩士論文
Graduate Institute of Physiology, College of Medicine National Taiwan University
Master Thesis
梨形蟲感染排除後之小鼠腸道呈現 持續性上皮屏障失常及黏膜發炎的現象：
探討「後感染腸躁症」之致病機轉
Persistent Gut Barrier Dysfunction and Mucosal Inflammation after Eradication of Giardia lamblia
Infection: Implications for the Pathogenesis of Post-Infectious Irritable Bowel Syndrome
陳姿伶 Tzu Ling Chen
指導教授 ： 余佳慧 博士
Supervisor： Linda Chia- Hui Yu, Ph.D.
中華民國 99 年 6 月
June, 2010
I
謝辭
碩班兩年一轉眼間就結束了，一路上學習的過程雖然艱辛但也充滿了歡笑。首 先要感謝最有氣質的余佳慧老師，老師總是能夠非常有耐心的為我講解實驗數 據，不厭其煩地指導我實驗上遇到的問題，也讓我學習到為人師表在教學上應有 的態度。真的很謝謝余老師。此外，我也要感謝我的口試委員陽明腦科所盧俊良 老師、台大醫院吳明賢醫師、以及台大寄生蟲學科孫錦虹老師，謝謝你們熱心的 指導。在此也要特別感謝孫錦虹老師提供我們梨形蟲，讓我們的實驗得以順利進 行。
接下來要感謝腸道實驗室的大家，謝謝彥臻學姐，我永遠都不會忘記我們在八 樓一起做實驗辛苦的時光，挑戰五分鐘吃午餐，縱使身體疲憊仍然硬撐著把實驗 做完，一起在八樓發瘋似的學Giardia 游泳跟 Giardia 對話，真的很謝謝妳幫我這 麼多忙。謝謝絢媛，妳是我最好的實驗夥伴，每次跟妳聊天都覺得很開心，我回 高雄之後要想我喔。謝謝熱心的莉伶學姐，總是能很仔細的教導我實驗技術，也 幫了我很多忙。謝謝瑋庭學長常常跑到八樓來關心我們，幫我們買午餐，解決我 實驗上的一堆疑難雜症。謝謝菁英學姐在我遇到困難的時候為我加油打氣，還有 謝謝霽雲總是能幫我解決電腦上的問題。此外，還有怡禎，謝謝你能夠當Giardia 的機動組。也謝謝孫老師的助理玉嬌及立欣，為了幫我們養出健康的寄生蟲讓妳 們倍感壓力，真的是辛苦了，八樓真是個溫馨的地方啊。也謝謝我的研究所同學 們，最有活力的十二指腸曉君，認識妳這個朋友值得！此外，還要謝謝家人般的 朋友鈴涓，我真的不能沒有妳這個認識十幾年的好朋友，每次光跟妳聊聊天就有 振奮精神的效果。
最後，我要感謝我最可愛的爸爸媽媽，謝謝你們一直支持我做我自己想做的事 情，讓我衣食無缺、無後顧之憂的念書，謝謝哥哥嫂嫂，每次回家都讓我感到很 溫暖，我最愛我的家人了。謝謝孟緯，謝謝你一直擔任我的垃圾桶甚至是出氣桶，
謝謝你在我焦慮的時候安慰我，電腦出問題的時候幫助我。碩班雖然只有短短兩
II
年，要感謝的人很多很多，最後再一次跟所有關心我的人說一聲謝謝，我愛你們！
研究經費致謝
「感謝行政院衛生署暨國立台灣大學傳染病防治研究及教育中心提供經費補助」
“The authors acknowledge the financial support provided by Infectious Diseases
Research and Education Center, Department of Health and National Taiwan University.”
III
摘要
腸躁症是一種功能性缺損的腸道疾病，症狀包括腹部疼痛以及排便習慣的改 變，然而卻無法偵測到明顯腸道組織病變或病原體之存在。最新研究發現在腸躁 症病人身上有低程度腸道組織發炎，黏膜屏障失能和腸腔細菌增生的現象。許多 文獻指出感染性急性腸胃炎之後可能會誘發腸躁症，此種類型特稱為「後感染腸 躁症」。梨形蟲Giardia lamblia 是一種常見以水作傳染媒介之腸道寄生蟲。近年在 挪威之流行病學研究發現，高達80 %受梨形蟲感染的病人在受感染後的 12-30 個 月，且在已排除體內之寄生蟲至少 6 個月之後出現腸躁症的症狀。儘管腸躁症造 成了相當嚴重的醫療問題，但苦於無適當之實驗動物模式，消化醫學界對腸躁症 之致病機轉及原理仍不清楚。因此本實驗的目的為利用梨形蟲感染小鼠建立「後 感染腸躁症」的動物模式，並探討梨形蟲感染期間及後排除期是否會引發腸道屏 障失常及發炎現象。本實驗將Balb/c 小鼠灌食 10e7 隻 Giardia lamblia GS/M 品系 之滋養體，或給予無菌之磷酸鹽緩衝液，並在感染後第0 天至第 49 天每週分別計 數小腸中滋養體的數目以建立出感染曲線。由感染曲線得知，梨形蟲寄生於小腸 之高峰期約在感染第4 天到第 7 天，本實驗中稱為「感染期」；而在感染第 14 天 則完全無法偵測到寄生蟲，因此本實驗將第21 天到第 49 天視為「後排除期」。本 實驗接著分析腸道黏膜層中內吞至細胞內的細菌數作為腸道屏障功能的指標。分 析小腸及大腸之黏膜層細菌量發現，在感染第7 天（中位數分別為 164.2 及 253.4 CFU/g）及第 35 天（中位數分別為 118.4 及 98.1 CFU/g）時皆明顯高於感染前即第 0 天之黏膜細菌量（中位數分別為 0.0 及 0.3 CFU/g）。緩衝液灌食組第 35 天時，
其小腸及大腸黏膜層細菌量與第 0 天相似。在第 7 天時，感染組之小腸及大腸總 細菌量比起緩衝液組顯著增加 4-10 倍，表示腸道細菌在感染期有增生現象; 但第 35 天，感染組和緩衝液組並無差別。此外，在感染第 7 和 35 天時，在小腸之上皮 表層細菌量相較於個別之緩衝液組皆有升高，顯示出梨形蟲感染期至後排除期會 有持續性腸道細菌附著的現象。而在感染第 7 天時，黏膜之 occludin 有片斷化的
IV
情形。此外，小腸組織的骨髓過氧化酶活性在第7 天及第 35 天時也提高。在感染 第7 天時，血液中嗜中性白血球之百分比增加，並在第 7 天及第 35 天的小腸組織 切片中皆有看到大量嗜中性白血球進到腺窩附近。此外，在感染第35 天，小腸中 之腫瘤壞死因子 α （TNFα），細胞激素-1β (IL-1β) 及巨噬細胞炎性蛋白-1α
（MIP-1α）總量增加，並伴隨著誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）表現增加的情形。
由上述之實驗結果顯示，小鼠在梨形蟲感染之「後排除期」，會有腸道上皮屏障失 常引發腸腔細菌持續進入腸組織的現象，並伴隨著腸道發炎及嗜中性白血球的活 化情形產生。而此梨形蟲感染「後排除期」之動物模式或許將來可用來探討「後 感染腸躁症」之致病機轉。
關鍵詞：後感染腸躁症、梨形蟲、腸道屏障、骨髓過氧化酶、嗜中性白血球、誘 導型一氧化氮合成酶
V
Abstract
Irritable bowel syndrome (IBS) is a functional gastrointestinal disorder characterized by abdominal pain and changes in bowel habits, for which neither apparent structural lesion nor presence of pathogen could be found. Recent data indicated that low grade intestinal inflammation, impaired mucosal barrier function, and enteric bacterial overgrowth were identified in IBS patients. Consistent evidence showed that IBS may be the adverse outcome of an acute episode of infectious gastroenteritis, termed post-infectious (PI) IBS. Giardia lamblia is the most frequently identified etiologic agent of waterborne disease worldwide. Recent epidemiological data from Norway indicated that more than 80 % of patients from an outbreak of giardiasis showed IBS symptoms after 12-30 months post-onset of Giardia infection and at least 6 months after the clearance of parasites. Despite that IBS represents a substantial clinical problem, its mechanism and pathogenesis remain poorly understood mainly due to the lack of animal models. The aim of the current study is to establish a PI-IBS model using Giardia-infected mice and to evaluate gut barrier dysfunction and mucosal
inflammation during infection and after eradication of parasites. Balb/c mice were inoculated with 10e7 trophozoites of Giardia lamblia strain GS/M or pair-fed with phosphate-buffered saline (PBS). The trophozoites in the small intestines were enumerated weekly from PI day 0 to 49 to determine the time course of parasitic
VI
infection. Giardia colonization peaked at PI day 4-7 and this period was termed the 'infection phase'; the parasites were cleared by PI day 14, and therefore, day 21-49 was denoted the 'post-clearance phase'. Intestinal epithelial barrier dysfunction was evidenced by increased bacterial colony forming units (CFU) in the gut mucosa. The medium of mucosal endocytosed bacterial counts in the small and large intestines on PI day 7 (164.2 and 253.4 CFU/g) and on PI day 35（118.4 and 98.1 CFU/g）were respectively higher than the values on PI day 0（0.0 and 0.3 CFU/g）. In mouse pair-fed with PBS, the mucosal bacterial counts in small and large intestines on day 35 were comparable with day 0. Total bacterial counts in small and large intestines on PI day 7 in mouse infected with G. lamblia was 4 to 10 times higher than those pair-fed with PBS, suggesting bacterial overgrowth during giardiasis; whereas no difference was seen between the two groups on PI day 35. The numbers of superficial bacteria in small intestines of Giardia-infected mice increased on day 7 and day 35 compared to those pair-fed with PBS, suggesting bacterial adherence during infection and after clearance of Giardia. Increased tight junctional occludin cleavage was noticed in small intestinal mucosa during infection. Heightened intestinal myeloperoxidase activity was found on day 7 and 35. Increased percentage of neutrophils in white blood cells was seen on PI day 7, and augmented neutrophil infiltration into the crypt area in small intestinal tissues was observed on PI day 7 and 35. Elevated intestinal TNFα, IL-1β and MIP-1α
VII
levels were associated with increased epithelial iNOS expression on PI day 35. In conclusion, Giardia-infected mice showed persistent enteric bacterial influx accompanied by mucosal inflammation and neutrophil activation after parasite clearance. The post-giardiasis animals may be suitable models for investigating gut barrier dysfunction underlying the mechanism of PI-IBS.
