中，我們主要觀察小腸之絨毛型態的變化。在圖15A 中，在感染第 0 天，也就是 正常狀態下之絨毛，絨毛形狀完整且最外層覆蓋單一層腸道上皮細胞。在經過G.
lamblia 感染後第 7 天及第 35 天，小腸絨毛外觀構造無受到影響，絨毛結構正常。
由此結果得知，G. lamblia 之感染，對感染小鼠之小腸腸道構造並不造成影響。
本部分實驗同時利用TUNEL 的方法，偵測小腸細胞是否有細胞凋亡的現象。
由圖15B TUNEL 結果得知，在感染第 0 天中，小腸腸道上皮細胞並無凋亡之現象。
同樣地，在以G. lamblia 感染刺激第 7 天之小鼠小腸腸道細胞上也無觀察到凋亡之 細胞存在。然而在G. lamblia 感染刺激第 35 天，也就是 G. lamblia 排除期之小鼠 小腸絨毛上，則觀察到凋亡之腸道上皮細胞在絨毛頂區域。而由量化之結果圖14C 亦顯示，第35 天時之有細胞現象之絨毛的百分比也有增加的趨勢。
由此部分結果顯示，G. lamblia 感染之刺激雖並不會對於小腸腸道絨毛之外觀
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構造有所影響及破壞。然而在G. lamblia 排除期，感染第 35 天時，卻觀察到部份 小鼠之小腸腸道有上皮細胞凋亡之現象，但無統計學上之顯著性。
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四、討論
本計劃首先在一定間隔之時間點分析 Balb/c 小鼠近端小腸中 G. lamblia trophozoites 的數量以建立感染曲線。實驗結果顯示出，感染之最高峰為第 4 到第 7 天，而第 14 天則無法觀察到 trophozoites 的存在, 可見已由體內完全排除。因此 本論文將感染G. lamblia 後第 7 天視為「感染期」（infection phase）而第 35 天視為
「後排除期」（post-clearance phase）。過去文獻以 106~107隻G. lamblia GS/M 品系 之trophozoites 感染 Balb/c 小鼠，在感染後約一週到達高峰，平均 trophozoites 的 數目大約為106個，而在感染第二週至第三週後則無法在小腸偵測到寄生蟲(56, 57, 78)，這些時間點與本實驗所建立之感染曲線吻合。而在 C57BL/6 小鼠中，G. lamblia GS/M 之感染曲線時間點亦相似(57)。本實驗和前人結果得到之感染期類似，約在 灌食後第14 天完全排除寄生蟲。本實驗在最高峰之感染後第 4 天，計數到 G. lamblia trophozoites 之數目為(1.1 ± 0.5)×104，相較於前人之研究所計數到之數目較少，推 測其原因可能和截取腸段長度以及判定trophozoites 的標準不同。過去文獻指出 G.
lamblia 主要寄生於前端小腸(55)，因此本實驗中採用 5 cm 的十二指腸作冷刺激使 貼附於腸管腔之trophozoites 脫落以利計數，並利用中段小腸做屏障功能和發炎反 應的測試以比較同一隻小鼠感染量和腸道病變的相關性，而過去文獻有些文章則 採用整段小腸(約 30 cm)作分析。另外，本實驗判定方式為在顯微鏡觀察下，計數 具有游動能力之trophozoites，當 G. lamblia trophozoites 失去其活動能力時，便無 法判定其是否為 G. lamblia trophozoites。推測由於上述的原因使得本實驗中 G.
