1(或2)-(取代芐基)-3-(4-甲基苯基)-1(或2)氫-吲唑類化合物之合成及其抗血小板、抗血管增生與細胞致毒活性; Synthesis, Antiplatelet, Antiangiogenesis and Cytotoxicity Activity of 1(or 2)-(Substituted benzyl)-3-(4-methylphenyl)-1(or 2)H-indazoles
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(2) 在此先檢視一個血小板之生化反應途徑，如 Fig. 1 所示。首先 ADP、thrombin、collagen 等物質與血小板細胞膜上特定接受器結合 後，再經由細胞膜傳訊作用(transmembrane signaling)活化 phospholipase C (PLC)，促使 PIP2 (phosphatidyl inositol diphosphate)水解形成 IP3 (inositol-1,4,5-triphosphate)及 DAG (diacylglycerol)。IP3 將 Ca2+吸引 進入胞液中使 Ca2+含量增加，進而引起血小板的外形改變、phospholipase A2 (PLA2 )的活化，釋放出 arachidonic acid (AA)， AA 受 cyclooxygenase (COX)的作用轉變成 prostaglandin endoperoxides ( PGG 2、PGH2)；其中 PGH2 在血小板中經由 thromboxane synthetase (TS) 的作用轉變成 thromboxane A2 (TXA2)促進血小板凝集及釋放；而 PGG 2 在內皮細胞經 prostacyclin I2 synthetase 的作用轉變成 PGI2 抑制 血小板凝集。DAG (dicylglycerol)會活化 PKC (protein kinase C)，將血 小板蛋白質加以磷酸化使釋出其內含物，而釋出物之一 ADP 除了可 額外活化其他的血小板，還能修飾血小板表面以便讓 fibrinogen 與血 小板結合，隨後 fibrinogen 將附著凝集在受損處之血小板彼此串聯結 合，進而形成疏鬆的血小板凝集塊(platelet plug)。 當血管壁異常部位暴露出來的基底膜(basement membrane)接觸 血液時，會活化凝血階段內因性途徑的凝血因子；而在傷口組織會釋 放組織因子(tissue factors)進而活化外因性途徑的凝血因子。此兩途徑 聚合至一，使凝血■原(prothrombin)轉變成 thrombin。血小板凝集成 塊後，凝血■(thrombin)會使 fibrinogen 轉變成纖維蛋白(fibrin)將血小 板凝集塊包住形成一穩定的纖維蛋白凝塊(fibrin clot)，再聚集成堅固 的止血栓(thrombus)。 凝血系統通常是處於動態平衡的狀態中，血塊不斷的生成和溶 解。胞漿素(plasmin)在此就扮演將血塊溶解的角色，以避免血凝塊阻 塞血管。但若血栓無法即時消除，則容易造成血管栓塞，引起急性血 管併發症。像懷孕、口服避孕藥物、惡性腫瘤、外科手術、高血脂、 糖尿病以及動、靜脈硬化等，都會導致止血平衡失調，而促使血小板 不正常活化或凝血纖維沉積，造成血栓栓塞，進而可能併發急性心肌 梗塞、腦中風、腦栓塞、腎血管疾病等而導致死亡，對人類的生命有 莫大之威脅。因此抑制血小板不適當的活化，乃是預防或治療血管栓 塞疾病的方法之一。 -2-.
(3) Fig. 1 Platelet biochemical pathways. 3. -3-.
(4) 第二節 癌症 4 不分國界也無視種族的差異，癌症長久以來就是人類的共同敵 人，嚴重危害人類的健康，可說是頭號殺手。它可怕的地方就在於當 正常細胞在致癌因子的影響下產生突變，導致過度活絡細胞生長週期 (cell cycle)，也因細胞凋亡(apoptosis)自然機轉之反常，使異常細胞不 斷的增生、擴散，進而干擾體內各項機能的運作，導致正常組織器官 出現疼痛、潰爛、感染。 大致來說癌細胞的形成與演進要經過四個階段： 1.開始期(initiation phase)： 正常細胞的 DNA 受到致癌物、致癌因子的刺激而產生質變。 2.促進期(promotion phase)： 在致癌物長期持續的刺激下促進癌細胞的大量增生，開始形成較小 且良性的腫瘤。 3.進展期(progression phase)： 癌細胞會快速的分裂，不斷的增生，逐漸形成較大的腫瘤，進而在 腫瘤組織內產生新生血管。 4.轉移期(metastasis phase)： 癌細胞經由淋巴系統或血液循環侵犯擴散到鄰近的組織，甚至遠處 的轉移。 癌細胞的生長與正常細胞一樣是分幾個期別來達成，這些不同期 別週而復始成為一個生長的循環 5： 1.靜止期(G0，Gap 0)： 細胞內部自我成長，製造形成各種特有的功能；在這時期內，一般 是對化學療法不產生反應，即藥物對其無效。 2.中間期(G1，Gap 1)： 細胞內的蛋白質及核糖核酸(ribonucleic acid；RNA)組成，在此末 期還有大量製造 RNA 的? 產生。 3.合成期(S，DNA synthesis)： 細胞內的去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid；DNA)產生加倍作 用。 -4-.
(5) 4.靜止二期(G2，Gap 2)： DNA 停止生長，但蛋白質、RNA 及一些細胞基本分裂結構仍會生 成。 5.分裂期(M，Mitosis)： 細胞內蛋白質及 RNA 急促停止生長，而基因物質分裂到子細胞中 完成分裂行為。 一般的癌症治療方法有好幾種，其中化學療法(chemotherapy)最 為普遍，就是使用一些化學藥物針對細胞的生長期而發生抑制作用， 使癌細胞無法進行分裂增殖而致死亡。細胞毒(cytotoxicity)殺法是為 化學療法的主軸，但通常在殺死癌細胞時也殺死正常正在生長的細 胞。儘管現代分子生物與生化科技進展快速，但癌症的研究與藥物幾 乎只有微小的進展，一般的化療藥物是破壞癌細胞的 DNA，但是對 於癌細胞的血管並沒有作用。 目前，最熱門的研究是將癌細胞周圍的血管以藥物加以阻斷。當 腫瘤細胞所需的營養與氧氣已不能從自生的血管達到滿足、或為了擴 大其生長時，它們將會新生出血管(angiogenesis)來供給營養與氧氣， 進而成長並侵犯鄰近組織，經血液循環轉移至身體其他部位，這是所 謂癌細胞的轉移(metastasis)。在那裡，再一次的癌細胞生長及另外的 血管新生。可怕的癌細胞就是以此種十分快速的速度在身體裡生長與 蔓延，因此一旦破壞了癌細胞的新生血管，將能使其終致餓死而達抗 癌作用，這是癌症治療的另一方針。 新生血管是如何開始的，如 Fig. 2 所示，腫瘤細胞會製造及釋放 angiogenic growth factors (一些蛋白質或小分子，其中 vascular endothelial growth factor (VEGF)和 basic fibroblast growth factor (bFGF) 在腫瘤細胞裡是最先被合成出並釋放的)到鄰近組織，並和附近內皮 細胞(endothelial cells；EC)上的受體結合，活化 EC，接著一連串的訊 息傳遞，一種具分解作用(degradation)的■會被製造並釋放至周圍， 去分解細胞外的基質(matrix metalloproteinases；MMPs)，好讓活化的 EC 能轉移至附近的組織並朝著腫瘤細胞開始分裂(divide)，進行增殖 (proliferation)。之後，新生成的 EC 形成一初步的 blood vessel hollow tubes，而各個獨立的 tubes 互相連接成可讓血液流通的 blood vessel -5-.
(6) loops，最後平滑肌細胞(smooth muscle cell)提供其結構穩定的支持作 用，血液即開始流通，一個成熟的 network of blood vessels 生成 5,6。. Fig. 2 The angiogenic process. 6. -6-.
(7) 第三節 凝血? (thrombin)之主要生理功能 7,8 如 Fig. 3 所示，thrombin 之主要生理功能如下： (一) 調節血小板活化、凝血及血栓溶解的功能： Thrombin 除了會誘導血小板的活化與凝集，還可與其他的 分裂素(mitogen)及 inflammatory mediators 一起刺激細胞的附著 能力，使血管壁受損處產生凝血現象。另一方面 thrombin 也會 促進內皮細胞分泌 PGI2、NO 等物質，幫助血栓溶解。 (二) 誘導細胞增生作用： Thrombin 會誘導 fibroblasts leukocytes 及平滑肌細胞之增殖 (proliferation)與轉移(migration)，它本身也是一種 mitogen，會刺 激血小板及內皮細胞釋放 PDGF (platelet derived growth factor)、 TGF-ß (transforming growth factor-ß)以及 thromboxane A2 (TXA2) 。在傷口組織，這些物質的釋放，產生凝血及新生血管來促進傷 口癒合。但在腫瘤組織或動脈硬化的情況下， 細胞增生與血管 新生可能會造成很大的傷害。 (三) 引發白血球的趨化及發炎反應： Thrombin 會刺激內皮細胞合成並釋放各種趨化因子，造成 中性白血球(neutrophils)及巨噬細胞(macrophages)被吸附到受損 的內皮上。另外 thrombin 也會增加內皮細胞的通透性，使白血 球穿透內皮組織而滲出，造成發炎反應。 (四) 其他作用： Thrombin 與血管增生有密切的關係，能促進癌細胞的附著 分裂及生長，因此它在癌症病變過程中扮演相當重要的角色。 Thrombin 的受體，目前已被發現的有四種亞型，是屬於 protease activated receptors (PARs) superfamily 9，其中 PAR-110 受體經 thrombin 或 trypsin 的結合而活化，可以引起血小板凝集、內皮細胞增生、血 管壁通透性增加及促進部分癌細胞的擴散。PAR-210 受體經 trypsin 的 結合活化，可參與發炎反應及促進內皮細胞增生。PAR-311 受體經由 thrombin 及 trypsin 的結合而活化，但其活化後的生理反應並不清楚。 -7-.
(8) PAR-412-14 受體是最近才被發現的，結構與前面三個有部分相似，是 經由 thrombin 結合而活化，但它所調控的生理反應並不清楚，尚須 深入探討。. Thrombin. Endothelial cells Adhesion molecule expression Cytokin production Vascular permeability. Neuronal cells Inhibits neuronal growth Astrocyte proluferation. Monocytes/macrophages Proliferation Cytokine production Chemotaxis. Smooth muscle cells Proliferation Contraction CytokineMatrix production production. Fibroblasts Proliferation Chemotaxis Matrix production. Platelets Aggregation Mediator release. Lymphocytes Proliferation Cytokine production Chemotaxis. Fig. 3 Cellular effects of thrombin. 7. -8-.