Keywords: post-infectious (PI) IBS, Giardia lamblia, gut barrier, myeloperoxidase, neutrophils, iNOS
VIII
中英文縮寫名詞對照表
adhesion molecule 固著因子
arginine 精胺酸
biotin 生物素
chemokine 趨化物
cold shock 冷刺激
cytokine 細胞激素
dendritic cell 樹狀細胞
diazonium salt 重氮鹽類
dithiothreitol 二硫代蘇糖醇
endocytosis 內吞作用
eosin 伊紅
ethylenediaminetetraacetic acid 乙二胺四乙酸 fresh blood agar plate 血液瓊脂平板
gentamicin 慶大黴素
haematoxylin 蘇木紫
hemocytometer 血球計數器
interferon(INF)-γ 干擾素γ
Interleukin 細胞激素
lymphocyte 淋巴球
macrophage 巨噬細胞
macrophage inflammatory protein (MIP)-1α 巨噬細胞炎性蛋白-1α
mast cell 巨大細胞
monocyte 單核球
myeloperoxidase 骨髓過氧化酶
nature killer cell 自然殺手細胞
nducible nitric oxide synthase, iNOS 誘導型一氧化氮合成酶
neutrophil 嗜中性白血球
oral gavage 灌食
paraformaldehyde 三聚甲醛
peroxynitrite 過亞硝酸根
phosphate-buffered saline, PBS 磷酸鹽緩衝液 potassium phosphate dibasic 磷酸氫二鉀 potassium phosphate monobasic 磷酸二氫鉀 specific esterase 特異性脂酶
IX
superoxide 超氧化物
tight junction 緊密連結
trophozoite 滋養體
trypan blue solution 台盼藍染劑 tumor necrosis factor (TNF)α 瘤壞死因子α
urethane 氨基鉀酸酯
xylene 二甲苯
X
目錄
口試委員會審定書
誌謝………I 中文摘要………..III 英文摘要………...V 中英文縮寫名詞對照………...VIII
一、前言……….1
1. 腸道組織之外觀結構……….1
2. 腸道生理功能……….1
2.1.物理性屏障……….1
2.2.化學性屏障……….3
2.3.免疫性屏障……….3
2.3.1 巨噬細胞 (macrophage)……….4
2.3.2 多型核嗜中性白血球……….4
2.3.3 適應性免疫反應……….6
3. 腸腔內共生細菌 (commensal bacteria)………..6
4. 腸躁症（Irritable Bowel Syndrome, IBS）……….7
4.1. IBS 之病理症狀………..7
4.2. 後感染腸躁症 Post-infectious Irritable Bowel Syndrome (PI-IBS)………….9
5. 梨形蟲 (Giardia lamblia) ……….10
5.1 梨形蟲分類和自然史(natural course)………...10
5.2 梨形蟲感染引發腸道病變………...11
5.3 宿主對 G. lamblia 感染的防衛機制……….11
5.3.1 自然性屏障………..11
5.3.2. 宿主的免疫反應……….11
5.3.3 梨形蟲對宿主的免疫抑制………..13
XI
6. Giardia 感染與 PI-IBS 之關係………14
7. 本實驗之目的………14
二、材料與方法………..16
1.實驗動物………..16
2.實驗寄生蟲………..16
3.實驗動物分組………..17
4. 組織處理及實驗分析………18
4.1. Giardia lamblia trophozoites 計數………..18
4.2 腸道細菌數目變化分析………...18
4.2.1 腸道黏膜細胞內吞細菌(mucosal endocytosed bacteria)分析………….18
4.2.2 腸道上皮表層細菌(superficial bacteria)量分析……….20
4.2.3 腸段總細菌量(total bacteria)分析………...20
4.3. 白血球總數、嗜中性白血球、淋巴球、單核白血球之百分比計數……..21
4.4. 腸道組織中嗜中性白血球染色（neutrophil staining）……….21
4.5. 腸道組織骨髓過氧化酶（Myeloperoxidase, MPO）活性測定……….22
4.6. 小鼠腸道組織細胞激素之表現量測試………..23
4.6.1 瘤壞死因子 α (Tumor necrosis factor (TNF)α)、巨噬細胞炎性蛋白-1α (Macrophage inflammatory protein (MIP)-1α )、細胞激素（IL-1β、IL-6 及 IL-12）之表現量測試……….23
4.6.2 干擾素 γ（Interferon(INF)-γ）之表現量測試………24
4.7. 小鼠血清中 IL-1β 之表現量測試………...25
4.8. 組織切片及染色………..25
4.8.1 石蠟包埋檢體的製備………25
4.8.2 蘇木紫-伊紅染色 (Haematoxylin and Eosin Staining)………26
XII
4.8.3 免疫螢光染色-誘導型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase,
iNOS）……….26
4.9 西方轉漬法 (Western blotting)……….27
4.9.1 黏膜層蛋白質萃取 ……….27
4.9.2 蛋白質定量………..28
4.9.3 蛋白質電泳………..28
4.9.4 蛋白質分析………28
4.10 細胞凋亡染色-缺口末端標記技術 ( terminal deoxynucleotide transferase biotin-dUTP nick-end labeling, TUNEL )……….29
4.11 統計方法……….30
三、實驗結果………..32
1. G. lamblia 之感染曲線………...32
2. 腸道黏膜細胞之內吞細菌(mucosal endocytosed bacteria)量………..32
3. G. lamblia 感染對於腸道的總細菌量及表層細菌量之影響………33
3.1. 腸道總細菌量(total bacteria)………..33
3.2. 腸道上皮表層細菌(superficial bacteria)量………34
4. 腸道黏膜組織中 occludin 之表現……….34
5. 白血球總數、嗜中性白血球、淋巴球及單核白血球百分比計數……….34
6. 腸道組織中嗜中性白血球染色（neutrophil staining）………35
7. 腸道組織骨髓過氧化酶（Myeloperoxidase, MPO）活性測定………35
8. 小鼠腸道組織 TNFα、MIP-1α、IL-1β、IL-6、IL-12 及 INFγ 之表現量測試……36
9. 小鼠血清中 IL-1β 之表現量測試………..36
10.腸道組織中 iNOS 之表現……….37
11. G. lamblia 感染對於小腸絨毛型態及腸道上皮細胞凋亡之影響………..37
XIII
四、討論 ………39 五、圖表………..49 六、參考文獻………...66
XIV
圖目錄
圖1、腸道管壁結構之縱向剖面圖………50
圖2、G. lamblia 的生活史………..51
圖3、 G. lamblia 之感染曲線………52
圖4、腸道黏膜細胞之內吞細菌量………53
圖5、腸道總細菌量………54
圖6、腸道上皮表層細菌量………55
圖7、Occludin 之蛋白表現量測定………56
圖8、白血球總數、嗜中性白血球、淋巴球及單核白血球百分比……….57
圖9、腸道組織中嗜中性白血球染色………58
圖10、腸組織之嗜中性白血球數量與骨髓過氧化酶活性測定……….59
圖11、小腸組織細胞激素活性測定……….60
圖12、大腸組織細胞激素活性測定………..61
圖13、小鼠血清中 IL-1β 之表現量測試………..62
圖14、腸道中 iNOS 之表現……….63
圖15、G. lamblia 感染對於小腸絨毛型態及腸道上皮細胞凋亡之影響 …………..64
XV
表目錄
表1、G. lamblia 感染對於腸道之內吞細菌量、總細菌量及表層細菌量之影……49
1
一、 前言
1. 腸道組織之外觀結構
腸道管壁之組織結構如圖 1 所示，腸道管腔表面有大量皺摺以增加吸收的表 面積，表面之指狀突起稱為絨毛（villi）。絨毛的表層由上皮細胞所覆蓋，上皮細 胞朝向管腔面的膜上含有更小的突起稱為微絨毛（microvilli），整個所覆蓋的表面 又稱為刷狀緣（brush border）。而固有層（lamina propria）位於上皮細胞之下方，
