藥理試驗方法

(一) 抗血小板凝集活性試驗方法

1. 血小板凝集引發劑之製備：

(1)Thrombin:購自 Park Davis Co. USA；溶解於 50 % (V/V) glycerol 製備成 100 NIH units/ml 之 stock solution。

(2)Arachidonic acid (AA):購自 Sigma Chem. Co. USA；以去離子水溶 解之。

(3)Collagen (Type I bovine Achilles tendon):購自 Sigma Chem. Co.

USA；於 25 ml acetic acid 研磨均勻，以 l mg/ml 儲存於-70 ℃。

(4)Platelet-activating factor (PAF):購自 Sigma Chem. Co. USA；溶於 chlorofom，使用前以 0.9 % NaCl 稀釋之。

2. 血小板懸浮液(Platelet suspension)之製備：

將 EDTA 與兔耳靜脈抽出血混合後，使 EDTA 之最終濃度為 6 mM，在室溫下立即以 90 × g 離心 10 分鐘，取出上層富含血 小板之血漿(platelet-rich plasma)，再將其以 500×

g 離心 10 分鐘，

除去血漿後，將下層血小板(platelet pellets)以含有 EDTA (2 mM) 及 Bovin serum albumin (3.5 mg/ml)的 Tyrode's solution (calcium free)清洗之，在相同轉速(500 × g)下離心 10 分鐘，所得之血小 板以不含有 EDTA 之 Tyrode's solution 清洗之，再於相同之條 件下離心後，取血小板層，將其懸浮於 Tyrode's solution，其組 成如下(mM) : NaCl (136.8), KCl (2.8), NaHCO3 (11.9), MgCl₂ (1.1), NaH₂P0₄ (0.33), CaCl₂ (1.0) and glucose (11.2);並以 Coulter counter (Model ZM) 計 數 ， 調 整 血 小 板 數 約 為 4.5 × 10⁸ platelets/ml，最後加 1 mM 鈣離子(Ca²⁺)放置 30 分鐘後進行實 驗。

3. 血小板凝集(platelet aggregation)之試驗：

利用混濁度法(turbidimetric method)之原理來測定凝集程度 ⁴⁴， 並以 Lumiaggregometer (Model 1020, PayLon, Canada)測定之。

將血小板懸浮液 0.4 毫升加入經 Silicone 包衣的小玻璃管中，並 以小磁棒做每分鐘 900 轉(900 rpm)的攪拌，若未特別說明，均 在加入樣品三分鐘再加入引發劑，六分鐘後觀察結果。為了排

除溶媒(DMSO)影響，在血小板溶液的濃度為 0.5 %。全部反應 過程皆在 37 ℃下進行，凝集程度的表示方法如下：

凝集(%) = [(A₁-A₂) ÷ (A₁-A₃)] ×100 %

A₁=加引發劑前的吸光度 A₂=加引發劑後的吸光度

A₃=Tyrode`s solution 的吸光度

(二 ) 抑制血管增生試驗方法

1. 抑制 DNA 合成：

將 Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)(人體劑帶靜 脈內皮細胞) 分別加入不同濃度之 indazole 類緣化合物或不加入 化合物(basal 組)，且在每一組都加 VEGF (除了 basal 組)來誘使 DNA 合成，然後以[³H] thymidine incorporation 偵測 DNA 的生長。

2. 抑制 tube 生成：

利用 VEGF 於 Human umbilical vein endothelial cells ( HUVEs；人 體臍帶靜脈內皮細胞)中作用，可使細胞重新組合進行分化作用形 成管柱的結構。而以 indazole 類緣化合物處理後(除了 basal 和 control 組)，由 VEGF 所誘導內皮細胞產生的分化作用可被阻斷 其網狀結構，且由 MTT 試劑作染色，拍照存證。

3. 抑制血管增生之定量性活性測試：

以皮下注射方式將含有 150 ng/mL VEGF 之 Matrigel plug 打入裸 鼠左下腹部，然後將 Vehicle 或一系列化合物以口服的方式讓裸 鼠服用 7 天，之後將裸鼠犧牲，剪下 Matrigel 部位並拍照存證，

檢視化合物有無抑制血管增生作用。並使用 hemoglobin detection kit (購自 Sigma Chem. Co.)做 Hemoglobin 之含量測定，將血管新 生作用量化。

(三 ) 細胞致毒活性試驗方法

~人類前骨髓性血癌細胞(HL-60 cells)增殖作用(proliferation)實驗~

1. 細胞培養與前處理：

Indazole 類緣化合物用 DMSO 溶解；並將一系列不同濃度之化合 物儲放於 –20 ℃冰箱，待加藥時再解凍。DMSO 之最後濃度需控 制在 0.1 %以下，以避免 DMSO本身對 HL-60 cells 之影響⁴⁵。HL-60 cells (1 × 10⁵/mL)培 養 於 24-well 之 培 養皿 中 使總 體 積 為 1 mL/well；並加入各種不同濃度之化合物於溫度 37 ℃、溼度 95

%、5 % CO₂之培養相中培養 24 小時之後，分別取出作 MTT- proliferation assay 實驗。

2. MTT-proliferation assay：

首先自每個 well取出已去培養基之 50

µ

µ

取出後再使用 DMSO (150 µL /well)溶解細胞之紫黑色顆粒，最後 以 ELASA reader 於波長 570 nm 之條件測得 OD570值 ^46,47。

Proliferation (%) = Sample OD₅₇₀/Cont. OD₅₇₀ ×100 %