(9) 第四節 ■■類(indazole)化合物之合成方法 本研究之標的化合物為■■類之衍生物，而此類化合物較常見之 合成方法可分為四種，其餘文獻 15-29 上的合成方法基本上都是由這四 種反應方法衍生。 I、方法一 30： CH3. CH3 diazotization. cyclization heat. NH2. N N. N2 X. H. Scheme 1 如 Scheme 1 所示，將具有鄰位碳苯胺之化合物進行重氮化反應 (diazotization)形成偶氮鍵，再經高溫環化即可得 indazole 類化合物之 雜環基本架構。 II、方法二 30： Ar N H. Ar SnCl 2. N. HCl. Ar. N + H. N. NO2. NH2. Scheme 2 如 Scheme 2所示，將具有鄰位硝基的苯甲基胺以氯化亞錫(SnCl2) 將硝基還原，然後與苯甲基胺上的氮形成氮-氮鍵，進而環化形成 indazole 之雜環架構。不過此法之氮-氮鍵不易形成，會生成鄰位胺基 苯甲基胺之副產物。 III、方法三 30： R. R O2N. R'. O2N O. R O2N. N N. NH2NHR'. H. base heat. Cl. Cl. N N R'. Scheme 3 -9-.
(10) 如 Scheme 3 所示，將具有鄰位鹵素之苯烷基酮類類與聯胺 (hydrazine)反應形成 hydrazone 之中間體，繼而在鹼性環境下，高溫 脫除 HX，環化形成 indazole 之雜環架構。 IV、方法四 31,32：. N. Pb(OAc)4. N. N. N OAc. MeO. MeO. Lewis acid. N MeO. N. Scheme 4 如 Scheme 4 所示，將 hydrazone 化合物以四醋酸鉛[Pb(OAc)4] 加以氧化以形成 acetate 的氧化加成物，繼而以 Lewis acid 脫除醋酸進 行環化反應形成 indazole 之雜環架構。. - 10 -.
(11) 第五節 YD-3 之研究概況 5' 6' 1'. 4 3a. 5 6 7. H2C. COOCH2CH3. 3'. 3. 7a N 1. 4'. 2'. N2 1". 6" 5". 2". 4" 3". Ethyl 4-(1-benzyl-1H-indazol-3-yl)benzoate (YD-3). YD-333，是本研究室合成的■■類化合物，其結構為第一位氮接 有芐基，第三位苯環接有-COOCH2CH3 之官能基。而其合成方法是採 用第四節之方法四，最初將芐基及苯甲酸乙酯基團形成，再經環化反 應生成 indazole 雜環之架構。在藥理試驗方面，如 Table 1 所示，YD-3 對 thrombin 所引發的血小板凝集具有選擇性的抑制作用 34。一般來 說，抑制 thrombin 作用的途徑可分為兩種 35。一種為凝血■抑制劑 (thrombin inhibitors)，例如 heparin，會加速 antithrombin - thrombin complex 的形成，以減少 thrombin 的量，干擾凝血機轉，此種作用活 性雖強但容易引發出血方面的副作用。另一種為凝血■受體拮抗劑 (thrombin receptor antagonists) (屬於 PARs antagonists)，thrombin 活化 細胞主要是經由 G-protein coupled thrombin receptors 而發生作用的， 若經受體拮抗劑加以阻斷，只會抑制 thrombin 引起的細胞反應而不 會影響凝血系統。 Table 1. The inhibitory effect of YD-3 on platelet aggregation induced by thrombin, AA, collagen and PAF (in vitro). Compound YD-3. AA 184.83. IC 50 (µM)＊ Collagen Thrombin 212.36 29.7. PAF 164.04. Platelets were incubated with tested sample or 0.5 ﹪DMSO at 37 ℃ for 1 min, then thrombin (0.1 U/ml), AA (100 µM), collagen (10 µg/ml) or PAF (2 ng/ml) was added to trigger the aggregation. ＊：The accuracy of IC 50 values are within ± 10 ﹪.. - 11 -.
(12) 當探討進一步 YD-3 之作用機轉，發現 YD-3 是屬於 thrombin receptor antagonists，但其對 PAR-1、PAR-2 及 PAR-3 致效劑所引發的 血小板凝集沒有抑制作用，只對 PAR-4 致效劑引發的血小板凝集有 強效(IC 50：0.1 µM)的抑制作用。因此確認 YD-3 是新穎的 PAR-4 受 體拮抗劑 36。 除了做抗血小板凝集試驗，我們還做了裸鼠的新生血管試驗，結 果發現 YD-3 (1.5 mg/kg i.p.)對 thrombin 所引發的新生血管具有顯著 的抑制作用，如 Fig. 4 所示，頗具有成為抑制癌症新生血管新藥之潛 力。. Hemoglobin content (g/dL). 8. 6. 4. 2. 0. basal. control YD-3 (30 uM) + (thrombin 2U/mL) thrombin (2U/mL). Fig. 4 Inhibition of thrombin-induced angiogenesis.. - 12 -.
(13) 第六節 研究動機與目的 從第五節的敘述得知 YD-3 是抗血小板凝集作用機轉獨特的化合 物，不僅可以提供做為研究 PAR-4 生理功能的探針，更是頗具開發 潛能的新型 PAR-4 受體拮抗器及抗新生血管(antiangiogenesis )化合 物。而到目前為止，文獻 33 上所記載一些與 YD-3 相似的 indazole 類 衍生物，皆為在第一位氮上接無取代的芐基，無法建構良好的化學結 構與活性的關係，於是著者設計 3-(4-methylphenyl)-1H-indazole (6)為 主要中間體，企圖衍生數類 YD-3 之相關化合物。在本研究之先探性 試驗中，著者合成了化合物 6，並試探性的測試其生理活性。 CH3. N N H. 6. 從其活性試驗結果得知，在抗血小板凝集活性方面，如 Table 2 所示，化合物 6 雖然不像 YD-3 對 thrombin 引發的血小板凝集有選擇 性的抑制作用，但是對 AA 所引發的血小板凝集有選擇性的抑制作 用。在抗血管增生活性方面，化合物 6 在濃度為 30 µM 時，抑制 VEGF 所誘發的 DNA 合成活性為 YD-3 的 9 倍(Fig. 5)，當濃度為 10 µM 時， 化合物 6 與 YD-3 的抑制效果相當(Fig. 6)，而當濃度降為 1 µM 時， YD-3 之抑制效果比化合物 6 稍強(Fig. 7)。. - 13 -.
(14) Table 2. The inhibitory effect of compounds (YD-3、6) on platelet aggregation induced by thrombin, AA, collagen and PAF (in vitro). compound. Conc. （µ M） Control YD-3 IC 50 （µ M） 300 100 30. 6. AA. Aggregation ﹪ Collagen Thrombin. PAF. 86.6±0.8. 88.5±1.1. 91.5±1.3. 89.8±1.2. 184.83. 212.36. 29.70. 164.04. 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 3.0±2.6＊ ＊ ＊ 5.4±4.6＊ ＊ ＊. 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 19.4±8.1＊ ＊ ＊ 74.8±5.9＊. 85.4±2.6 -. 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 87.4±1.7 -. 78.8±2.0＊ ＊ 83.9±1.7＊ IC50 (µM) 111.01 >300 197.24 19.67 Platelets were incubated with tested sample or 0.5 ﹪DMSO at 37 ℃ for 1 min, then thrombin (0.1 U/ml), AA (100 µM), collagen (10 µg/ml) or PAF (2 ng/ml) was added to trigger the aggregation. Values are presented as mean ± S.E., ＊：P<0.05, ＊＊：P<0.01, ＊＊＊：P<0.001.. H-thymidine incorporation (% of basal). 250. 200. 150. 100. 50. 0 basal. 200. 150. 100. 50. control (VEGF). 0. YD-3 (30 uM) 6 (30 uM) +VEGF +VEGF. basal. Fig. 6. H-thymidine incorporation (% of basal). Inhibition of VEGF-induced DNA synthesis.. control (VEGF). 250. 200. 150. 100. 50. 0 basal. Fig. 7. control (VEGF). YD-3 (1 uM) +VEGF. 6 (1 uM) +VEGF. Inhibition of VEGF-induced DNA synthesis. - 14 -. YD-3 (10 uM) 6 (10 uM) +VEGF +VEGF. Inhibition of VEGF-induced DNA synthesis.. 3. Fig. 5. 250. 3. 3. H-thymidine incorporation (% of basal). 10.
(15) 由以上初步藥理結果可知，化合物 6 為具開發潛能的基本架構， 於是本研究即正式規劃以 3-(4-methylphenyl)-1H-indazole (6)為 key intermediate，並與單取代的芐基進行芐基化反應(benzylation)，進而 能同時得到在第一位氮上(C)及第二位氮上(D)接有取代芐基之化合 物，並探討其結構與抗血小板凝集、抑制血管增生等活性之關係，期 望能獲得比 YD-3 藥理活性更佳的物質。 CH3. N N H. 6. CH3. CH3. N. N. N. N. CH 2. H2C. R. R. C. D. R = Cl, CH3, OCH3. - 15 -.
(16) 第二章 結果與討論 第一節 化學合成. I、 標的化合物(7 - 21)的合成概述 本研究之目標化合物 7 - 21 之合成途徑如 Scheme 5 所示. O. 30,37,38. O O. N +. +. O. N. Et3N CHCl3. Cl. HCl(aq) reflux. CH 3. 1. CH 3. 2 (3). O. CH3. O. Pd/C. NH2NH 2.H2O. reflux N. CH 3. N. 4. H. CH3. 5. CH3. N. N. N. N. H. 6b. H. 6a. EtONa , EtOH. R4. CH2Cl. R3. CH3. R2. CH3. N. N. N. N. +. CH2. H2C. R2. R2. R4. R3. R3. R4. 7,9,11,13,15,16,18. 8,10,12,14,17,19,20,21. Scheme 5 - 16 -. 。.