為富含神經末稍、血管、與免疫細胞的結締組織。在固有層下方則有一層薄的黏 膜肌（muscularis mucosa）。上皮細胞層、固有層及黏膜肌三層構造合稱為黏膜層
（mucosa）。
位於黏膜層下方另有一結締組織稱之為黏膜下層（submucosa），內含有大量 之神經血管。管腔最外層為外肌層（muscularis externa），由兩層平滑肌所組成，
分別為內環肌（circular muscle）及外縱肌（longitudinal muscle），內環肌纖維包圍 在管外，收縮時會造成管徑縮小，而外縱肌收縮時則會造成腸管縱向縮短。此外，
腸道中亦含有腸神經系統，其神經細胞位於黏膜下層的黏膜下層神經叢
（submucosal plexus）及埋在內環和外縱肌間的腸肌神經叢（myenteric plexus）。
2. 腸道生理功能
腸道主要有五大生理功能，運動、分泌、消化、吸收以及屏障功能。由於腸 道腔室中有大量的共生細菌（commensal bacteria），且腸道為第一個與外界食物或 病原菌和寄生蟲接觸的部位，因此屏障功能（barrier function）對人體健康的維持 扮演著極為重要的角色。目前將腸道屏障功能分為：物理性屏障、化學性屏障、
以及免疫性屏障三大類。本論文在此特別針對屏障功能做探討。
2.1. 物理性屏障
2
腸道之物理性屏障包括黏液層及上皮細胞。黏液（mucus）由黏液素組成，成 份為醣蛋白 (glycoprotein)及水，由位於腸道上皮層的杯狀細胞 (goblet cells)分 泌；另外，在十二指腸中尚有布魯納氏腺 (Brunner’s glands)，為多分支的腺體，
開口於腺窩，分泌消化酵素以及黏液。黏液層覆蓋在腸道表皮的外面，為大部分 腸內共生細菌棲息之地。由於黏液不易被細菌的多醣水解酶 (glycosidase)以及宿主 本身的蛋白質分解酶 (protease)所分解，因此可防止細菌直接接觸到腸道上皮細胞 (1, 2)。
上皮細胞具有極性（polarity），可分為朝向管腔的黏膜面（mucosal side）或稱 為頂側（apical side），以及朝向漿液面的漿膜側（serosal side）或稱為基底側
（basolateral side）。相鄰的兩個腸道上皮細胞之間，有特殊的蛋白例如緊密連結
（tight junction）、附著連結（adherens junction）以及胞橋體（desmosone）將基底 側做連結(3)， 其中緊密連結所在之處為兩細胞之間距離最窄的空隙，約 90 Å，位 於基底側細胞膜與微絨毛交接處，是三者中最靠近管腔的結構，緊密結合主要由 三種膜蛋白組成，分別為claudin，occludin 和連結黏連分子（junctional adhesion molecules, JAM）(3); 而附著連結之間的空隙距離約為 200 Å，位於緊密連結與胞 橋體之間 ; 胞橋體之間的空隙距離約為 240 Å，為三者最下方之結構。由於這些 獨特的連結構造，使得細胞間隙相當狹窄，大部分物質無法自由進出腸道上皮細 胞兩側(4)。緊密連結使分子量大於 500 D 的物質無法由細胞間進入，因此阻擋了 管腔中的細菌、毒素、未分解的蛋白抗原等大分子入侵體內，以避免引起不當之 免疫反應(5)。另一方面，些許尚未被完全消化的大分子可經由表皮細胞的內吞作 用 (endocytosis)進入內小體 (endosome)，繼續被融合的溶解酵素 (lysozymal enzyme)分解成不具免疫抗原性的小分子，再釋入固有層，而此類經由細胞吸收進 而將管腔中分子物質帶入固有層的過程，稱為穿細胞路徑 (transcellular pathway)；
而分子物質若經由細胞之間的空隙進入固有層中，則稱為細胞間路徑 (paracellular pathway)(6)。 因此，腸道黏膜層所具有之物理性屏障功能，可以作為人體與外在
3
物質接觸的第一道防線。
2.2 化學性屏障
腸道表面能釋放出抗微生物胜肽（antimicrobial peptides, AMPs），目前在人類 總共有三大類，分別為防禦素（defensins）、抗菌肽（cathelicidins）、以及富組蛋白
（histatin）。抗微生物胜肽主要的功能為 1) 在細菌上穿孔，破壞細菌結構使內容 物流出，而達到殺菌效果、2) 抑制細菌細胞膜的合成、3） 促使細菌細胞膜之自 我水解(7)。另外還有其他功能例如，可趨使嗜中性白血球、巨噬細胞及其他免疫 細胞之聚集，預防細菌接觸及菌落之形成(8)。防禦素為帶正電之胜肽，由小腸腺 窩中的巴聶特氏體（Paneth cell）所分泌，可結合帶負電的細胞壁，在細胞壁上打 洞造成高度通透性，抑制細菌生長和存活(9)。
2.3. 免疫性屏障
免疫反應可分為先天性免疫反應（innate immunity）及適應性免疫反應
（adaptive immunity）。先天性免疫反應的專一性不高，當外來病原菌通過腸道進 入體內時，最快啟動的即為先天性免疫反應，而先天性免疫反應可以進一步活化 適應性免疫反應，但所需時間較長，因此先天性免疫反應為腸道生理中第一道免 疫防禦屏障。
先天性免疫反應一般而言數分鐘即可啟動，其由許多不同種類之細胞及化學 物質所組成，參與其中的免疫細胞包含常駐在固有層的巨噬細胞 (macrophage)、
樹狀細胞(dendritic cells)、自然殺手細胞（nature killer cells）、巨大細胞(mast cells) 以及由血液進入腸道組織中之多型核嗜中性白血球（polymorphonuclear
neutrophils）。其中常駐型巨噬細胞(resident macrophages)是由血液循環中的單核球
（monocyte）進入腸道組織中分化而成。而適應性免疫的活化需花費數天至數個 禮拜，以產生具專一性的T 型淋巴球及 B 型淋巴球。
4
2.3.1 巨噬細胞 (macrophage)
腸道的黏膜層是身體中最多巨噬細胞的貯存地(10)，這些巨噬細胞是來自於血 液中的單核球（monocyte），在非發炎的情況下，血液中的monocyte 會受到固有層 中內生性的化學引誘物（chemoattractant）作用而進入固有層中，這些剛進入固有 層中的巨噬細胞會進行功能上的分化, 而成為仍然能吞噬細菌但不會產生發炎性 細胞激素(cytokine)的巨噬細胞，以避免腸道組織在正常生理時受到不當之傷害，
稱為常駐型巨噬細胞 (resident macrophage)，其可做為腸道天生性免疫反應的第一 道屏障(10, 11)。
而當外來病原體入侵而引起發炎反應的時候，血液中的monocyte 會受到發炎 相關的趨化物（chemokines or chemoattractants）驅使而進入到固有層，能吸引 monocyte 到發炎部位的化學物質可分為三大類：帶有半胱氨酸（cysteine）的 chemokines 或稱為 inflammatory CC chemokines (例如細胞白介素(interleukin-8, IL-8), 巨噬細胞炎性蛋白-1α 【Macrophage inflammatory protein, MIP-1α】；未帶 cysteine 的趨化物質（例如補體【complement components】及轉型生長因子 β
【Transforming growth factor β, TGF-β】）；此外還有 pathogen-derived peptides (例如 formyl-Met-Leu-Phe (fMLP))。其中，當腸道組織受到葛蘭氏陰性菌外壁物質脂多 醣或一些細胞激素例如腫瘤壞死因子α (TNF α) 及 IL-1β 刺激後，會促使腸道上皮 細胞或腸道中的白血球釋出inflammatory CC chemokines，此時 monocyte 會順著結 合在固有層細胞間的蛋白聚糖（proteoglycan）之濃度梯度移動，進入發炎之組織 中(10)。
2.3.2 多型核嗜中性白血球
多型核嗜中性白血球主要是藉由吞噬病原體或釋出細胞內之毒殺物質來達到 殺菌的效果。在血液中的多型核嗜中性白血球在腸道受到細菌感染及發炎反應時 會被組織中的化學趨化物質例如IL-8 吸引，並藉由固著因子（adhesion molecules）
5
與血管內皮細胞結合的作用滲透到組織當中(12)。過去研究顯示，在發炎的情況 下，腸道腺窩中多型核嗜中性白血球的數量會大量增加(13)。
嗜中性白血球可以氧化的方式達到殺菌效果，嗜中性白血球顆粒物質內有大 量的菸醯胺腺嘌呤二核酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase）和骨髓過氧化酵素
（myeloperoxidase, MPO）(14)，由過去研究得知 MPO 酵素活性和嗜中性白血球進 入組織之數目成正比，因此組織內酵素活性的上升可作為嗜中性白血球進入組織 的代表(15, 16)。在嗜中性白血球吞噬細菌的過程中，NADPH oxidase 作用產生超 氧化物（superoxide）;骨髓過氧化酵素由胞內釋放至胞外環境，並催化 H2O2和氯 離子結合，形成次氯酸（hypochlorous acid, HOCl）(17)。超氧化物及次氯酸為一具 有強力殺菌能力的自由基，為中性分子，能使脂質過氧化以利於穿透細菌細胞壁，