lamblia trophozoites 之數目與前人研究相比較低。相同的是本實驗結果和前人文獻
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感染時或在G. muris 感染的動物(如小鼠或沙鼠(gerbil))中看到(90, 91)，直到 2000 年才有研究指出G. lamblia 中的 BRIS/95/HEPU/2041 品系也會造成小鼠腸道絨毛結 構改變(92)。相反地，亦有實驗發現 G. lamblia或 G. muris 感染在病人身上或動物 果得知Giardia trophozoites 會促使腸道上皮細胞 MLC 磷酸化，並使 tight junction ZO-1 重組，進而使腸道上皮細胞間隙增大，造成腸道通透性的增高(94)。亦有研 究發現G. lamblia 會破壞人類小腸細胞株的 tight junction ZO-1(95)。由此可以推測
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Giardia trophozoites 對於腸道屏障造成影響後可能會使腸腔中增生之細菌趁機經 由paracellular pathway 穿過上皮細胞間隙而進入組織中。此外，過去利用人類腸細 胞株的實驗發現，TNFα(10 ng/ml) and INFγ(100 ng/ml)會破壞 tight junction 而使腸 屏障功能缺損(96, 97); 另一研究指出低量的 INFγ(1 IU/ml)在不影響 tight junction 完整性的情況下，會引發細菌被內吞至腸道上皮細胞中並經細胞內通過此障壁。 數量的增加外，透過neutrophil 染色的組織切片實驗結果中，可以看到 neutrophil 大 多分布於在腸組織絨毛基部及腺窩的部位，且與感染前(第 0 天)相比，其數目亦有 顯著的增加。在G. lamblia「感染期」，小腸組織中的骨髓過氧化酵素活性有增加，
與 neutrophil 被趨化至腸組織的結果相吻合。在發炎反應發生時，neutrophil 為第 一個被吸引至發炎組織並進行殺菌作用的白血球(98)，因此本實驗中 neutrophil 的 增加可作為發炎反應的可能證據之一。過去研究顯示，在發炎的情況下，腸道腺 窩中的neutrophils 數量會大量的增加(13)。另外，過去研究也發現，被 Giardia 感 染的山羊小腸腸組織中也會有neutrophil 增多的現象，而此現象是發生在固有層以 及上皮層中(74)。而由受 Giardia 感染的病人十二指腸切片中也發現進入固有層中 的neutrophil 有增多的現象(73)，且也有文獻發現受 Giardia 感染的病人中約有 16
％其十二指腸切片之腸道上皮細胞中有neutrophil 大量進入(99)。Neutrophil 能夠以 氧化的方式進行殺菌作用，neutrophil 顆粒物質內有大量的骨髓過氧化酵素，由過 去研究得知此酵素活性和neutrophil 進入組織之數目成正比，因此組織內骨髓過氧 化酵素的上升可作為 neutrophil 進入組織的代表(15, 16)。由前人研究可知，
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neutrophil 參與在宿主對抗 Giardia 的機制中，並可能藉由釋出自由基和防禦素毒 殺trophozoites(68)。另外，在體外實驗也證實 neutrophil 能降低 Giardia trophozoites 的貼附能力(75)。 而本實驗結果顯示出 G. lamblia 感染刺激使得血液中 neutrophil 下，血液循環中的neutrophil 之半衰期約為六到十小時，而當 neutrophil 受到細菌 或細胞激素（例如IL-8 及 TNF α）刺激下，neutrophil 生命週期會延長至一到兩天，
使之能有足夠的時間在發炎組織之中進行殺菌作用(100, 101)。若發炎反應無法消 退便可能演變成慢性發炎狀態，因免疫細胞過度的活化而造成週邊組織的傷害 (102)。過去有許多研究指出 phagocytes (如 neutrophil 及 macrophage) (103, 104)，
Cytotoxic T cells, (105, 106)，或促發炎激素(TNFα 及 IFNγ)(107, 108)皆可能導致腸 道黏膜構造破壞和屏障功能缺損。 所以本實驗進而檢測在感染後第 35 天「後排 IL-8，促使 neutrophil 藉由固著因子（adhesion molecules）的作用滲透趨化到發炎
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的組織當中(12)。此外，IL-1β 也與 neutrophil 之活化和趨化有關(109)。而 TNF α 亦能使neutrophil 進入 priming 的狀態，使 neutrophil 在碰到下一次的病原刺激之下 能更快速及更大量的產生活性氧化物(101)。而過去研究發現當外來病原體入侵 時，血液中的monocyte 會受到發炎相關的趨化物（例如 MIP-1α）驅使而進入到固 有層分化成能夠吞噬病原體的macrophage (11)。MIP-1α 亦可趨化 neutrophil 進入 發炎組織中(110)。過去文獻中也提到當腸道組織受到葛蘭氏陰性菌外壁物質脂多 醣或一些細胞激素例如TNF α 及 IL-1β 刺激後，會促使腸道上皮細胞或腸道中的 白血球釋出inflammatory CC chemokines（例如 MIP-1α），此時也會促使 monocyte 順著結合在固有層細胞間的蛋白聚糖（proteoglycan）之濃度梯度移動，進入發炎