(17) 化合物. R3 H. R2 H. 化合物. 7. R4 Cl. 9. H. Cl. 11 13. H CH3. 15 16 18. 8. R4 Cl. R3 H. R2 H. H. 10. H. Cl. H. H H. Cl H. 12 14. H CH3. H H. Cl H. H. CH3. H. 17. H. H. CH3. H OCH3. H H. CH3 H. 19 20. OCH3 H. H OCH3. H H. 21. H. H. H. I-1. 2-Oxocyclohexyl 4-methylphenyl ketone (4)之合成. 37. O O N +. Et3N CHCl3. Cl CH3. 2 1 O O +. N. O. O. HCl(aq) reflux CH3. 4. CH3. (3). 取 1-(N-morpholino)cyclohexene (1)與 4-methylbenzoyl chloride (2)在triethylamine的存在下進行反應，可形成4-[2-(4-methylbenzoyl) cyclohexylidene]morpholin-4-ium (3) [亞胺鹽(iminium salt)]，直接再以 鹽酸水溶液加熱水解，即可得化合物2-oxocyclohexyl 4-methylphenyl ketone (4) (β-二酮類化合物)。 化合物 4 為白色結晶，熔點 106.2-107.4 ℃。 - 17 -.
(18) 質譜(EIMS) (圖 4-1)： 由其分子離子峰(m/z 216)及元素分析結果得知此化合物分子式 為 C14H16O2，與預期相符。 IR 圖譜： 如圖 4-2 所示，出現一些與預期結構相符的吸收峰。在 1669 cm-1 以及 1705 cm-1 有 C=O 之吸收帶。 UV 圖譜：在 233.0 nm 及 258.8 nm 處有最大吸收。 1. H-NMR (CDCl3) (圖 4-3)： 其積分值顯示此化合物有 16 個質子訊號。初步判斷 d 2.33 歸屬 於 4'-CH3 (3H, s)之訊號。其次，位於 d 7-8 之間芳香環的氫，因受 carbonyl group (C=O)的影響，H-2', 6'的化學位移往較低磁場移動，出 現於 d 7.72 (2H, d, J = 8.3 Hz)，H-3', 5'則在較高磁場，出現於 d 7.17 (2H, d, J = 8.3 Hz)。另外，環己酮上的 H-1 及 H-3 因受 carbonyl group(C=O)的影響，化學位移往較低磁場移動，分別出現於d 4.24-4.31 (1H, m)與 d 2.40-2.51 (2H, m)。再依誘導效應及氫-氫相關譜(CDCl3) (圖 4-4a)，可將 d 1.82-2.06 (4H, m)歸屬於 H-4, 5 之訊號，d 2.18-2.40 (2H, m)歸屬於 H-6 之訊號。 13. C-NMR (CDCl3) (圖 4-5)： 顯示有 12 個碳原子訊號，由分子式得知有 14 個碳，所以推測有 2 組碳訊號重疊。初步判斷在最低磁場的 d 208.64 訊號來自 C2=O， 而 d 197.02 訊號來自另一個 C=O。 HMQC (CDCl3) (圖 4-6a, 4-6b)： 依據碳與氫之相關性，可初步將 d 21.61 歸屬於 4'-CH3 之訊號，d 22.98、d 27.25、d 30.03、d 42.18、d 58.75 分別歸屬於 C-5、C-4、C-6、 C-3、C-1 之訊號，d 128.64 及 d 129.32 分別歸屬於 C-2', 6'及 C-3', 5' 之訊號。 剩餘的兩個四級碳，依共振誘導效應，可將 d 134.06 歸屬於 C-4' 之訊號，d 144.13 歸屬於 C-1'之訊號。 綜合上述圖譜數據分析，初步判定化合物 4 為 2-oxocyclohexyl 4-methylphenyl ketone 之結構。. - 18 -.
(19) I-2. 3-(4-Methylphenyl)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-indazole (5)之合成. 38. CH 3. O. O NH2NH2.H2O N N. CH3. H 5. 4. 將化合物 4 與 hydrazine monohydrate 在室溫下進行反應可得化合物 3-(4-methylphenyl)-4,5,6,7-tetrahydro-1H-indazole (5)。 化合物 5 為白色結晶，熔點 57.4-59.9 ℃。 質譜(EIMS) (圖 5-1)： 由其分子離子峰(m/z 212)及元素分析結果得知此化合物分子式 為 C14H16N2，與預期相符。 IR 圖譜： 如圖 5-2 所示，比化合物 4 在 3203 cm-1 多了 N-H 之吸收帶，在 1320 cm-1、1442 cm-1 及 1513 cm-1 多了 C-C 及 C-N 環的吸收帶，而化 合物 4 的 C=O 吸收帶消失，且出現一些與預期結構相符的吸收峰。 UV：在 233.4 nm 及 280.6 nm 處有最大吸收。 1. H-NMR (CDCl3) (圖 5-3)： 其積分值顯示此化合物有 16 個質子訊號。初步判斷 d 2.25 歸屬 於 4'-CH3 (3H, s)之訊號，d 7.04 (2H, d, J = 8.4 Hz)為 H-3', 5'之訊號，d 7.41 (2H, d, J = 8.1 Hz)為 H-2', 6'之訊號，d 9-10 (1H, br)為 N1-H 之訊 號。其餘的訊號尚未做進一步確認。 13. C-NMR (CDCl3) (圖 5-4)及 13C-1H cosy (CDCl3) (圖 5-5a, 5-5b)： 顯示有 12 個碳原子訊號，由分子式得知有 14 個碳，所以推測有 2 組碳訊號重疊。初步判斷 d 21.21 為 4'-CH3 之訊號，d 126 為 C-2', 6' 之訊號，d 129.24 為 C-3', 5'之訊號。其餘的訊號尚未做進一步確認。 綜合上述圖譜數據分析，初步判定化合物 5 為 3-(4-methylphenyl)4,5,6,7-tetrahydro-1H-indazole 之結構。 - 19 -.
(20) I-3. 3-(4-Methylphenyl)-1H-indazole (6)之合成. 30,38. CH3. CH3. Pd/C reflux. N. N. N. N. H. H. 5. 6a CH3. N N. H. 6b. 取化合物 5 經由 Pd/C 催化，高溫脫氫反應，即可得化合物 3-(4-methylphenyl)-1H-indazole (6)。 化合物 6 為白色結晶，熔點 63.1-65.2 ℃。 質譜(EIMS) (圖 6-1)： 由其分子離子峰(m/z 208)及元素分析結果得知此化合物分子式 為 C14H12N2，與預期相符。 IR 圖譜：如圖 6-2 所示，出現一些與預期結構相符的吸收峰。 UV 圖譜：在 233.4 nm、246.0 nm、311.6 nm 有最大吸收。 1. H-NMR (CDCl3) (圖 6-3)： 其積分值顯示此化合物有 11 個質子訊號，由分子式得知有 12 個 氫，在圖譜上沒有明顯出現的 1 個質子訊號可能是 N1-H。而由其化 學位移、偶合情形及氫-氫相關譜(CDCl3 ) (圖 6-4)，將各個質子訊號 歸屬如下：在最高磁場的 d 2.47 (3H, s)歸屬於 4'-CH3 之訊號。其次， 因受 4'-CH3 的影響，H-3', 5'的化學位移往較高磁場移動，出現於 d 7.34-7.38 (3H, m)，而 H-2', 6'則往低磁場移動，出現於 d 7.93 (2H, d, J = 8.0 Hz)。. - 20 -.
(21) 13. C-NMR (CDCl3) (圖 6-5)： 顯示有 11 個碳原子訊號，由分子式得知有 14 個碳，所以推測有 3 組碳訊號重疊。初步判斷 d 21.33 為 4'-CH3 之訊號。 HMQC (CDCl3) (圖 6-6)： 依據碳與氫之相關性，可將 d127.60 歸屬於 C-2', 6'之訊號，d129.62 歸屬於 C-3', 5'之訊號。 其餘的碳與氫之訊號需參照 HMBC (CDCl3) (圖 6-7)來做進一步 的確認。由 4'-CH3 之遠程偶合關係，可將 d 138.02 歸屬於 C-4'之訊號。 其次，由 H-2', 6'之遠程偶合關係，將 d 145.68 歸屬於 C-3 之訊號。剩 餘的三個四級碳，其中 C-3a 及 C-7a 參照文獻 39 與考慮兩者受 N 影響 的程度，將兩者分別訂為 d 120.92 及 d 141.66，進而將 d130.65 歸屬 於 C-1'之訊號。因為 d 8.03 (1H, d, J = 8.1 Hz)及 d 7.34-7.38 (3H, m)與 C-7a 有 3JCH correlation，再加上受 N 的影響，所以將其分別歸屬於較 低磁場的 H-4 與較高磁場的 H-6 之訊號，進而將 d 7.19-7.29 (2H, m) 歸屬於 H-5, H-7 之訊號。再依據 HMQC 圖譜(圖 6-6)可以將四個三級 碳依序歸屬如下：d 110.26、d 121.17、d 126.70 分別為 C-7、C-4, 5、 C-6 之訊號。 綜合上述圖譜數據分析，初步判定化合物 6 為 3-(4-methyl phenyl)-1H-indazole 之結構。. - 21 -.
(22) I-4. 1-(Substituted benzyl)-3-(4-methylphenyl)-1H-indazole (7、9、 11、13、15、16、18)及 2-(substituted benzyl)-3-(4-methyl phenyl)-2H-indazole (8、10、12、14、17、19 - 21)之合成 I-4-1.合成方法： CH3. CH3. N. N. N. N. H. H. 6b. 6a EtONa , EtOH. R4. CH2Cl. R3. R2. CH3. CH 3. N N. N. +. N. CH 2 R2. H2C R3 R2. R4. R4. R3. 8,10,12,14,17,19,20,21. 7,9,11,13,15,16,18 化合物. R4. R3. R2. 化合物. R4. R3. R2. 7. Cl. H. H. 8. Cl. H. H. 9. H. Cl. H. 10. H. Cl. H. 11. H. H. Cl. 12. H. H. Cl. 13. CH3. H. H. 14. CH3. H. H. 15. H. CH3. H. 17. H. H. CH3. 16. H. H. CH3. 19. OCH3. H. H. 18. OCH3. H. H. 20. H. OCH3. H. 21. H. H. H. 取化合物 6 和各種取代的 benzyl chloride，在無水乙醇中，乙醇 鈉的存在下，進行 benzylation。再經管柱層析純化(氯仿/矽膠)後可得 由第一位氮上及第二位氮上接上含不同取代基之 benzyl group 的化合 物，而第一位氮上 benzylated 產物的產率皆比第二位氮上 benzylated 產物的產率多。此類化合物我們以 1-(4-methoxybenzyl)-3-(4-methyl - 22 -.