在細菌體內進行氧化作用毒殺細菌。此外次氯酸可藉由加氯作用（chlorination）和 細菌結構蛋白結合，此作用已知可加強人體內對此細菌蛋白之免疫反應，加強抗 原表現細胞（antigen presenting cells, APC）呈現細菌抗原之能力(17)。嗜中性白血 球體內的骨髓過氧化酵素亦可釋放到細胞外面，和巨噬細胞上巨噬細胞甘露醣受 器（macrophage mannose receptor, MMR）結合(18)。
嗜中性白血球亦可以非氧化的方式達到殺菌效果。嗜中性白血球中的顆粒可 分為初級顆粒及次級顆粒，初級顆粒會較早釋出其內容物，例如骨髓過氧化酵素、
彈性蛋白酶（elastase）和殺菌/通透性增加蛋白（bactericidal permeability-increasing protein, BPI）等。而次級顆粒中的內容物會在
等待嗜中性白血球活化後才形成，如乳鐵蛋白（lactoferrin）等(19)。其中 BPI 可活 化水解葛蘭氏陰性菌之外層細胞壁磷酸脂，增加細菌細胞壁之通透性，而BPI 同 時也可以透過與細菌細胞壁結合，增強嗜中性白血球吞噬細菌的能力(20)。彈性蛋 白酶則可破壞葛蘭氏陰性菌之細胞壁，但對於葛蘭氏陽性菌則無影響(21)。此外，
嗜中性白血球的顆粒中含有defensins，也是以非氧化的方式將細菌細胞膜打洞而 達到殺菌效果。除了defensins 此種 antimicrobial peptides 外，嗜中性白血球亦能釋
6
出cathelicidin，cathelicidin 具有殺菌之功能且可以避免病原體（例如：致病性的大 腸桿菌）貼附於腸壁(22)。
2.3.3 適應性免疫反應
適應性免疫反應可分為細胞免疫反應（cell-mediated immunity）及抗體免疫反 應(humoral immunity)。細胞免疫反應由 T 細胞所主導，T 細胞可大致分為胞毒性 T 細胞（Tc cell）及輔助性 T 細胞(Th cell)，其中 Th cell 能釋出多種 cytokines，並能 進一步誘導B 細胞的免疫球蛋白的同型轉變(isotype switching)以產生不同型的抗 體。其中IgA 在腸道免疫中扮演著重要的角色，在固有層中的分化的 B 細胞產生 IgA dimer，而 Th1 cell 產生的 IFN-γ 可使腸道上皮細胞表面的 IgA 受體(polymeric Ig receptor)表現增加，進而促使 IgA 穿越上皮細胞而分泌至腸腔中以辨識及包圍病原 體(23)。
3. 腸腔內共生細菌 (commensal bacteria)
腸道中的共生細菌叢從出生後開始建立，其建構會受到幼體的飲食及所處的 生活環境影響。整個腸道中，共生細菌叢的密度及種類由腸道前端至後端遞增，
也就是大腸為最多共生細菌之部位。 據估計人類大腸腔室中細菌數約為每克糞便 1011到1012之多, 而消化道總細菌數為全身細胞數的十倍。這些共生細菌叢會碩造 出一個理想的腸道生態環境，正常生理狀況下不引發任何發炎反應, 並能與外來病 原體競爭營養及空間進而防止外來病原體的入侵(24)。另外最近文獻亦記載了共生 細菌叢能幫助維持腸道屏障功能，例如能夠產生殺菌物質細菌素（bacteriocin）及 乳酸（lactic acid），除此之外還能夠協助分解一些無法消化的食物殘留物質、幫助 離子(例如鎂離子及鈣離子)的吸收、以及產生維生素 K 等功能(24)。
但某些疾病例如腸道缺血再灌流（intestinal ischemia/reperfusion）、腸阻塞 (bowel obstruction)等可見腸道屏障功能失常進而導致大量腸腔內共生細菌或抗原
7
穿越腸上皮細胞甚至轉移至肝臟及脾臟(25, 26)。此腸腔細菌移位(bacterial translocation, BT) 至其它內臟和血液循環的現象, 可能進而引發敗血症（septic shock ）、全身性發炎反應症候群（systemic inflammatory syndrome）甚至是多重器 官衰竭(27)。而這些容易轉移的細菌種類涵蓋了好氧菌及厭氧菌，其中以
Escherichia coli 及桿菌屬（Bacteroides）為主(28)。
此外，過去的研究發現，誘發性的一氧化氮合成酶（iNOS）的大量表現會導 致腸腔細菌移位（bacterial translocation）(29)。而導致 BT 的機制可能是因為過量 的iNOS 使 NO 易結合 superoxide 形成過亞硝酸根（peroxynitrite）會造成腸道上皮 細胞的凋亡(29)，且在內毒素血症小鼠（endotoxemic mice）的實驗中也發現，過 量的iNOS 會導致 tight junction 例如 ZO-1 及 occludin 的破壞，這些都會使腸道屏 障受損而使細菌容易進入體內(30)。
4. 腸躁症（Irritable Bowel Syndrome, IBS）
4.1. IBS 之病理症狀
IBS 是一種功能性異常的腸胃道疾病，患者會有長期的腹痛並伴隨排便習慣的 改變，且透過內視鏡、糞便篩檢等檢查並無發現任何病原體感染或腸道之病變。
所有年齡層及性別的人都有可能罹患IBS，其中女性的罹患率又比男性高。IBS 之 病人在北美洲及歐洲大約佔有10~15 ％的人口，而亞洲地區例如新加坡及東京則 大約佔有8.6~9.8 ％(31, 32)。且 IBS 除了影響到病人之生活品質外，對社會而言 也耗費了相當多的醫療資源。罹患IBS 之病人除了腹痛外，另有腹脹等症狀，且 依據糞便型態的不同還可區分為三大類分別為IBS-D（diarrhea），以腹瀉為主的病 人；IBS-C(constipation)，症狀以便秘為主；以及 IBS-A(alternate)，即腹瀉及便秘 交替。目前消化道醫學界對於IBS 的了解並不多，因此臨床上的診斷方式是採用 問卷問診，需符合下列Rome criteria III，求診者必須要有長達六個月以上的腹部 不適，或每個月至少三天以上感到腹部不適並持續三個月以上，此外並符合以
8
下 ：1) 排便後症狀可以得到舒緩；2) 排便頻率的改變；3) 糞便型態的改變，三 項中兩項之症狀。
由於在IBS 病人內視鏡的診斷上無法看出腸道外觀有明顯的受損，因此早期 甚至將其視為一種精神疾病(33, 34) 。但後來的研究漸漸發現 IBS 病人還是有一些 與一般健康人相異的病理現象。早期研究發現IBS 病人小腸中的腸嗜鉻細胞
（Enterochromaffin cell）、巨大細胞(mast cells)或神經纖維所釋出的過量的神經傳遞 物質血清素（serotonin）會作用於腸神經叢並影響至中樞神經而造成痛覺，此可能 為IBS 病人有腹痛症狀之成因(35, 36)。而雌性激素易導致血清素引發之內臟痛覺 (visceral hypersensitivity)亦被懷疑是 IBS 病患比例女性多於男性的原因之一(37)。
過去有文獻指出，brain-gut axis 的不正常為造成 IBS 的可能原因，例如長期的心 理壓力容易導致IBS (38)。而亦有文獻指出 IBS 病人確實較正常人容易焦慮及情緒 不穩定，此外經由分析IBS 病人心電圖之 R-R interval 也發現，IBS 病人可能有自 律神經功能異常的情形(39)。
最新的研究更發現了IBS 的病人的確有全身性或腸道發炎反應上升的現象，
例如Van der Veek et al.記載利用由血液抽取 DNA 之研究發現，IBS 的病人 TNF α 之基因表現量較正常人為高，而IL-10 此種抑制發炎反應之細胞激素的表現卻較低 (40)，且 Liebregts et al. 研究也發現 IBS 的病人血液中的 IL-6、IL-1β 及 TNF α 濃 度較正常人高(41)，此外 O'Mahony et al.也指出 IBS 的病人血液中 IL-10 與 IL-12 之比例也較正常人低(42)。而 Macsharry et al. 在 IBS 病人大腸組織切片中的分析 也看到TNF-α、IL-6 及 IL-1β 之表現有較正常人高, 但 IL-8、CXCL-9 Monocyte chemotactic protein-1（MCP-1）的表現會減少(43)。且由 Spiller 等人也對 IBS 病人 研究發現，病人腸道上皮細胞內的淋巴球、固有層中的T 細胞以及巨噬細胞皆有 增多的趨勢(44)，其他研究也發現小腸中的 mast cell 數目也有增加之現象 (35)。
整體而言¸目前已公認低程度(low grade)腸道發炎為 IBS 的病變之一(31)。
此外，Spiller 等人利用 IBS 病人的尿液分析乳果糖（lactulose）及甘露醇
9
（mannitol）之比例（L/M ratio）研究發現，病人小腸腸道的通透性較正常人高，
顯示出黏膜屏障的缺損可能促使腸腔內細菌或抗原入侵，可能是造成發炎反應的 原因之一(44)。而 Marshall 等人同樣利用尿液分析方法，分析患細菌感染之腸胃 炎而引發IBS 的病人，也發現腸道通透性有升高的現象(45)。而最近的文獻中，偵 測尿液中聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG) 3350/400 回收比例之研究結果也發 現，IBS 病人確實有腸道通透性較一般人高的情形(46)。此外，以 IBS 病人進行 Lactulose breath test 結果發現，IBS 病人腸道細菌有大量增生的現象(47, 48)。