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感 染 之 B10 及 Balb/c 品 系 小 鼠 小 腸 切 片 並 沒 有 發 炎 反 應 相 關 細 胞 （ 例 如 lymphocyte）增多的情形，且腸道組織的 IL-6 量反而呈現明顯降低的情形(59, 71)。
由此說明了 Giardia 感染並不一定會引起嚴重發炎情形，甚至有學者提出 Giardia 感染時可能具有抵抗及抑制宿主發炎反應的機制以確保寄生蟲本身的存活。舉例 來說，G. lamblia 會藉由消耗 arginine 以競爭減少具有殺菌作用之 NO 的產生(70, 81)。過去研究也發現，Giardia 的 trophozoites 表面會表現出不同種類的蛋白質
（variant-specific surface proteins），此種抗原變異（antigenic variation）的現象使得 宿主原已啟動之免疫反應難以辨識新抗原而無法有效的對抗 Giardia (52, 80)。此 外，有研究發現樹突細胞（dendritic cells）在 G. lamblia 的刺激之下反而會抑制 IL-12 的產生(111)。因此推測 Giardia trophozoites 存在時有一定的免疫抑制或干擾 效果，以避免過強之宿主發炎反應危害到寄生蟲的生存，然而寄生蟲排除後，抑 義。未來可測試抑制性細胞素(suppressive cytokine)如 TGFβ 及 IL-10 在腸組織的表 現。整體來說，寄生蟲感染當時引發腸腔細菌增生及入侵黏膜的現象，並導致腸 管嗜中性球活化和血液 IL-1β 濃度上升。 在致病原排除後(即寄生蟲不存在時)，
腸腔細菌卻持續入侵黏膜，且仍伴隨嗜中性球趨化和活化增多，再加上腸道組織 中TNF α、MIP-1α 及 IL-1β 顯著增高的現象。而嗜中性球活化及促發炎細胞素的 上升可能造成更多週邊組織的傷害，進而引發黏膜屏障損害的惡性循環。
45 之表現增加。過去在細胞的實驗中發現，NO 會抑制 G. lamblia trophozoites 的生長，
且對於trophozoites 有毒害的作用，會使 trophozoites 數量減少(69)，因此推論小腸 腸 道 上 皮 細 胞 在 受 到 trophozoites 的 刺 激 下 會 表 現 大 量 的 iNOS 以 對 抗 trophozoites，且腸道上皮細胞正好是 trophozoites 貼附之處(54)，因此本實驗中看
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到iNOS 主要是表現在上皮細胞的部位而不是在腸道中之免疫細胞。而本實驗看到 感染第 7 天時小腸腸道細菌有增生的情形。過去研究發現當上皮細胞或其他細胞 受到病原體入侵，細菌內毒素或酵母多醣（zymosan）刺激之下會誘發產生 iNOS 和 NO(69)。因此本實驗中所看到的 iNOS 表現量增加也有可能是因為細菌增生而促 發，並不單獨由trophozoites 刺激所造成。值得一提的是 iNOS 上升會造成腸道屏 障功能失常，過去文獻顯示 NO 會促使細菌經由細胞間或細胞內途徑通過上皮層 (116)。在細胞培養的實驗中發現，腸道上皮細胞株細胞受有氣態 NO、 NO donor 的刺激下會出現屏障的缺損，包含了跨上皮細胞電阻 (transepithelial resistance, TER)下降以及對探針通透性(probe permeability)上升的現象 (38, 44)。由人類腸道 上皮細胞Caco-2 中的研究顯示，過量 NO 可經由緊密連結 ZO-1 及 occludin 之破 壞，而使跨上皮細胞電阻下降以及探針通透性上升(115)。而利用 Caco-2 細胞株研 究發現，給予細胞大腸桿菌及NO donor 的作用下，會有細菌進入到細胞中，此外 也發現細菌會穿越細胞層至下層培養液中(117)。過去研究發現許多腸道疾病，如 腸道缺血再灌流（intestinal ischemia/ reperfusion）(118)、腸阻塞（bowel obstruction）
(119)、出血性休克（hemorrhagic shock）(120, 121)、及內毒素血症（endotoxemia）
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另外，大鼠腸道上皮細胞株IEC-6 受 LPS、或 TNF α、IL-1β 以及 IFNγ 組成的 cytokine combination 之刺激下，會產生大量的 NO (124)。因此推測「後排除期」的腸道 iNOS 表現增加的原因一方面可能是因為腸道細菌貼附增加和黏膜內吞細菌量上升; 另
另外，大鼠腸道上皮細胞株IEC-6 受 LPS、或 TNF α、IL-1β 以及 IFNγ 組成的 cytokine combination 之刺激下，會產生大量的 NO (124)。因此推測「後排除期」的腸道 iNOS 表現增加的原因一方面可能是因為腸道細菌貼附增加和黏膜內吞細菌量上升; 另