(23) phenyl)-1H-indazole (18)及 1-(4-methoxybenzyl)-3-(4-methylphenyl)2H-indazole (19)為例進行分析。 I-4-2.產物 18、19 之結構分析： 質譜(EIMS) (圖 18-1) (圖 19-1)： 化合物 18、19 EIMS 的斷裂型態皆相似，如 Fig. 8 所示，因為 N 上孤電子共振關係，加上陰電性較次甲基為大，使得 N 呈弱酸性較 易得電子，因此 4-methoxybenzyl group 更易失去電子而形成帶正電的 H2 C＋-C6 H4 -OCH3 ，所以從圖譜 18-1、19-1 可見到由 4-methoxybenzyl group 形成的基峰，m/z 121；而在高質量區可見到其互補離子 m/z 207。其它化合物都有相似的情形。由兩者分子離子峰(m/z 328)及元 素分析結果得知此兩化合物分子式皆為 C22H20N2O 與預期相符，因此 可判斷這兩種產物是 N-benzylated 之異構物。 CH3. CH3. 207 amu. N N. N. N. m/z 328. CH2. H2C 121 amu OCH3. OCH 3. 19. 18. Fig. 8 化合物 18：白色結晶，Rf 值(氯仿)為 0.68，熔點 66.3-69.1 ℃。 IR 圖譜： 如圖 18-2 所示，出現一些與預期結構相符的吸收峰。在 1611 -1 cm 、1512 cm-1 以及 1491 cm-1 有 C-C 及 C-N 環之吸收帶，在 1252 cm-1 有不對稱 C-O-C 之吸收帶，在 1027 cm-1 有對稱 C-O-C 之吸收帶。 UV 圖譜：在 232.8 nm、243.4 nm、313.8 nm 處有最大吸收。 - 23 -.
(24) 1. H-NMR (DMSO-d6) (圖 18-3)： 其積分值顯示此化合物有 20 個質子訊號。而由其化學位移、 偶合情形及氫-氫相關譜(DMSO-d6) (圖 18-4)，將各個質子訊號歸屬如 下：在最高磁場的 d 2.31 (3H, s)歸屬於 4'-CH3 之訊號，d 3.63 (3H, s) 為 4"-OCH3 之訊號。因受 N 的影響 N-CH2-的化學位移往較低磁場移 動，出現於 d 5.59 (2H, s)。其次，因受 4"-OCH3 的影響，H-3", 5"的 化學位移往較高磁場移動，出現於 d 6.81 (2H, d, J = 8.6 Hz)，再依據 氫-氫相關譜(圖 18-4)進一步將 d 7.24 (2H, d, J = 8.6 Hz)歸屬於 H-2", 6"之訊號。因受 4'-CH3 的影響，可將 d 7.28 (2H, d, J = 8.0 Hz)歸屬於 H-3', 5'之訊號；再依據氫-氫相關譜(圖 18-4)進一步將 d 7.87 (2H, d, J = 8.0 Hz)歸屬於 H-2', 6'。其餘之 H-4, 5, 6, 7 在此並不能確認位置，只 能獲得兩項訊息：H-4, 7 之訊號會受旁邊一個氫而成兩裂 (doublet)； H-5, 6 之訊號會受旁邊兩個氫而成三裂(triplet)。且從氫-氫相關譜中 可看出 d 7.18 (1H, dd, J = 7.5, 7.5 Hz)與 d 8.00 (1H, d, J = 8.2 Hz)有偶 合關係是相鄰的質子訊號，d 7.38 (1H, dd, J = 7.6, 7.6 Hz)與 d 7.68 (1H, d, J = 8.6 Hz)有偶合關係是相鄰的質子訊號。 13. C-NMR (DMSO-d6) (圖 18-5)： 顯示有 17 個碳原子訊號，由分子式得知有 22 個碳，所以推測有 5 組碳訊號重疊。初步判斷 d 21.12 歸屬於 4'-CH3 之訊號。 HMQC (DMSO-d6) (圖 18-6)： 依據碳與氫之相關性，將 d 51.76 歸屬於 N-CH2-之訊號，d 55.26 歸屬於 4"-OCH3 之訊號。 其餘的碳與氫之訊號需參照 HMBC (DMSO-d6) (圖 18-7)來做進 一步的確認。由 4'-CH3 遠程偶合關係，可將 d 129.80 歸屬於 C-3',C-5' 之訊號，d 137.51 歸屬於 C-4'之訊號，同時將 d 7.28 (2H, d, J = 8.0 Hz) 確定為 H-3', 5'之訊號，d 7.87 (2H, d, J = 8.0 Hz)確定為 H-2', 6'之訊 號，再依 H-2', 6'、H- 3', 5'之 1JCH - 3JCH correlation 關係將 d 127.08 歸屬 於 C-2', 6'之訊號 ，d 130.82 歸屬於 C-1'之訊號，d 143.02 歸屬於 C-3 之訊號。 由 4"-OCH3 遠程偶合關係，可將 d 159.02 歸屬於 C-4"之訊號， - 24 -.
(25) 同時將 d 6.81 (2H, d, J = 8.6 Hz)確定為 H-3", 5"之訊號，d 7.24 (2H, d, J = 8.6 Hz)確定為 H-2", 6"之訊號，再依 H-2", 6"、H- 3", 5"之 1JCH - 3JCH correlation 關係，將 d 114.20 歸屬於 C-3", 5"之訊號，d 129.16 歸屬於 C-2", 6"之訊號，d 129.60 歸屬於 C-1"之訊號。 由 N-C H2 -遠 程 偶 合 關 係 來 看 ， Fig. 9。 不 論 此 化 合 物是 N -benzylated 或 N2-benzylated 之產物，N-CH2-皆與 C-2", 6"和 1 個四 級碳(C-3 或 C-7a)有 3JCH correlation，若此四級碳是 C-3 之訊號，其必 定與 H-2', 6'有 3JCH correlation，但是從 HMBC 圖譜(圖 18-7)上發現這 四級碳訊號並沒有與 H-2', 6'有 3JCH correlation，反而是和 d 7.38 (1H, dd, J = 7.6, 7.6 Hz)與 d 8.00 (1H, d, J = 8.2 Hz)這兩個質子訊號有偶合關 係，另一方面從 H-2', 6'遠程偶合關係已將 d 143.02 歸屬於 C-3 之訊 號，因此進一步確認此 d 140.98 為四級碳 C-7a 之訊號。進而可將 d 7.18 (1H, dd, J = 7.5, 7.5 Hz)歸屬於 H-5 之訊號，d 7.38 (1H, dd, J = 7.6, 7.6 Hz)歸屬於 H-6 之訊號，d 7.68 (1H, d, J = 8.6 Hz)歸屬於 H-7 之訊號， d 8.00 (1H, d, J = 8.2 Hz)歸屬於 H-4 之訊號。再依據 HMQC 圖譜(圖 18-6)可以將四個三級碳依序歸屬如下：d 110.53、d 121.35、d 121.51、 d 126.61 分別為 C-7、C-4、C-5、C-6 之訊號。最後 d 121.28 之碳訊 號與 H-5(d 7.17)及 H-7(d 7.68)有 3JCH correlation，所以歸屬於 C-3a (隱 藏在 C-4 訊號 d 121.35 下)。 1. 綜合上述光譜數據分析，特別是 N-CH2-與 C-7a 有 3JCH correlation 之現象，足以判定化合物 18 之結構為 N1-benzyl isomer ~ 1-(4-methoxy benzyl)-3-(4-methylphenyl)-1H-indazole。. - 25 -.
(26) HMBC correlations 1 13 H C H-4 C-6, C-7a H-5 C-3a, C-7 H-6 C-4, C-7a H-7 C-3a, C-5 H-2", 6" -CH2-, C-6", 2", C-4" H-3", 5" C-1", C-5", 3", C-4"* H-2', 6' C-3, C-4', C-6', 2' H-3', 5' 4'-CH3, C-1', C-5', 3' 4"-OCH3 C-4" 4'-CH3 C-5', 3', C-4'* N-CH2 C-2", 6", C-7a. 5' 6' 4 5. 3a. 6. 7a 7. - 26 -. 3'. N2 N1 6". H2C. 1". 5" 4". 2". OCH3. 3". 化合物 18. 5' 6' 4 5. 3a. 6. 7a. *：2JCH correlation；其餘為 3JCH correlation.. Fig. 9. 1'. 3. CH 3. 2'. *： 2JCH correlation；其餘為 3JCH correlation.. HMBC correlations 1 13 H C H-4 C-6, C-7a H-5 C-3a, C-7 H-6 C-4, C-7a H-7 C-3a, C-5 H-2", 6" -CH2-, C-6", 2", C-4" H-3", 5" C-1", C-5", 3", C-4"* H-2', 6' C-3, C-4', C-6', 2' H-3', 5' 4'-CH3, C-1', C-5', 3' 4"-OCH3 C-4" 4'-CH3 C-5', 3', C-4'* N-CH2 C-6", 2", C-3. 4'. 3. 4'. 1'. 3' 2'. 7. N2 N1. CH2 1" 2". 6". 3". 5" 4". OCH3. 化合物 19. CH3.
(27) 化合物 19：白色結晶，Rf 值(氯仿)為 0.28，熔點 113.6-115 ℃。 IR 圖譜：如圖 19-2 所示，出現一些與預期結構相符的吸收峰。 UV 圖譜：在 232.8 nm、243.0 nm、313.8 nm 處有最大吸收。 1. H-NMR (DMSO-d6) (圖 19-3)： 其積分值顯示此化合物有 20 個質子訊號。而由其化學位移、偶 合情形及氫-氫相關譜(DMSO-d6) (圖 19-4)，將各個質子訊號歸屬如 下：在最高磁場的 d 2.37 (3H, s)歸屬於 4'-CH3 之訊號，d 3.66 (3H, s) 為 4"-OCH3 之訊號。因受 N 的影響 N-CH2-的化學位移往較低磁場移 動，出現於 d 5.50 (2H, s)。其次，因受 4"-OCH3 的影響，H-3", 5"的 化學位移往較高磁場移動，出現於 d 6.80 (2H, d, J = 8.7 Hz)； 再 依據氫-氫相關譜(圖 19-4)進一步將 d 6.97 (2H, d, J = 8.7 Hz)歸屬於 H-2", 6"之訊號。因受 4'-CH3 的影響，可將 d 7.35 (2H, d, J = 8.1 Hz) 歸屬於 H-3', 5'之訊號；再依據氫-氫相關譜(圖 19-4)進一步將 d 7.40 (2H, d, J = 8.2 Hz)歸屬於 H-2', 6'之訊號。其餘之 H-4, 5, 6, 7 在此並不 能確認位置，同化合物 18 只能獲得其訊號分裂模式、偶合常數及偶 合關係等資訊。 13. C-NMR (DMSO-d6) (圖 19-5)： 顯示有 18個碳原子訊號。初步判斷 d 21.15 歸屬於 4'-CH3 之訊號。. HMQC (DMSO-d6) (圖 19-6)： 依據碳與氫之相關性，將 d 53.47 歸屬於 N-CH2-之訊號，d 55.27 為 4"-OCH3 之訊號。 其餘的碳與氫之訊號需參照 HMBC (DMSO-d6) (圖 19-7a, 19-7b) 來做進一步的確認。由 4'-CH3 遠程偶合關係，可將 d 130.04 歸屬於 C-3',C-5'之訊號，d 138.74 歸屬於 C-4'之訊號，同時將 d 7.35 (2H, d, J = 8.1 Hz)確定為 H-3', 5'之訊號，d 7.40 (2H, d, J = 8.2 Hz)確定為 H-2', 6'之訊號，再依 H-2', 6'、H- 3', 5'之 1JCH - 3JCH correlation 關係將 d 126.41 歸屬於 C-1'之訊號，d 129.57 歸屬於 C-2', 6'之訊號，d 135.69 歸屬於 C-3 之訊號。 - 27 -.