Posserud 等人利用分析小腸液的方法也看到 IBS 病人小腸中中細菌會大量增生 (49)。
到目前為止，醫學上對於IBS 的病理症狀及致病機轉不甚了解，且實驗動物 模式尚未建立也使得學者對於IBS 的研究更加困難。
4.2. 後感染腸躁症 Post-infectious Irritable Bowel Syndrome (PI-IBS)
急性的病原菌感染結束之後也可能引發 IBS，此種由於感染之方式所引起的 IBS 又特別稱作'後感染腸躁症'(PI-IBS)。所有 IBS 的病人中大約有 6~17 ％屬於 PI-IBS，PI-IBS 在歐洲較為常見，但最近的文獻也指出東方人也會罹患 PI-IBS (35)。具有感染性的細菌被認為是 PI-IBS 主要的致病因子，例如 Salmonella、Shigella 及Campylobacter (35)。其中被 Shigella 感染的病人中約有 8~10 ％會引發
PI-IBS(50)，而病人被 Campylobacter 感染導致 PI-IBS 則約為 10 ％ (51)。近年來 更發現除了細菌外，某些病毒(輪狀病毒、腺病毒、杯狀病毒) 及寄生蟲（例如梨 形蟲Giardia lamblia 及人芽囊原蟲 Blastocystis hominis）的感染也可能造成 PI-IBS (35)。患者的年齡、受感染的病原體種類、以及感染的時間長短，都可能影響到 PI-IBS 的發生與否。
10
5. 梨形蟲 (Giardia lamblia) 5.1 梨形蟲分類和自然史(natural course)
Giardia 為一種常見的腸道原蟲類寄生蟲，最初的命名方式是依據其來源宿 主，但在1952 年的文獻中提出了依照外在型態做為分類的依據，因此目前是依據 Giardia 滋養體(trophozoites)中的 median body 的型態分類。Giardia 可劃分為三大 類：1) G. agilis，感染兩棲類為主；2) G. muris，感染囓齒類或鳥類；3) G. lamblia(又 名G. duodenalis , G. ntestinalis)主要寄主為人類，但同時也會感染老鼠等其他哺乳 類，以及鳥類及爬蟲類(52)。G. lamblia 是一種以水為傳播媒介的寄生蟲。在已發 展的國家中，大約有2 ％的成人以及 6~8 ％的幼童受到 Giardia 的感染(53)。大約 有半數以上的人受到Giardia 感染並不會有任何症狀，然而少部份的人卻會出現嚴 重的腹瀉、腹痛及體重減輕等症狀，但症狀一般都在感染後第6 天到第 15 天出現，
而在症狀出現後大約兩個禮拜即可排除體內之寄生蟲(54)。目前研究指出，造成不 同個體感染Giardia 後有不同症狀反應的可能原因如下:1）宿主的免疫狀態不同；2）
年齡；3）身體營養狀態不同；4）感染的寄生蟲品系與劑量不同(54)。
G. lamblia 的生活史如圖 2 所示，主要可分為兩大時期，第一時期為包囊體
（cyst）期，包囊體為造成傳染的主要媒介，且包囊體具有厚壁可抵抗外界環境之 變化，因此可在多種環境下生存。已有研究證實Giardia 的包囊體在 4℃的水中可 存活長達三個月之久；第二時期為滋養體（trophozoite）期，trophozoite 具有吸盤，
內有兩個胞核，四對鞭毛，能行落葉狀運動。滋養體會貼附在小腸上皮細胞表面 並造成病變。當宿主吃到含有cysts 的食物或水時，cysts 便伴隨食物進入體內。當 cyst 經過胃酸等不同種類消化液刺激後，會在小腸中（尤其是小腸前端）進行脫囊 化（excystation）而釋出 trophozoite。Trophozoite 主要寄生於小腸中，並以無性生 殖之方式大量增生。當trophozoite 由小腸進入結腸後，便會開始進行囊體化
（encystation），再度形成cysts。此時 cysts 便會隨著糞便排出體外，並伺機感染其 他宿主(55)。
11
過去的實驗中，以 G. lamblia GS/M 品系感染 BALB/c 小鼠後，腸道中寄生蟲 的數量在感染後第五天達到最高峰，而第十二天則完全排除(56)；感染 C57BL/6 小鼠也有相同的情形(57)，顯示出 G. lamblia 對老鼠的感染週期大約會在一個禮拜 達最高峰而在約兩個禮拜結束。至於G. muris 對於老鼠之感染週期則可長達將近一 個月(58)。
5.2 梨形蟲感染引發腸道病變
經由動物模式的研究發現，Giardia 感染會使小腸出現功能上或型態上的缺 損，型態上的病變包涵了刷狀緣面積減少(59, 60)、絨毛短縮(61)、以及腺窩增生 (61)。此外在其他方面的影響包含腸道細菌增生(62)、腸道通透性增加(63)、蛋白 脢及雙糖酶的活性降低(60, 64)並會造成黏膜層發炎反應(65)。
5.3 宿主對G. lamblia 感染的防衛機制 5.3.1 自然性屏障
腸道上皮細胞平均每三到五天會進行自然性的細胞凋亡進而脫落於腸管腔 中。因此為了避免因隨著寄主脫落之腸道上皮細胞而被排出體外，G. lamblia 的 trophozoites 必須不停地進行移動，並轉而附著於正常未進行細胞凋亡之腸道上皮 細胞。腸道表面的黏液在調節trophozoite 吸附於寄主腸道上，扮演著一重要的角 色。前人在細胞模式的研究也證實了黏液會阻擾trophozoites 的貼附(66)。此外，
腸道內共生菌也能防止trophozoites 的貼附。過去研究指出，給與灌食腸益生菌 Lactobacillus casei 的小鼠能更早排除腸道中 G. lamblia 的 cysts，並減少 trophozoites 貼附於腸道的數目(67)。
5.3.2. 宿主的免疫反應
具有殺菌能力的胜肽類如防禦素（defensin）及乳鐵蛋白（lactoferrin）在體外
12
實驗中（in vitro）發現具有殺死 G. lamblia trophozoites 的能力(68)。此外，具有殺 菌作用的一氧化氮（nitric oxide, NO）與防禦 G. lamblia 的機制有所相關。NO 是在 一氧化碳合成酶（NO synthase, NOS）的作用之下以精胺酸（arginine）為原料合成。
一氧化碳合成酶可分為三大類：1) endothelial NOS (eNOS)，與血管擴張有關；2) neuronal NOS (nNOS)，與神經傳導有關；3) inducible NOS (iNOS)，當上皮細胞, 巨 噬細胞或其他細胞受到細菌內毒素或酵母多醣（zymosan）刺激之下，或有干擾素
（Interferon gamma, IFN-γ)存在下而誘發產生 NO (69)。由體外實驗中結果顯示，
NO 會抑制 G. lamblia trophozoites 的生長，且對於 trophozoites 有毒害的作用，會 使 trophozoites 數量減少(69)。然而利用人類小腸上皮細胞的實驗中卻發現，G.
lamblia 會藉由消耗 arginine 以競爭減少 NO 的產生(70)。但 NO 在感染 Giardia 的 動物中所扮演的角色仍尚不清楚。目前有研究顯示，預先給予被G. muris 感染的小 鼠NOS 的抑制劑 L-NMMA 對於小鼠體內 trophozoites 數目並沒有影響。但此研究 也無法完全排除 NO 的重要性，因為或許抑制劑無法百分之百抑制所有的 NOS，
或者NO 可能作用在較晚期的 Giardia 感染(71)。此外，前人研究指出小腸上皮細 胞在外來病原體入侵而引發發炎反應下，會增加iNOS 的表現量(55)。
除了有殺菌能力的胜肽類與NO 以外，也有研究發現，在體外實驗當中，人 類的巨噬細胞會吞噬G. lamblia 的 trophozoites (72)。但也有研究顯示，在受 Giardia 感染的病人小腸切片並不會看到巨噬細胞的表現量增加 (73)。而嗜中性白血球也 參與在宿主對抗Giardia 的感染，過去在受 Giardia 感染的山羊小腸中發現，嗜中 性白血球會進入小腸上皮細胞及固有層中(74)。嗜中性白血球所釋出的防禦素能殺 害trophozoites (68)，且在體外的實驗中也發現嗜中性白血球能降低 Giardia trophozoites 的貼附能力(75)。
此外過去研究也指出，interleukin-6 (IL-6)在寄生蟲感染初期寄生蟲數量的控制 及清除體內寄生蟲上扮演著重要角色。IL-6-deficient 小鼠體內 G. lamblia 的
trophozoites 的數目在感染高峰（約感染後第 14 天）時相較於 wild type 組較高，
13
且在感染後第28 天仍無法完全排除 trophozoites (76)。研究指出，IL-6 可由 mast cell 所釋出，而以 G. lamblia 感染之小鼠小腸黏膜 mast cell 數目有顯著性的增加。在 缺乏正常功能 mast cell（mast cell-deficient）的老鼠身上，無法在兩週內排除 G.
