第三章 實驗設備與方法
3.8 菌種的鑑定
本 實 驗 使 用 的 方 法 為 螢 光 原 為 雜 交 法 (Fluorescence in situ Hybridization FISH)，其原理為利用微生物 16 rRNA 的保守性，設計只針 對某屬或某種微生物具專一性的螢光探針，將微生物樣本經特殊處理後置
於載玻片上，再加上螢光探針。此經過螢光標示的探針再適宜的雜交條件 下會進入細胞內，與細胞內特定的 rRNA 配對。此探針雜交後會留在該細 胞體內便會產生螢光，置於螢光顯微鏡下便可清楚的觀察出族群分布情形 及依螢光的多寡來決定該微生物族群數量的多寡。能快速同時鑑定多個未 知菌種，而且無須任何培養，此為傳統細菌鑑定所不及的優勢。也可進一 步將微生物定性、定量。其流程圖可見 Figure 3-8。
Figure 3-8 FISH 流程圖
3.8.1 採樣及保存
採樣時必須充分混合，使樣品具有代表性，且在檢驗前不再被污染。使 用清潔並經過滅菌的容器或 Microtubes，及溫度能維持在 00C 至 50C 之 樣品儲存設備。水樣運送及保存之溫度應維持在 00C 至 40C。樣品自採樣
後 至 進 行 固 定 ， 其 保 存 時 間 不 得 超 過 24 小 時 。 採 樣 後 立 即 以 4%
Paraformaldehyde 固定，並保存於 50% PBS-EtOH (v/v)。
3.8.2 液相螢光原位雜交法步驟 固定 (Fixation)
(1) 依 1:3 的體積比進行固定，使用 1.5 mL 的微量離心管加入 0.25 mL
採樣 固定 雜交 清洗 顯像 計數
的污泥與 0.75 mL 100% EtOH 固定 120 分鐘 (on ice)。
(2) 適用 1000 rpm 離心 20 分鐘，使污泥形成 pellet。
(3) 小心倒掉上澄液，加入 1 mL PBS (pH 7.2) 使 pellet 再懸浮。
(4) 步驟 2、3 重覆兩次以去除剩餘的固定劑。
(5) 將樣品保存於 50% PBS-EtOH (v/v)。
(6) 打散污泥：使用針筒 (3 mL-27G) 慢慢抽打污泥 10 次，再用均質器 抽打 10 次。
(7) 分別取 3 µL 固定好的樣品點到 Slide 的 well 上，室溫風乾 (避免污 染)。
(8) 分別將 Slide 浸入 50%、80%、96% (v/v) 的乙醇裡脫水 2 分鐘。
(9) 風乾後，將 Slide 保存於室溫下不受污染處。
雜交 (Hybridization)
(1) 將 16 µL 的 Hybridization buffer (註 1) (% Formamide、0.9 M NaCl、
0.01% SDS、20 mM Tri-HCl buffer (pH 7.2)、DNA probe (50 ng/16µL well) 注入各個雜交井 (50 ng/16 µL well)。
(2) 準備一個 50 mL 尖底離心管，將衛生紙 + Washing buffer (1-2 mL) 沾濕平舖於離心館中 (保濕)，以備雜交 (避免被污染)。
(3) 再將 Slide 水平放入離心管，再置於培養箱 460C 下，雜交 1.5 小時 (同時將 Washing buffer 置入培養箱中預熱)。
註1:
Probe Name
Hybridization Buffer Formnmide
conc. (%)
Washing Buffer NaCl conc.
(mM)
Reference
S-D-Bact-0338-a-A-18 20% 170 Amann et al., 1980 S-S-Thio-08200-a-A-22 20% 170 Peceia et al.,
2000 S-S-Thiopa-0511-a-A-18 20% 170
清洗 (Washing)
(1) 取出 Slide 以 1 mL Washing buffer (No Formamide, NaCl, 0.01%
SDS, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)) (480C) 淋洗兩次。
(2) 將雜交管中的衛生紙取出，加入 30-35 mL Washiing buffer，再將 Slide 浸入，480C 培養箱中 20 分鐘。
(3) 取出 Slide 以 1 mL 去離子水淋洗兩次，於室溫下風乾。
DAPI Staining
(1) 將 DAPI 染劑 20 µL (1 µg/mL) 加入 well 中，染色 30 分鐘。
(2) 以去離子水淋洗，去除過剩的染劑。
(3) 室溫下烘乾。
一般染色之樣品本應立即觀察，因當時的螢光最顯著;若不能馬上觀 察，需儲存於乾燥盒 (Polyethylene Bag) 內，保存於 0-50C 冰箱內，可 保存一個月左右，仍可呈現螢光。使用直落式螢光顯微鏡對載玻片進行觀
察，以數位相機 (CCD camera) 觀察樣品螢光強度並對其進行分析比較。
3.8.3 固相螢光原位雜交法步驟
預先處理
(1) 取出反應槽中的硫片 (約 3-5 g)，以裝入 50 mL 之離心管中，並加入 無菌水 20 mL，以 6000 rpm 離心 20 分鐘。
(2) 離心完後，將上澄液倒出，加入 20 mL 之無菌水，再次以 6000 rpm 離
心20 分鐘。
(3) 重複 1、2 兩步驟，以減少干擾。
(4) 將硫片取出予以研磨，在裝入 50 mL 之離心管中，並加入 20 mL 之 無菌水。
(5) 接下來的步驟皆與液相之螢光原位雜交法步驟相同。