(28) 由 4"-OCH3 及 N-CH2-遠程偶合關係，可將 d 128.65 歸屬於 C-2", 6"之訊號，d 158.87歸屬於 C-4"之訊號，同時將 d 6.80 (2H, d, J = 8.7 Hz) 確定為 H-3", 5"之訊號，d 6.97 (2H, d, J = 8.7 Hz) 確定為 H-2", 6"之訊 號，進而確認 d 114.13 為 C-3", 5"之訊號，d 129.26 為 C-1"之訊號。 從 HMBC 圖譜上無法直接得知剩餘的 2 個四級碳(C-3a、C-7a) 與 H(或 C)-4、5、6、7 之位移，但是受 N 陰電性的影響，會使 C-7a 往低磁場移動(d 147.70)，而 C-3a 往較高磁場移動(d 120.96)。進而將 d 7.03 (1H, dd, J = 7.5, 7.5 Hz)歸屬於 H-5 之訊號，d 7.26 (1H, dd, J = 8, 8 Hz)歸屬於 H-6 之訊號，d 7.49 (1H, d, J = 8.5 Hz)歸屬於 H-4 之訊號， d 7.62 (1H, d, J = 8.7 Hz)歸屬於 H-7 之訊號，再依據 HMQC 圖譜(圖 19-6)可以將四個三級碳依序歸屬如下：d 117.28、d 120.41、d 121.85、 d 126.27 分別為 C-7、C-4、C-5、C-6 之訊號。 綜合上述光譜數據分析，特別是 N-CH2-與 C-3 有 3JCH correlation 之現象，足以判定產物 19 之結構為 N2-benzyl isomer ~ 2-(4-methoxy benzyl)-3-(4-methylphenyl)-2H-indazole。. - 28 -.
(29) I-4-3. 化合物 18、19 之質子訊號與碳訊號之特徵： 從化合物 18、19 之 1H-NMR (DMSO-d6)圖譜的比較中發現 N1-benzylated 產物在較低磁場出現的質子訊號順序為 H-4 (d 8.00)、 H-2', 6' (d 7.87)、H-7 (d 7.68)。而 N2-benzylated 產物在較低磁場出現 的質子訊號順序為 H-7 (d 7.62)、H-4 (d 7.49)、H-2', 6' (d 7.40)。在其 它化合物都有相似的情形。這些質子訊號的特徵可做為其他衍生物結 構簡易判斷之參考。 從化合物 18、19 之 13C-NMR (DMSO-d6)圖譜的比較中發現 N1-benzylated 產物在 d 143.02-121.35 出現的碳訊號順序為 3、7a、4'、 1'、3a。而 N2-benzylated 產物在 d 147.70-120.96 出現的碳訊號順序為 7a、4'、3、1'、3a。此特徵也供其他衍生物判斷結構之參考。 化合物 6 根據文獻 30 是以兩種 isomer 的情況存在，而著者以化 合物 6 進行 benzylation 時也得到兩大類產物。但是著者進一步觀察 化合物 6 的 TLC 片(CHCl3)，卻只看的到一點，另外，在 1H-NMR (CDCl3) (圖 6a-3)較低磁場中可觀察到質子訊號順序為 H-4、H-2', 6'、 H-7，在 13C-NMR (CDCl3) (圖 6a-5)較低磁場中可觀察到碳訊號順序 為 3、7a、4'、1'、3a，與上述化合物 18、19 之質子訊號與碳訊號之 特徵做比較，發現化合物 6 是屬於 N1 類的化合物，因此著者認為在 以氯仿為溶媒的情況下，化合物 6 是以 6a 為主要結構存在。 I-5. 化合物 11 之氧化反應： 著者試將化合物 11 苯環上的甲基進行氧化及酯化反應如 Scheme 6 所示，形成 YD-3 的類緣物。不過都未能得到預期的化合物。 CH3. N. COOH. COOEt. a or b or c N. N. N. N. N. H 2C. H2C. H2C. Cl. Cl. Cl. 11. 23. Scheme 6 - 29 -. 24.
(30) 茲將所嘗試過的氧化反應簡述如下： a. 以 KMnO4 為催化劑，乙醇與水一定的比例 40,41(1:1 或 3:1，或完 全大量的水以增加催化劑與反應物之接觸)當溶媒進行氧化反 應。但反應性不佳，幾乎不反應，可能原因是反應物之溶解度非 常差。 b. 取化合物 11 (0.23 克；0.0007 莫耳)，以 N-bromosuccinimide (NBS) (0.63 克；0.0035 莫耳)與 benzoyl peroxide (0.024 克；0.0001 莫耳) 為催化劑，benzene (30 毫生)當溶媒進行反應。產物極度複雜。 c. 取化合物 11 (1 克；0.003 莫耳)，以 CrO 3 (1 克；0.01 莫耳)為催化 劑，水(1.5 毫生)與冰醋酸(9.6 毫升)為溶媒，加熱迴流進行反應 42。 產物複雜。 另一方面亦嘗試以化合物 11 (1 克；0.003 莫耳)為原料如 Scheme 7 所示，以 acetic anhydride (醋酸酐) (16 毫升)為溶媒企圖使反應於醛 的階段停止，再經 30 % H2SO4 進行氧化反應 43，結果產物複雜。而 其產率較多的中間體經管柱層析分離純化(氯仿/矽膠)及一維與二維 圖譜的確認，發現其並非為化合物 25 之結構而是化合物 1-(2-chlorobenzoyl)-3-(4-methylphenyl)-1H-indazole (22)。 CH(OCOCH3)2. N CH3. 30% H2SO4. N. N. (CH3CO)2O CrO3. N N. 95% C2H5OH. H2 C. N. CHO. H2 C. Cl. CH3. 25. 26. H 2C N Cl. N. 11. Cl. C O Cl. 22. Scheme 7 其結構解析如下： 化合物 22 為白色結晶，熔點 144.1-145.2 ℃。. - 30 -.
(31) 質譜( EIMS ) (圖 22-1)： 由其分子離子峰(m/z 346)及元素分析結果得知此化合物分子式 為 C21H15N2OCl。其基峰也從化合物 11 (圖 11-1)之 m/z 125(鄰位氯取 代的芐基)變成化合物 22 之 m/z 139(鄰位氯取代的苯甲醯基)，表示在 化合物 11 之次甲基部份可能氧化成酮。 IR 圖譜： 如圖 22-2 所示，比化合物 11 之 IR 圖譜(圖 11-2)在 1687cm-1 多了 C=O 之吸收帶，在 1388 cm-1 多了醯胺的 C-N 吸收帶，且出現一些與 預期結構相符的吸收峰。 UV 圖譜：在 245.8 nm 及 315.8 nm 處有最大吸收。 1. H-NMR (CDCl3) (圖 22-3)： 其積分值顯示此化合物有 15 個質子訊號。初步判斷在最高磁場δ 2.29 (3H, s)為 4'-CH3 之訊號，參考化合物 11 之 1H-NMR (CDCl3) (圖 11-3)，發現在高磁場的 N-CH2-訊號在此未見到，與化合物 11 相比對， 可初步將δ 7.89 (1H, d, J = 8.0 Hz)歸屬於 H-4 之訊號，而 H-7 因受 carbonyl group (C=O)的影響出現在較低磁場δ 8.55 (1H, d, J = 8.3 Hz)，δ 7.17 (2H, d, J = 8.0 Hz)歸屬於 H-3', 5'之訊號，δ 7.66 (2H, d, J = 8.2 Hz)歸屬於 H-2', 6'之訊號，再由氫-氫相關譜 (CDCl3) (圖 22-4)之 偶合關係來判斷，可知 H-5 之訊號在 δ 7.27- 7.39 (4H, m)之間，δ 7.55 (1H, dd, J = 7.5, 7.5 Hz)為 H-6 之訊號，δ 7.27-7.39 (4H, m)之其中 3 個 氫和 δ 7.50 (1H, dd, J = 7.5, 1.8 Hz)之 1個氫為 benzoyl group 上芳香環 的氫，而 H-6"因受 carbonyl group (C=O)的影響出現在較低磁場 δ 7.50 (1H, dd, J = 7.5, 1.8 Hz)，故 H-3", 4", 5"之訊號出現在 δ 7.27-7.39 (4H, m)。 13. C-NMR (CDCl3) (圖 22-5)： 顯示有 17 個碳原子訊號，由分子式得知有 21 個碳，故有 3 組碳 訊號重疊，其中 δ 129.5 為 3 個碳原子之訊號。初步判斷 δ 21.38 為 4'-CH3 之訊號。參考化合物 11 之 13C-NMR (CDCl3) (圖 11-4)，發現在 高磁場的 N-CH2-訊號在此未見到，而在最低磁場處多了 C=O 之訊 號，為 δ 167.17，表示在化合物 11 之次甲基部份可能氧化成酮。 - 31 -.