lamblia 的感染(56)。經由上述的文獻研究得知，mast cell 在調節 G. lamblia 感染宿 主免疫反應中扮演著重要角色。最近也有研究顯示，mast cell 藉由調控 dendritic cell、B 細胞及 T 細胞而促進適應性免疫反應的作用(77)。但在人類的感染中，IL-6 及mast cell 是否也參與調控的機制則未知。
接著探討宿主所產生的適應性免疫反應。過去研究發現，T 細胞缺陷 (T cell-deficient)的小鼠被 G. lamblia 感染一週後，體內的寄生蟲數目比 wild type 小鼠 多，且無法如正常的wild type 小鼠般能夠在兩週內清除寄生蟲，顯示出 T 細胞在 感染高峰時在G. lamblia 的控制上之重要性(78)。而過去研究也發現小鼠被 G. muris 感染後，CD8＋ T 細胞的表現增加會造成刷狀緣的表面積減少、雙糖酶活性降低、
及增加crypt/villus 長度比例，而 CD8＋ T 細胞及 CD4＋ T 細胞表現增加則會造成 淋巴細胞大量進入腸組織中(60)。此外，研究發現先天缺乏抗體的病人被 G. lamblia 感染後產生症狀持續的時間會較長(79)，且亦有研究指出，IgA-deficient 的小鼠無 論是受到G. muris 或 G. lamblia 的感染後都無法根除體內之寄生蟲(58)。這些文獻 都說明B 細胞在 Giardia 感染較後期（即兩週之後）對感染的控制上相當具有重要 性。
5.3.3 梨形蟲對宿主的免疫抑制
Giardia 對於宿主也會有抵抗的機制，以確保自己能夠在宿主體內順利繁殖。
例如Giardia 的 trophozoites 表面會表現出不同種類的蛋白質（variant-specific surface proteins），此種抗原變異（antigenic variation）的現象使得宿主原已啟動之免疫反 應難以辨識新抗原而無法有效的對抗Giardia (52, 80)。因此 Giardia 具有對抗宿主 發炎及免疫反應的機制，過去研究發現受Giardia 感染的病人中僅有約 4 ％的人出
14
現小腸發炎的現象(73)。也有文獻記載 G. muris 感染之 B10 及 Balb/c 品系小鼠小 腸切片並沒有發炎反應相關細胞（例如lymphocyte）增多的情形，且腸道組織的 IL-6 量反而呈現明顯降低的情形(59, 71)。此外，G. lamblia 會藉由消耗 arginine 以 競爭減少具有殺菌作用之NO 的產生(70, 81)。
6. Giardia 感染與 PI-IBS 之關係
在2002 年的一篇文獻中提到，義大利的一個小鎮爆發了 G. lamblia 的感染，
後來發現這些被感染的病人中高達82 %的病人出現了持續性的症狀（例如腹瀉），
以IBS 問卷進行診斷後發現可能罹患了 IBS，且這些病人的症狀無法利用抗寄生蟲 的藥物而獲得治療。但若以IBS 的症狀作為醫治的方向治療，反而能有效地減低 病患的不適，由此更能證明上述這些病人罹患的疾病為IBS (82)。而在 2006，義 大利針對醫院求診病患的研究也發現，有6.5 ％受到 G. lamblia 感染的病人患有 IBS (83)。
而挪威的Bergen 在 2004 年的一場大雨之後，因為水質的污染而爆發了大規模 的G. lamblia 感染，後來發現這些病人當中，大約有 80.5 ％病人(受 G. lamblia 感 染12 到 30 個月以後，且已根除體內之 G. lamblia 至少 6 個月)無法以抗寄生蟲藥 物治癒，並且伴隨了腹脹、腹痛以及腹瀉等類似於IBS 的症狀出現，而觀察這些 病人的十二指腸切片，則發現到發炎現象的發生(84, 85)。
由上述研究可知，G. lamblia 之感染與 PI-IBS 的發生有著密切之相關性，且 誘發PI-IBS 的比例非常之高, 然而目前對於兩者間關係之研究並不多。
7. 本實驗之目的
目前由於消化道醫學界對於IBS 之病理變化及致病機轉並不清楚，其中主要 原因為尚未有適當的動物模式可供研究。 因此希望藉由 G. lamblia 感染小鼠的方
15
式建立一個PI-IBS 之動物模式，探討 G. lamblia 感染期間以及排除後對於腸道屏障 功能及發炎反應所造成的影響。希望日後藉由此PI-IBS 之動物模式，能夠深入探 討IBS 之腸道生理功能改變及其致病機轉。
16
二、材料與方法
1.實驗動物
實驗中所採用之實驗動物自國立台灣大學醫學院動物實驗中心購買，為無特 定病原體（Specific Pathogen Free, SPF）的雄性 BALB/c 小鼠，年齡為五至六週。
飼養在符合P2 級實驗規定的動物房中，室內溫度維持在 23 ± 2 ℃，溼度 55 ± 5
％，光照自早上七時至下午七時，維持光照週期為白天黑夜各12 小時，並給與充 足滅菌過之飲水和飼料。
2.實驗寄生蟲
本實驗所採用之感染寄生蟲種類為梨形鞭毛蟲Giardia lamblia，GS/M 品系，
由國立台灣大學醫學院寄生蟲學科孫錦虹老師實驗室培養，將正值對數生長期 (logarithmic phase)的 Giardia lamblia 滋養體 (trophozoites)飼養於裝有 TYI-S-33 培 養液(0.6 g/L KH2PO4, 1.3 g/L K2HPO4⋅3H2O,10 g/L Glucose, 2 g/L NaCl【JT Baker, NJ, USA】；20 g/L Trypticase peptone, 10g/L Yeast extract【BD, NJ, USA】；0.2 g/L L-Ascorbic acid, 2g/L L-Cysteine chloride, 0.75 g/L Bile【Sigma, St Louis MO, USA】；10 % bovine serum【Hyclone, MA, USA】)的玻璃試管（Kimble chase, NJ, USA）中(86)，培養液需經由 0.2~0.4μm 之無菌濾網過濾，以確保 trophozoites 生 長在無菌的環境中, 為 axenic culture。每 4 到 5 天更換一次培養液，待寄生蟲生長 之放大培養數量足夠後，開始製備感染液用以感染小鼠。感染液之製備流程如下：
待Giardia lamblia trophozoites 貼附滿 50 ml 塑膠離心管(polypropylene conical tube, BD)管壁後，將離心管置於冰上冷刺激(cold shock) 20 分鐘，使貼附於管壁的 trophozoites 脫落，以 1500 rpm ，4 ℃離心 7 分鐘後，將上清液倒除，再加入無菌 之磷酸鹽緩衝液（phosphate-buffered saline, PBS）以作 trophozoites 懸浮液。 PBS 溶 液配製方法為【8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.12 g/L KH2PO4, 0.91 g/L Na2HPO4, pH 7.4,
17
Sigma】。 利用血球計數器 (hemocytometer) 計數 trophozoites 總數，並以無菌之 PBS 將 trophozoites 溶液濃度調為 108隻trophozoites /ml 。
3.實驗動物分組
實驗組別主要劃分為兩大組，PBS 組及 G. lamblia 感染組。 所有感染步驟皆 於P2 級的無菌操作台及空間內進行並使用滅菌過之器材及溶液。 PBS 組每隻小 鼠以滅菌之短餵食針經口灌食(oral gavage) 0.2 ml 的無菌 PBS。G. lamblia 感染組則 給予灌食0.2 ml 之 trophozoites 溶液 (108 trophozoites/ml) ，並以此餵食日為感染之 第0 天。於犧牲日，將小鼠以腹腔注射氨基鉀酸酯（Urethane, 1.2g/kg B. W, Sigma）
麻醉並剖腹以收集組織進行實驗分析。
實驗動物感染流程 實驗
1：將G. lamblia 組的小鼠，於感染後(post-infectious, PI) 之第 4、7、14、21、28、
35、49 天犧牲；而 PBS 組的小鼠只於灌食後第 7、35、49 天犧牲。將未灌食之小 鼠於第0 天犧牲。於犧牲日，計算小鼠小腸前段 5 cm 腸道中 trophozoites 之數目 以得到G. lamblia 的感染曲線(infection course) (詳見 4.1 方法)。
4
0 7 14 21 28 35 49 (days)
於PI 第 0、4、7、14、21、28、35、49 天犧牲 第 0 天：
經口餵食0.2 ml 的
trophozoites 溶液或 PBS
18
實驗
2：將G. lamblia 組和 PBS 組的小鼠於第 7 天和第 35 天麻醉犧牲以收集組織進行 實驗分析。本論文將感染G. lamblia 後第 7 天視為「感染期」（infection phase）而 第35 天視為「後排除期」（post-clearance phase）。
0 7 35 (days)
4. 組織處理及實驗分析
4.1. Giardia lamblia trophozoites 計數
實驗小鼠以腹腔注射氨基鉀酸酯（Urethane, 1.2g/kg B. W）麻醉後，取出小腸 前段5 公分，縱剖開並以 37℃ PBS 將食糜稍作清除後，將腸道切成 5 段，並置於 2 ml 4℃ 之 PBS。腸道溶液置於冰上以冷刺激(cold shock) 3 分鐘後，震盪搖晃 30 秒，使貼附於腸道壁上之trophozoites 脫落至溶液當中。利用血球計數器計數腸道 溶液中trophozoites 之總數目(58)。
4.2 腸道細菌數目變化分析
4.2.1 腸道黏膜細胞內吞細菌(mucosal endocytosed bacteria)分析