(32) HMQC (CDCl3) (圖 22-6)： 依據碳與氫之相關性，可將 δ 115.96 歸屬於 C-7 之訊號，δ 121.43 歸屬於 C-4 之訊號，δ 128.06 歸屬於 C-2', 6'之訊號，δ 129.63 歸屬於 C-3', 5'之訊號，δ 129.50 歸屬於 C-6、C-6"之訊號。 檢視 HMBC (CDCl3) (圖 22-7a, 22-7b)，由 H-7 之遠程偶合關係， 可將 δ 125.18、δ 125.32 歸屬於 C-3a、C-5 之訊號。由 H-4 之遠程偶 合關係，可將 δ 129.50、δ 140.72 歸屬於 C-6、C-7a 之訊號。由 4'-CH3 和 H-2', 6'之遠程偶合關係，可將 δ 139.69、δ 151.07 歸屬於 C-4'、C-3 之訊號。由 H-3', 5'之遠程偶合關係，可將 δ 128.68 歸屬於 C-1'之訊號。 由 H-6"之遠程偶合關係，可將 δ 131.19 歸屬於 C-4"之訊號。由 H-3", 4", 5"之偶合關係及共振誘導效應，可將 δ 126.35、δ 129.5 歸屬於 C-3"、C-5", C-6"之訊號，δ 131.96、δ 134.92 歸屬於 C-1"、C-2"之訊 號。 綜合上述光譜數據分析可判定產物 22 為 1-(2-chlorobenzoyl)- 3(4-methylphenyl)-1H-indazole 之結構。. - 32 -.
(33) I-6. 化合物 6 之氧化反應： 從上述化合物 11 之氧化反應並未得到預期的中間產物 25，而得 到在次甲基氧化的產物 22，這暗示著 N-benzylated 化合物之氧化會優 先在次甲基發生，甚至可能會 debenzylation 徒增產物之複雜性，於是 著者試以化合物 6 為原料直接進行氧化反應如 Scheme 8 所示： COOH. CH3 N. d. N H. N. CHO. 27. N. e H. 6 N N H. 28. Scheme 8. 著者試過下述兩種方法： d. 取化合物 6 0.8 克(0.004 莫耳)，以 CrO3 (1 克；0.01 莫耳)為催化 劑，水(1.5 毫生)與冰醋酸(9.6 毫升)為溶媒進行反應 42。得到一個 產率較多 Rf (氯仿)值為 0.67 之橘色針狀結晶(化合物 I)，熔點 194.8-196.7 ℃，由 EIMS (圖 I-1)顯示其分子量為 418，IR 圖譜(圖 I-2)在 1654 cm-1 有吸收可能有 carbonyl group， 1H-NMR (CDCl3) (圖 I-3)上只有 11 個質子訊號，目前尚未確認其結構。 e. 取化合物 6 5 克(0.024 莫耳)，以 acetic anhydride (62 ml)為溶媒， CrO 3 (9 克；0.09 莫耳)為催化劑，再經 30 % H2SO4 進行氧化反應 43 ，想將化合物 6 氧化成醛。產物極度複雜，未分離到純化合物。. 以上著者分別將化合物 6 及 N1-benzylated 之產物進行氧化反應， 企圖合成 3-phenylacetic acid 衍生物，結果都不順利，反應失敗的原 因可能是 N1-benzylated 之產物在氧化加熱的條件下容易發生 Ndebenzylation，從 EIMS 圖譜(如圖 18-1)上也可以發現 debenzylation 的現象。而一旦變成化合物 6 時，indazole 環上的 N-N lingkage 可能 會繼續被氧化而形成複雜的產物，這方面的反應尚待繼續深入探討。. - 33 -.
(34) 第二節 藥理活性試驗結果 I、抗血小板凝集活性 著者將所合成之化合物 6、N2-benzyl isomer (8、10、12、14、17、 19 - 21)及 N1-benzyl isomer (9、11、13、15、16)委託台灣大學醫學院 藥理學研究所鄧哲明教授測試其對 AA、collagen、thrombin 及 PAF 引發的血小板凝集之抑制活性。結果如 Table 3 及 Table 4 所示。 由 Table 3 及 Table 4 可發現化合物 6 和 N2-benzyl isomer (8、10、 12、14、17、20、21，除了化合物 19)對 AA 和 collagen 所引發的血 小板凝集反應之抑制活性皆比 N1-benzyl isomer (9、11、13、15、16) 強，但所有的化合物都不像 YD-3 對 thrombin 所引發的血小板凝集試 驗有選擇性的抑制作用。化合物 6 對 AA 所引發的血小板凝集試驗有 選擇性的抑制作用，其強度與 aspirin 相當，而理化性質顯然與 aspirin相差甚多，其抗血小板活性值得進一步探討。而化合物 10 及 21 對 AA 所引發的血小板凝集反應之抑制活性相當顯著，其強度分別相當 於 aspirin 之 4 倍與 10 倍，這兩個化合物在動物體內可能的代謝物都 是化合物 6，理化性質與 aspirin 迥異，因此著者認為化合物 10 與 21 之抗血小板活性也值得進一步的探討。 由 Table 3 之藥理結果可知，若在化合物 6 indazole 環之 N2 位置 接上有(無)取代之芐基能提升抑制 collagen 所引發的血小板凝集反應 之活性。. - 34 -.
(35) Table 3. The inhibitory effect of compounds (6、8、10、12、14、17、19 - 21) on platelet aggregation induced by thrombin, AA, collagen and PAF (in vitro). CH 3. N. CH3. N. CH 2 R2. N. R3. N. R4. H. 6. 8、10、12、14、17、19 - 21. Animal：rabbit. No. Conc. （ µM） YD-3 IC50（ µ M） Aspirin IC50（ µ M） Control 6. IC50 8. IC50 10. IC50 14. IC50 19 IC50. 300 100 30 10 (µM) 300 100 30 10 (µM) 300 100 30 10 3 1 (µM) 300 100 30 10 (µM) 300 100 (µM). AA. Aggregation ﹪ Collagen Thrombin PAF. -. 184.83. 212.36. 29.70. 164.04. -. -. 20.00. >270. >270. >270. 91.5±1.3. 89.8±1.2. -. -. -. Cl. H. H. H. Cl. H. CH3. H. H. OCH3. H. H. 85.4±2.6 >300 80.7±1.6＊ ＊ ＊ 88.8±0.9 >300 83.8±0.4＊ ＊ ＊ >300 81.7±1.6＊ ＊ ＊ 88.1±0.2＊ >300 68.1±1.2＊ ＊ ＊ 86.8±0.4＊ ＊ >300. 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 87.4±1.7 197.24 76.7±4.2＊ ＊ ＊ 88.3±0.5 >300 58.6±8.1＊ ＊ ＊ 83.9±2.1＊ 85.1±1.2＊ >300 59.7±4.6＊ ＊ ＊ 76.1±4.6＊ ＊ 87.8±2.0 >300 51.5±7.5＊ ＊ ＊ 81.8±0.4＊ ＊ ＊ >300. R4. R3. R2. -. -. -. 86.6±0.8 ＊＊＊. 0.0±0.0 3.0±2.6＊ ＊ ＊ 5.4±4.6＊ ＊ ＊ 78.8±2.0＊ ＊ 19.67 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 43.2±14.7＊ 82.4±0.8＊ ＊ 44.96 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 0.0± 0.0＊＊＊ 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 50.4±1.8＊ ＊ ＊ 78.1±0.9＊ ＊ ＊ 4.61 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 70.9±4.1＊ ＊ ＊ 82.5±0.7 54.99 50.8±2.3＊ ＊ ＊ 77.7±1.9＊ ＊ ＊ >300. - 35 -. 88.5±1.1 ＊＊＊. 0.0±0.0 19.4±8.1＊ ＊ ＊ 74.8±5.9＊ 83.9±1.7＊ 111.01 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 67.2±10.4 86.9±0.9 54.05 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 6.2±5.0＊ ＊ ＊ 76.5±2.7＊ ＊ ＊ 82.5±0.6＊ ＊ ＊ 17.97 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 78.4±2.9＊ ＊ 89.5±1.3 57.84 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 82.0±1.3＊ ＊ 192.07.
(36) Table 3. (continued ) 300 100 30 10 3 1 IC50 (µM) 21. Control. H. H. H. 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 4.0±3.2＊ ＊ ＊ 71.9±1.6＊ ＊ ＊ 1.69. 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 26.1±13.1＊ ＊ ＊ 67.1±4.5＊ ＊ ＊ 85.1±1.2 36.16. 80.2±1.5＊ ＊ ＊ 88.8±0.5 >300. 34.6±9.7＊ ＊ ＊ 85.1±1.5＊ 288.3. 88.5±0.6. 88.9±1.0. 93.7±1.7. 93.7±2.6. 100 H H Cl 90.6±3.9 5.4±4.6 1.1±0.9 80.6±4.8＊ 50 24.4±19.2＊ ＊ ＊ 41.6±11.1＊ ＊ ＊ ＊＊ ＊＊ 20 41.1±18.8 46.8±13.4 10 74.0±6.9＊ 58.8±16.4＊ ＊ ＊＊ 5 75.5±7.6 83.3±1.6 2 85.0±2.7 (µM) IC50 39.64 39.60 >100 >100 150 H H CH3 11.3±9.8＊ ＊ ＊ 1.1±0.9＊ ＊ ＊ 88.7±4.6 17 69.4±8.0＊ 100 13.2±11.5＊ ＊ ＊ 1.1±0.9＊ ＊ ＊ 50 37.0±17.1＊ ＊ 11.7±6.5＊ ＊ ＊ ＊ 20 57.0±17.1 53.0±12.9 ＊ 10 76.8±6.6 76.7±4.8 5 87.3±1.5 IC50 (µM) 61.43 34.21 >150 >150 ＊＊＊ ＊＊＊ 300 H OCH3 H 86.7±7.7 64.9±23.2 20 0.0±0.0 0.0±0.0 100 82.8±8.8 0.0±0.0＊ ＊ ＊ 1.1±0.9＊ ＊ ＊ ＊＊＊ ＊＊＊ 50 15.2±13.2 8.9±5.3 20 27.5±18.2＊ 30.3±16.3＊ ＊ ＊ ＊ ＊ 10 74.0±6.8 56.7±14.4 ＊ ＊＊＊ 5 71.3±8.5 72.7±3.5 ＊ ＊＊＊ 2 85.5±1.0 79.2±2.2 (µM) IC50 32.78 27.29 >300 >300 Platelets were incubated with tested sample or 0.5 ﹪DMSO at 37 ℃ for 1 min, then thrombin (0.1 U/ml), AA (100 µM), collagen (10 µg/ml) or PAF (2 ng/ml) was added to trigger the aggregation. Values are presented as mean ± S.E., ＊：P<0.05, ＊ ＊：P<0.01, ＊＊＊：P<0.001 12. ＊＊＊. - 36 -. ＊＊＊.
(37) Table 4. The inhibitory effect of compounds (9、11、13、15、16) on platelet aggregation induced by thrombin, AA, collagen and PAF (in vitro). CH3. N N H2C. R2. R4 R3. 9、11、13、15、16. Animal：rabbit. No. Conc. （ µM） YD-3 IC50（ µM） Aspirin IC50（ µM） Control. AA. Aggregation ﹪ Collagen Thrombin. PAF. -. 184.83. 212.36. 29.7. 164.04. -. 20.00. >270. >270. >270. 93.7±1.7. 93.7±2.6. R4. R3. R2. -. -. -. -. 88.5±0.6 ＊＊. 88.9±1.0 ＊＊＊. 300 H Cl H 83.5±10.0 81.3±9.5 65.7±7.7 47.6±14.8 ＊＊＊ ＊＊ 100 80.7±1.7 61.5±11.0 50 84.0±1.8＊ IC50 (µM) >300 >300 >300 >300 300 H H Cl 73.5±3.4＊ ＊ ＊ 60.7±15.4 80.7±7.4 83.2±7.5 11 ＊ ＊＊ 100 86.3±0.4 81.8±2.0 IC50 (µM) >300 >300 >300 >300 ＊＊＊ ＊ 300 CH3 H H 87.2±6.1 82.7±10.7 13 54.2±1.7 54.3±16.3 ＊＊＊ ＊ 100 79.4±1.1 76.9±5.2 50 84.5±0.6 IC50 (µM) >300 >300 >300 >300 ＊＊＊ ＊＊ 300 H CH3 H 83.5±9.2 79.5±8.8 15 66.1±2.9 42.4±18.0 100 85.1±2.3 81.5±2.9＊ ＊ (µM) IC50 >300 >300 >300 >300 150 H H CH3 77.7±2.2＊ ＊ ＊ 79.6±1.9 87.5±4.6 16 82.3±2.6＊ ＊ (µM) IC50 >150 >150 >150 >150 Platelets were incubated with tested sample or 0.5 ﹪DMSO at 37 ℃ for 1 min, then thrombin (0.1 U/ml), AA (100 µM), collagen (10 µg/ml) or PAF (2 ng/ml) was added to trigger the aggregation. Values are presented as mean ± S.E., ＊：P<0.05, ＊ ＊：P<0.01, ＊＊＊：P<0.001 9. - 37 -.
(38) II、 抑制血管增生之活性 為了確定所抑制的是癌細胞所新生的血管，因此著者將化合物 6、8、10、14、19、21 委託台灣大學醫學院藥理學研究所鄧哲明教 授，測試抑制 DNA 合成、抑制管柱生成及抑制血管增生之定量性活 性測試等三個藥理試驗來探討其對新生血管之抑制活性。 CH3. N N H. 6. CH3. N N. CH2 R2. R3 R4. 8 10 14 19 21. R4 =Cl R2 =R3 =H R3 =Cl R2 =R4 =H R4 =CH3 R2 =R3 =H R4 =OCH3 R2 =R3 =H R2 =R3 =R4 =H. II-1. 抑制 DNA 的合成 腫瘤細胞會釋放出 VEGF，促使內皮細胞分裂、複製，進行增殖， 形成新的血管。Fig. 10 - Fig. 12 為化合物 6、8、10、14、19、21 在 30 µM、10 µM、1 µM 濃度下，對 VEGF (10 ng/mL) 所引起之 DNA 合成之抑制活性。 - 38 -.
(39) 200. 150. 100. 50. 3. H-thymidine incorporation (% of basal). 250. 0 basal VEGF YD-3. 6. 8. 10. 14. 19. 21. 30 uM In vitro assay (inhibition of DNA synthesis). Human umbilical vein endothelial cells were incubated in the absence (basal and control) or presence of tested sample (YD-3、6、8、10、14、19、21), and then vascular endothelial growth factor (VEGF) was added (except for basal) to induce DNA synthesis, which was detected using [3 H]thymidine incorporation assay.. 250. 200. 150. 100. 50. 3. H-thymidine incorporation (% of basal). Fig. 10. 0 basal VEGF YD-3. Fig. 11. 6. 8. 10. 14. 19. 21. 10 uM In vitro assay (inhibition of DNA synthesis). Human umbilical vein endothelial cells were incubated in the absence (basal and control) or presence of tested sample (YD-3、6、8、10、14、19、21), and then vascular endothelial growth factor (VEGF) was added (except for basal) to induce DNA synthesis, which was detected using [3 H]thymidine incorporation assay. Means ± S.E. (n = 5) were presented. - 39 -.
(40) H-thymidine incorporation (% of basal). 3. 250. 200. 150. 100. 50. 0 basal VEGF YD-3. Fig. 12. 6. 8. 10. 14. 19. 21. 1 uM In vitro assay (inhibition of DNA synthesis). Human umbilical vein endothelial cells were incubated in the absence (basal and control) or presence of tested sample (YD-3、6、8、10、14、19、21), and then vascular endothelial growth factor (VEGF) was added (except for basal) to induce DNA synthesis, which was detected using [3 H]thymidine incorporation assay. Means ± S.E. (n = 5) were presented.. 在 30 µM 濃度下，化合物 6、8、10、14、19、21 對 DNA 合成 皆呈現明顯的抑制活性，約相當於 YD-3 之 5-14 倍。而當濃度為 10 µM 時，只有化合物 8、14、19 呈現明顯的抑制活性，約相當於 YD-3 之 3-5 倍，而化合物 6 和 YD-3 之抑制效果相當。當濃度降為 1 µM 時，化合物 8、14、19 較具有抑制活性，而化合物 10 和 YD-3 之抑 制效果相當，化合物 6 及 21 之抑制活性皆比 YD-3 為弱。由上可知， 在化合物 6 indazole 環之 N2 接上含有 Cl、CH3 或 OCH3 取代的芐基 基團能提升抑制 DNA 合成之活性，尤以對位取代之芐基基團為佳。. II-2. 抑制 tube(管柱)的生成 利用 VEGF 於 Human umbilical vein endothelial cells ( HUVEs； 人體臍帶靜脈內皮細胞)中作用，可使細胞重新組合進行分化作用形 成管柱的結構。而以化合物 6、8、10、14、19、21 處理後，由 VEGF 所誘導內皮細胞產生的分化作用可被阻斷其網狀結構，且由 MTT 試劑作染色，並拍照存證。結果如 Fig. 13 所示。. - 40 -.
(41) Fig. 13. 6. 8. 10. 14. 19. 21. In vitro assay (inhibition of tube formation). Human umbilical vein endothelial cells were cultured onto chamberslide, which was precoated with Matrigel (10 mg/ml). Cells were treated without (basal and control) or with tested sample (YD-3、6、8、10、14、19、21) and then vascular endothelial growth factor (VEGF) was added to induce tube formation. All pictures were taken at 100 × magnification.. 化合物 8、10、14、19、21 均具抑制管柱生成的作用，其抑制效 果皆勝於 YD-3，而其中以 8 及 14 抑制效果最為顯著。由上可知，在 化合物 6 indazole 環之 N2 接上含有 Cl、CH3、OCH3 取代的或無取代 的芐基基團能提升抑制管柱生成之活性。. - 41 -.
(42) II-3.抑制血管增生之定量性活性測試 血管增生，相對的血紅素含量也會增加。因此若化合物具有抑 制血管增生的活性，其所測出的血紅素含量會少於 VEGF 組(只加入 VEGF 誘發血管新生，未加化合物)的血紅素含量，做為定量性的活 性測試。Fig. 14 為化合物 6、8、10、14、19、21 對 VEGF 所誘導 之血管增生之抑制活性。 25. Hemoglobin (g/dL). 20. 15. 10. 5. 0 basal VEGF YD-3. 6. 8. 10. 14. 19. 21. 10 uM. Fig. 14. Quantitative analysis of angiogenic effect. Nude mice were subcutaneously injected with a Matrigel plug containing 150 ng/ml vascular endothelial growth factor (VEGF). Vehicle or tested sample (YD-3、6、8、10、14、19、21) was orally administrated into the mice. After a seven-day administration, the animals were euthanatized and the plugs were cut of the mice for the measurement of angiogenic effect using the hemoglobin concentration as the parameter by means of a hemoglobin detection kit (Sigma). Means ± S.E. (n = 3) were presented.. 在 10 µM 的濃度下，化合物 8、14 及 19 具有顯著的抑制血管 增生之活性，其相對強度與其在 10 µM 及 1 µM 濃度下抑制 DNA 合 成(Fig. 11 及 Fig. 12)的強度相呼應，故能更佳證明化合物 8、14 及 19 具有抑制血管增生之活性。化合物 10 與 YD-3 之效果相當，有輕 微促進血管增生之現象。然而化合物 6 及 21 卻有促進血管增生的現 象。 由上可知，在化合物 6 indazole 環之 N2 接上對位取代(Cl、CH3 或 OCH3)的芐基基團能提升抑制血管增生之活性。 - 42 -.
(43) III、細胞致毒活性 著者鑑於部份化合物具有抑制血管增生之活性，因此進一步探 討化合物是否會具有抗癌的活性。將合成之化合物 6、22、N2-benzyl isomer (8、10、12、14、17、19 - 21)及 N1-benzyl isomer (7、9、11、 13、15、16、18)委託本研究所林怡倩同學測試其對白血病癌細胞 (HL-60 cells)之細胞致毒活性。結果如 Table 5、6 所示。 由 Table 5 及 Table 6 可發現 N2-benzyl isomer (8、10、12、14、 17、19，除了化合物 21)之 IC50 值皆在 33-45 µM 之間。而 N1-benzyl isomer 之中，除了化合物 13 及 18 之 IC50 值分別為 5 µM 及 2.1 µM 之 外，其它化合物之 IC50 值皆大於 50 µM。另外，化合物 22 也顯示出 明顯的細胞致毒的活性，其 IC50 值為 20.6 µM。 由 上 可 知 ， N 2 -benzyl isomer 之 細 胞 致 毒 活 性 比 大 部 份 的 N1-benzyl isomer 還要強一點，這代表著 N2-benzyl isomer 比大部份的 N1-benzyl isomer 有較強的抗癌作用。而從化合物 11 氧化過程中意外 得到的化合物 22，其 IC50 值也提升至 20.6 µM，表示可能在細胞致毒 活性之構效關係中，N1-acyl 之官能基扮演著微妙的角色，這點值得 提供今後 SAR 研究之參考。. - 43 -.