將實驗動物之小腸(10 公分, mid-jejunum)及大腸(5 公分)縱剖開以無菌 PBS 洗 PI 第 7 天：
犧牲
PI 第 35 天：
犧牲 第 0 天：
經口餵食 0.2 ml 的 trophozoites 溶液或 PBS
19
去食糜後，截切成每段為一公分之腸段。組織分別置於37 ℃， 10 ml 含有 1 mM 乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA, Sigma）及 5.55 mM 葡萄糖 (D-glucose, Sigma) 之無菌 PBS，於 37 ℃水浴槽中作用 10 分鐘。將腸道組織輕輕 地收集放入內含新鮮無菌10 ml PBS (含有 1 mM EDTA 及 5.55 mM D-glucose) 的 新管，以手劇烈搖晃10 次後，將腸道組織液體以孔徑為 80 μm 之濾網過濾(nylon mesh, BD)，並收集通過濾網之含有單顆細胞的濾液，置於冰上保存。將殘留於濾 網上的腸道組織再次放入新鮮無菌之10 ml PBS (含有 1 mM EDTA 及 5.55 mM D-glucose)，在 37℃下作用 5 分鐘後，以手劇烈搖晃 10 次，將腸道組織液體以濾 網(孔徑為 80 μm)過濾，並收集通過之細胞濾液，置於冰上保存，重複此步驟一次。
將三次收集到之細胞濾液以1000 x g， 4℃ 離心 15 分鐘，收集沉底之細胞 (cell pellet)後，將沉底細胞重新懸浮於 1 ml PBS (只含有 5.55 mM D-glucose)。取出少量 細胞懸浮液，與台盼藍染劑(trypan blue solution) 均勻混合 (細胞懸浮液最終含有 0.024 % trypan blue) ，並以血球計數器計數存活細胞之濃度。 光學顯微鏡物鏡觀 察到的腸道黏膜細胞中， 較大的細胞為上皮細胞；較小的細胞為其它在固有層 (lamina propria) 存在的細胞如纖維母細胞、白血球、紅血球等等。從小腸
（mid-jejunum）分離出之大細胞所佔的比例為 52 ±1.6 %，而從大腸分離出之大細 胞所佔的比例則為63.2 ± 2.7 %。將腸道黏膜細胞計數後，最終以0.8 x 106 cells/ml 的濃度加入含有 300 μg/ml 慶大黴素(gentamicin, Invitrogen, CA, USA)及 5.55 mM D-glucose 的無菌 PBS，置於震盪器上以 55 rpm，37 ℃，作用 30 分鐘後，將凝聚 之細胞打散（此步驟目的為確保gentamicin 能充分作用殺死細胞外或細胞間的細 菌），再繼續作用30 分鐘。以 gentamicin 總共作用 1 小時以殺死細胞外細菌後，
細胞以無菌PBS (含 5.55 mM D-glucose)清洗兩次（離心 1000x g，4℃，10 分鐘），
洗去細胞外之gentamicin。將沉底細胞以以 5 x 106 cells/ml 的濃度加入含有 1％ 非 離子型表面活性劑Triton X-100 (Sigma)之無菌 PBS 懸浮，置於冰上 10 分鐘，使 得細胞內細菌釋出。取其中200 μl 細胞液塗抹於非選擇性培養基之新鮮血液瓊脂
20
平板（fresh blood agar plate）（Scientific Biotech Corp.），置於37℃培養。24 小時後，
計算細菌菌落形成單位（CFU）數目。最後將數據標準化為每 106 個腸黏膜細胞 中有多少菌落形成單位以呈現實驗結果(87, 88)。
4.2.2 腸道上皮表層細菌(superficial bacteria)量分析
取出小腸腸段5 公分(distal small intestine)，縱剖開以無菌之 PBS 將食糜清洗 乾淨及以無菌擦手紙吸走多餘水份後秤重。將腸道裁剪成每段約為1 公分之腸段 後，置入30 ml 之含有 0.016 % 二硫代蘇糖醇(Dithiothreitol, DTT, Sigma)之無菌 PBS 在室溫下作用 15 分鐘以去除腸道表面之黏液(mucus)。將腸道取出，加入無菌 PBS（比例為 0.01 g 的腸段加入 1 ml 無菌 PBS），以震盪搖晃 30 秒，以洗下腸道 表面的黏液和細菌。重複此清洗動作共兩次。將第三次清洗用之PBS，取出 200 μl 塗抹於非選擇性培養基之新鮮血液瓊脂平板（fresh blood agar plate）（Scientific Biotech Corp.），置於37℃培養 24 小時。24 小時後，計算細菌菌落形成單位（CFU）
數目。最後將數據標準化為每公克之腸組織的菌落形成單位數目 (CFU/g)。
4.2.3 腸段總細菌量(total bacteria)分析
以無菌剪刀及鑷子取出小腸及大腸各1 cm，縱剖開後置入無菌之 PBS 中將食 糜去除，再將腸段放入50 ml 無菌之 PBS 再做清洗，以確保食糜完全清除。將腸 段多餘的液體以滅過菌之擦手紙吸乾，加入無菌之PBS（比例為 1 公克組織加入 10 ml PBS）。將均質機和超音波震盪機依序以 75％酒精、兩次無菌 PBS 清洗過後 再使用。分別將小腸及大腸組織以每次10 秒，連續三次的方式將組織在冰上完全 均質化後，再以超音波震盪機破膜10 秒。將均質完後的組織液分別以適當比例稀 釋，取出200 μl 塗抹於非選擇性培養基之新鮮血液瓊脂平板（fresh blood agar plate）
（Scientific Biotech Corp.）中，置於 37℃培養。24 小時後，計算細菌菌落形成單 位（CFU）數目。將每個培養基其菌落形成單位數目分別除以 200μl 中所含組織公
21
克數（0.02 公克）以將數據標準化為每公克之腸組織的菌落形成單位數目 (CFU/g)。
4.3. 白血球總數、嗜中性白血球、淋巴球、單核白血球之百分比計數
小鼠以心臟採血之方式收集血液，將血液置於含有 EDTA 之採血管(BD, NJ, USA)。取 10 μl 血液置於玻片，以另一個玻片壓住血滴使其均勻擴散之後輕刮，使 血液均勻分佈於玻片上。待玻片自然風乾後，以PBS 潤洗玻片。將 Liu’s A（ASK, Taoyuan, Taiwan）染劑均勻滴於玻片作用 30 秒後，以 PBS 清洗兩次。玻片再以 Liu’s B（ASK）染劑作用 1 分鐘，並利用 PBS 清洗兩次後，待玻片晾乾後即可進 行封片。將玻片放置顯微鏡下觀察白血球細胞核形狀，細胞質顆粒性及細胞大小，
以辨認出單核球細胞（monocyte）、淋巴球細胞（lymphocyte），及嗜中性白血球細 胞（neutrophil）。平均每一抹片共計數 300 至 350 顆白血球，並將其分類，以得到 單核球細胞（monocyte）、淋巴球細胞（lymphocyte），及嗜中性白血球細胞
（neutrophil）在血液中之分布百分比。而採血管剩餘之血液則是送至台灣大學醫 學院實驗動物中心，利用血球分析儀（Medonic CA-620, Stockholm, Sweden）進行 血液中白血球數量之分析。
4.4. 腸道組織中嗜中性白血球染色（neutrophil staining）
本實驗利用naphthol AS-D chloroacetate（specific esterase）（Sigma,90C2）此試 劑進行嗜中性白血球染色。此試劑中naphthol AS-D chloroacetate 可被嗜中性白血 球中的特異性脂酶（specific esterase）水解後，產生自由的 naphthol 化合物，之後 再和試劑中重氮鹽類（diazonium salt）作用後，呈現紫褐色。利用此方法以便確認 嗜中性白血球在切片腸道中分佈位置。
實驗步驟大致如下，將小腸組織切片脫蠟還水後，將其放入檸檬酸鹽-丙酮- 甲醇混合液（citrate-acetone-methanol）於室溫下作用 1 分鐘，之後以二次去離子 水清洗乾淨並在室溫放置乾燥至少20 分鐘。等待的過程中，將試劑中稀釋過之
22
TRIZMALTM 6.3 緩衝液加溫至 37℃，再避光的環境下，加入 2 ml AS-D
chloroacetate 溶液（AS-D chloroacetate 溶液必須在要染色前才可配置，且使用一 次後就需丟棄），此時溶液整體應呈現混濁狀，切記不可過濾。將兩溶液均勻混合 後，將切片放入在37℃環境下作用五分鐘，之後再以二次去離子水清洗至少三分 鐘，等待切片風乾即可封片觀察。詳細步驟可參考Sigma 所附之操作手冊。而定 量之方法則是在每隻小鼠的小腸切片中, 於顯微鏡觀察下隨機選取 5 個 200 倍放大 之圖像視野，並計算其中嗜中性白血球數量之總和。
4.5. 腸道組織骨髓過氧化酶（Myeloperoxidase, MPO）活性測定
此分析原理是利用MPO 會促使過氧化氫和還原態無色 o-dianisidine 作用，轉 換成有顏色氧化態之o-dianisidine，利用褐色吸光值之變化，來求得有多少量之過 氧化氫被消耗。
MPO
過氧化氫 + o-dianisidine 水+ 氧化態 o-dianisidine (無色) (褐色)
因此1 unit 的 MPO 活性之定義為在一分鐘內可消耗 1 μmole 的過氧化氫
實驗步驟如下：
取出大約1cm 的小腸腸段，以 PBS 將食糜清洗及吸乾多餘液體後，將組織放 入1.5 ml 微量離心管，丟入液態氮中急速冷卻，保存至- 80 ℃冰箱。待測試時，
將組織取出並秤重，之後以比例為1 g 組織加入 10 ml 的 50 mM 磷酸緩衝液 (phosphate buffer, pH 6.0) 【內含 0.5 % hexadecyltrimethylammonium bromide, HTAB】。磷酸緩衝液為 7.5 份的磷酸二氫鉀 (Potassium phosphate monobasic, KH2PO4)加入 1 份的磷酸氫二鉀 (Potassium phosphate dibasic, K2HPO4)，兩種溶液 依此比例混合後，即可得到 pH 為 6.0 之緩衝溶液。將組織以均質機均質化 (在冰
23
上操作，均質時間每次10 秒，連續三次），再以超音波振盪機破膜 10 秒。組織液 以轉速為12000 g，10 ℃離心 20 分鐘，之後取上清液 7 μl 加至 96 孔盤中，每一 樣本重複三次。在每一孔中加入反應混合溶液200 μl 後，利用分光光度儀
(spectrophotometer, Bio-Rad, CA, USA)讀取 450 nm 吸光值，每 50 秒讀取一次，共 讀取四次吸光值。反應混合溶液成份為0.005 mM 的 o-dianisidine，0.05 %的 1 ％ 過 氧化氫, 10% 的磷酸緩衝液和 90% 二次蒸餾水(89)。讀取吸光值後，以時間為橫 軸，吸光值為縱軸作分析，可得一斜率，表示每秒其吸光值之變化量。由於已知1 μmole 過氧化氫可以和 o-dianisidine 反應產生 1.13 x 10-2吸光值之變化，因此和實 驗所得斜率相除後，即可得每分鐘有多少μmole 過氧化氫被消耗，之後除以組織 重量毫克數 (7 μl 樣本中，含 0.7 mg 組織)，以標準化。一單位(Unit) MPO 活性之 定義為，每分鐘可消耗1 μmole 過氧化氫。
4.6. 小鼠腸道組織細胞激素之表現量測試
4.6.1 瘤壞死因子 α (Tumor necrosis factor (TNF)α)、巨噬細胞炎性蛋白-1α
(Macrophage inflammatory protein (MIP)-1α )、細胞激素（IL-1β、IL-6 及 IL-12）之 表現量測試
於不同感染天數收集小鼠之小腸前段組織，收集步驟同骨髓過氧化酵素活性 分析所描述。然而在組織秤重後，每1 公克的組織則是加入 10 ml 的 4℃ PBS（每 7 ml PBS 內溶解一顆 complete-Mini 【protease inhibitors cocktail (Roche, Penzberg, Germany）】）。將組織以均質機均質化（在冰上操作，均質時間每次 10 秒，連續三 次），再以超音波振盪機破膜，同樣地在冰上操作，每次10 秒，連續 3 次。之後 將均質液以12000 g，4℃離心 30 分鐘，取上清液保存。取部份上清液做蛋白質定 量，利用DC protein assay kit (Bio-Rad)測量蛋白質濃度。根據偵測不同細胞激素 (cytokine)的需求，將每一樣本以 PBS 稀釋為適當之蛋白質濃度（偵測 TNF α 表現
24
量時，蛋白濃度調整為0.5 mg/ml；偵測 MIP-1α 時表現量時，蛋白濃度調整為 2 mg/ml，而 IL-1β、IL-6 及 IL-12 則分別為 0.2 mg/ml、0.5 mg/ml 及 5 mg/ml）。利用 酵素連結免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit）
【Peprotech Inc., Rocky Hill, New Jersey, USA】，首先加入 capture antibody 作用 24 小時，接著移除capture antibody 且在每一孔洞加入 300 μl 之 wash buffer，並再次 移除wash buffer，以達到清洗之效用，此清洗步驟需重複 4 次。再以 block buffer 進行封鎖非專一性結合作用1 小時，清洗後加入 100 μl 組織上清液和已知細胞激 素濃度之標準溶液至96 孔盤，每一樣本重複兩次，置放於室溫下作用 2 小時（亦 可將其置放於平面搖晃器，轉速為40 rpm，以不搖晃出液體為原則）。作用完畢後 以wash buffer 重複清洗 4 次。每孔洞加入 100 μl 之 detection antibody 於室溫作用 1 小時，在第 4 次清洗步驟後，確認 wash buffer 完全移除，並於每一孔洞加入 100 μl 的 conjugate 溶液於室溫下作用 30 分鐘，作用完畢後再次移除孔洞中溶液，並 重複以wash buffer 清洗 4 次。同樣地在第 4 次清洗步驟時，確認盤中 wash buffer 完全移除完畢後，再於每一孔洞加入100 μl 之受質溶液（ABTS substrate solution）
後，將96 孔盤置放於分光光度計，以波長 405 nm 及 650 nm 讀取吸光值，每五分 鐘讀取一次，共讀取30 分鐘。最後選取加入 ABTS 溶液後，第 20 或 25 分鐘後之 405 及 650 讀值，並以 405 nm 讀取之吸光值扣除背景值 650 nm 讀取之吸光值。將 組織和標準溶液吸光值相比計算後，求出組織上清液中細胞激素之蛋白含量（詳 細步驟可參閱試劑中所附之操作手冊）。本實驗中亦偵測小鼠大腸腸段中TNF α 及 MIP-1α 之表現量，蛋白濃度分別調整為 4 mg/ml 及 1 mg/ml，實驗之步驟如上所述。
4.6.2 干擾素 γ（Interferon(INF)-γ）之表現量測試
小腸中蛋白液之收集如上述，蛋白質定量後將每一樣本以PBS 稀釋為 5 mg/ml，利用酵素連結免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit）【eBioscience, San Diego, USA】分析。首先加入 capture antibody 於 4 ℃中作
25
用24 小時，接著移除 capture antibody 且在每一孔洞加入 300 μl 之 wash buffer，並 再次移除wash buffer，以達到清洗之效用，此清洗步驟需重複 5 次。再以試劑中 之1X Assay Diluent 進行封鎖非專一性結合作用 1 小時，清洗後加入 100 μl 組織上 清液和已知細胞激素濃度之標準溶液至96 孔盤，每一樣本重複兩次，置放於室溫 下作用2 小時（亦可將其置放於平面搖晃器，轉速為 40 rpm，以不搖晃出液體為 原則）。作用完畢後以wash buffer 重複清洗 5 次。在第 5 次清洗步驟後，確認 wash buffer 完全移除，並於每一孔洞加入 100 μl 的 detection antibody 於室溫下作用 1 小 時，作用完畢後再次移除孔洞中溶液，並重複以wash buffer 清洗 5 次。確認 wash buffer 完全移除，並於每一孔洞加入 100 μl 的 conjugate 溶液於室溫下作用 30 分 鐘，作用完畢後再次移除孔洞中溶液，並重複以wash buffer 清洗 7 次。確認盤中 wash buffer 完全移除完畢後，再於每一孔洞加入 100 μl 之受質溶液（試劑中之 substrate solution）作用 15 分鐘後，接著加入 50 μl 之 stop solution(即 2N H2SO4)停 止反應。將96 孔盤置放於分光光度計，以波長 450 nm 及 570 nm 讀取吸光值，並 以450 nm 讀取之吸光值扣除背景值 570 nm 讀取之吸光值。將組織和標準溶液吸 光值相比計算後，求出組織上清液中細胞激素之蛋白含量（詳細步驟可參閱試劑 中所附之操作手冊）。
4.7. 小鼠血清中 IL-1β 之表現量測試
小鼠以心臟採血之方式收集血液，將血液以轉速為 3500 g，4 ℃離心 30 分鐘後取上層之血清利用酵素連結免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit）分析。實驗之步驟同小鼠組織之 IL-1β 表現量測試。
4.8. 組織切片及染色
4.8.1 石蠟包埋檢體的製備
26
剪下腸段1 cm 後，縱剖開並以 PBS 將食糜清除，以釘書機固定於紙板上，
浸泡在含4 %三聚甲醛 (paraformaldehyde) 之 PBS 中固定腸道組織。一週後，組 織依次浸泡在漸進式提高濃度的酒精 (75 % - 100 %)以及二甲苯 (xylene)中進行 脫水以及脫酒精動作，隨後將組織以絨毛及腺窩軸 (crypt to villi axis)以平行於切 割面的角度放置於石蠟中包埋固定。接著以手搖式組織切片機 (Spencer 820 rotary microtome, Cambridge Scientific Products, Cambridge, MA, USA)切成 4 μm 厚度的切 片。進行不同染色實驗前，組織切片皆需進行脫蠟及還水之步驟。步驟為將組織 切片浸泡在二甲苯10 到 15 分鐘去除石蠟，之後將其放入 100 %的酒精 2 次，各 7 分鐘，再依序放入90 %、80 %、70 %酒精各 5 分鐘，以流動清水清洗 30 秒至 1 分鐘，最後以二次蒸餾水清洗之後即可進行染色實驗。
4.8.2 蘇木紫-伊紅染色 (Haematoxylin and Eosin Staining)
組織切片進行脫蠟及還水步驟後，將其放入蘇木紫 (haematoxylin)溶液 2.5 分 鐘，取出以流動清水清洗1 分鐘。將玻片上多餘水分甩乾除去後，轉置伊紅 (eosin) 溶液作用8 秒，取出以流動清水清洗 1 分鐘。將玻片放置 90 %的酒精，迅速拿起，
再放置於100 %的酒精重複一樣步驟，並以二次蒸餾水稍作沖洗，待檢體晾乾後，
進行封片。
4.8.3 免疫螢光染色-誘導型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）
將已脫蠟還水之組織切片置於 50 mM 氯化銨（NH4Cl）溶液，在室溫下 10 分鐘以消滅自發性螢光(autofluorescence)。以 PBS 清洗三次後，加入 2% BSA 以及2% normal goat serum，並於室溫下作用 1 小時以進行封鎖非專一性結合，之 後加入一級抗體作用（如下表），於4 ℃冷房中水平搖晃放置一晚。隔日於室溫下，
再繼續水平搖晃作用1.5 小時。先以 PBS 清洗三次，於避光環境下，加入二級抗 體（如下表），在室溫中作用1 小時。將組織切片以 PBS 清洗三次後，最後在避光