(44) Table 5. Cytotoxic effect of compounds (6、8、10、12、14、17、19 21). CH3. N N. CH2 R2. CH3 N. R3. N. R4. H. 6. 8、10、12、14、17、19 - 21. Conc. ( µ M ) MTT assays ( ﹪) 0 100±0.1. No. Control. R4. R3. R2. 6. -. -. -. 50 25 10. 79.5±6.9＊ ＊ 102.7±5.2 96.0±10.5. IC50 > 50 µM 8. Cl. H. H. 50 25 10. 32.9±7.2 57.9±4.8＊ ＊ ＊ 92.6±7.2. IC50 = 36.1 µM 10. H. Cl. H. 50 25 10. 44.1±4.5＊ ＊ ＊ 72.4±3.3＊ ＊ ＊ 92.7±3.4＊ ＊. IC50 = 44.7 µM 12. H. H. Cl. 50 25 10. 30.0±4.8＊ ＊ ＊ 58.8±4.6＊ ＊ ＊ 78.1±6.1＊ ＊. IC50 = 33.0 µM 14. CH3. H. H. 50 25 10. 40.8±6.1＊ ＊ ＊ 71.9±2.0＊ ＊ ＊ 94.3±3.0＊. IC50 = 42.6 µM 17. H. H. CH3. 50 25 10. 41.9±2.4＊ ＊ ＊ 62.7±2.2＊ ＊ ＊ 84.6±2.4＊. IC50 = 40.9 µM 19. OCH3. H. H. 50 25 10. 33.1±2.0＊ ＊ ＊ 61.4±3.1＊ ＊ ＊ 87.4±4.1＊ ＊. IC50 = 36.3 µM 20. H. OCH3. H. 50 25 10. 28.9±1.3＊ ＊ ＊ 80.1±6.8＊ ＊ 99.6±5.0. IC50 = 39.2 µM 21. H. H. H. 50 25 10. 78.0±2.3＊ ＊ ＊ 103.0±4.4 108.2±0.2＊ ＊ ＊. IC50 > 50 µM HL-60 cells (1×105 /ml) were treated with tested sample for 24 hrs. Data was presented as mean ± SD ＊ ＊＊ ＊＊＊ from three separate experiments. ：P<0.05, ：P<0.01, ：P<0.001，compared with control.. - 44 -.
(45) Table 6. Cytotoxic effect of compounds (7、9、11、13、15、16、18、 22). CH 3. CH3. N N. N N. H 2C. C O R2. R4. Cl. R3. 7、9、11、13、15、16、18. 22. Conc. ( µ M ) MTT assays ( ﹪) 0 100±0.1. No. Control. R4. R3. R2. 7. Cl. H. H. 50 25 10. 89.0±3.2＊ ＊ ＊ 98.7±4.1 101.1±5.0. IC50 > 50 µM 9. H. Cl. H. 50 25 10. 70.00±8.5＊ ＊ 93.0±6.9 104.5±5.8. IC50 > 50 µM 11. H. H. Cl. 50 25 10. 57.6±7.6＊ ＊ ＊ 70.6±6.9＊ ＊ 85.6±0.7＊. IC50 > 50 µM 13. CH3. H. H. 50 25 10 5 2.5. 34.6±4.4＊ ＊ ＊ 37.9±5.7＊ ＊ ＊ 41.1±5.3＊ ＊ ＊ 50.4±5.9＊ ＊ ＊ 60.6±8.2＊ ＊ ＊. IC50 = 5 µM 15. H. CH3. H. 50 25 10. 54.4±1.7＊ ＊ ＊ 94.4±7.0 99.7±3.2. IC50 > 50 µM 16. H. H. CH3. 50 25 10. 73.8±3.3＊ ＊ ＊ 82.1±4.0＊ ＊ ＊ 96.4±1.2＊ ＊. IC50 > 50 µM 18. OCH3. H. H. 50 25 10 5 2.5 1. 18.8±1.4＊ ＊ ＊ 19.8±1.5＊ ＊ ＊ 23.3±2.5＊ ＊ ＊ 28.8±4.9＊ ＊ ＊ 39.7±1.5＊ ＊ ＊ 74.7±3.9＊ ＊ ＊. IC50 = 2.1 µM 22. -. -. -. 50 25 10 5 2.5. 29.9±1.4＊ ＊ ＊ 33.3±3.2＊ ＊ ＊ 93.7±2.3＊ ＊ 96.0±2.5＊ 103.6±1.6. IC50 = 20.6 µM HL-60 cells (1×105 /ml) were treated with tested sample for 24 hrs. Data was presented as mean ± SD ＊ ＊＊ ＊＊＊ from three separate experiments. ：P<0.05, ：P<0.01, ：P<0.001，compared with control.. - 45 -.
(46) 第三章. 結論. 著者以 3-(4-methylphenyl)-1H-indazole (化合物 6)為主要中間 體，採行有別於以往合成 YD-3 之方法，從事其衍生物的合成。得 到化合物 7 - 21，經由一維圖譜及二維圖譜確認，可分為兩類，一為 N1 取代的化合物~ 1-(substituted benzyl)-3-(4-methylphenyl)-1Hindazoles (7、9、11、13、15、16、18)；另一為 N2 取代的化合物~ 2-(substituted benzyl)-3-(4-methylphenyl)-2H-indazoles (8、10、12、 14、17、19 - 21)。並將這兩類化合物測試其抗血小板凝集活性、抑 制血管增生活性及細胞致毒活性。 在抗血小板凝集活性試驗中，兩類化合物(7 - 21)都不像 YD-3 對 thrombin 引發的血小板凝集有選擇性的抑制作用。大部份 N2 取代 的化合物(8、10、12、14、17、20、21)對 AA 及 collagen 所引發的 血小板凝集之抑制活性比 N1 取代的化合物(9、11、13、15、16)強。 另外，化合物 10 (IC50 = 4.61 µM)及 21 (IC50 =1.69 µM)對 AA 所引發 的血小板凝集之抑制活性相當顯著，更勝於化合物 6 (IC50 = 19.67 µM)。 在抑制血管增生活性試驗中，N2 取代的化合物(8、14 及 19)抑 制效果比化合物 6 及 YD-3 還要顯著。而 N1 取代的化合物之抑制血 管增生活性之試驗正在進行中。另外，在細胞致毒活性中，N2 取代 的化合物(8、10、12、14、17、19、20)其活性比化合物 6 及大部分 N1 取代的化合物(7、9、11、15、16)強。 因為 N2 取代的化合物不像 YD-3 對 thrombin 引發的血小板凝集 有選擇性的抑制作用，也因此未深入測試對 thrombin 引發的血管增 生是否具有抑制活性(YD-3 對 thrombin 引發的新生血管具有顯著的 抑制作用)，但從其明顯的抑制血管增生活性，著者認為其作用機轉 值得再深入探討。 由抑制血管增生與細胞致毒兩者藥理活性結果比較中發現，化 合物 8、14 及 19 雖然在細胞致毒活性中 IC50 值在於 36 - 43 µM 間， 但其活性比大部分 N1 取代的化合物(7、9、11、15、16，IC50 > 50 µM) - 46 -.
(47) 強，而在抑制血管增生活性中，化合物 8、14 及 19 之抑制效果相當 顯著。這些兼具抑制血管增生及細胞致毒活性的特性，在抗血管增 生的化合物是相當罕見的。 因此著者認為化合物 8、14 及 19 是頗具開發潛能的抗癌物質。 同時其類緣化合物的製備與抗癌活性之評估也是相當有意義的研究 方向。. - 47 -.
(48) 第四章. 實驗部份. 第一節 試藥 (一) 購自德國 E. Merck 公司者 Acetic anhydride, 98 % N-Bromosuccinimide, 98 % Chloroform-d1, >99.8 % Dimethylsulfoxide-d6, > 99.8 % Methanol Palladium 10% on activated carbon Triethylamine, > 99 % (二)購自美國 Acros 公司者 Benzene, 99 % Benzoyl peroxide, remainder water, 75 % Chromium (VI) oxide, > 99 % (三)購自英國 Lancaster 公司者 Benzyl chloride, > 99 % Hydrazine monohydrate, > 98 % (四)購自瑞士 Fluka 公司者 Natrium, 99.5 % (五)購自日本昭和化學株式會社者 Magnesium sulfate anhydrous Sulfuric acid, 97 % (六)購自日本關東化學株式會社者 Potassium permanganate, 99.3 %. - 48 -.
(49) (七)購自日本 Osaka 株式會社者 Sodium hydroxide, > 95 % (八)購自日本東京化成工業株式會社者 4-Chlorobenzyl chloride, > 98 % 3-Chlorobenzyl chloride, > 95 % 2-Chlorobenzyl chloride, > 98 % trans-Decahydronaphthalene, > 98 % 4-Methylbenzyl chloride, > 98 % 3-Methylbenzyl chloride, > 95 % 2-Methylbenzyl chloride, > 98 % 4-Methoxybenzyl chloride, > 97 % 3-Methoxybenzyl chloride, > 95 % 1-(N-Morpholino)cyclohexene, > 90 % p-Toluoyl chloride, > 97 % (九)購自台灣聯工試藥公司者 Acetic acid, glacial, > 99 % Hydrochloric acid, > 35 % Petroleum ether, > 90 % (十)購自景明化工股份有限公司者 Chloroform n-Hexane (十一)購自台灣省菸酒公賣局者 Ethanol, 95 %. - 49 -.
(50) 第二節 重要儀器 (一)熔點測定器(Melting Point Apparatus) 本實驗產物之熔點係採用 Yanaco MP-500D 熔點測定器測定，測 定範圍在 40-500 ℃，且溫度未經校正。 (二)紫外光-可見光光諸儀(UV-Visible Spectrophotometer) 紫外光-可見光光譜分析係採用 Shimadzu UV-Visible Recording Spectrophotometer 測定，使用氯仿為溶劑，最大吸收波長(λ max) 單位為 nm，以 logε表示 Molar absorptivity。 (三)紅外線光譜儀(Infrared Spectrophotometer) 紅外線光譜分析係採用 Spectrum One FT-IR Spectrometer 測定， 以溴化鉀粉末作為打錠稀釋劑，光譜單位為 cm-1。 (四)質譜儀(Mass Spectrophotometer) EIMS 以 VG platform II GC-MS instrument 測定，離子化電壓為 70 eV，單位為 m/z。(中國醫藥學院精密儀器中心)。 (五)元素分析 採用 Heraeus CHN-OS RAPID 元素分析儀(國科會中部貴重儀器 使用中心)測定，元素分析值皆在理論值± 4 %以內。 (六)紫外光燈(UV Equipment) 使用 CAMAG UV-Cabinet II 紫外燈觀察箱，備有短波長 254 nm 與長波長 366 nm 之光源。 (七)核磁共振光譜儀(Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer) 採用 Bruker Advance DPX-200 FT-NMR Spectrometer、 Bruker Advance DPX-400 FT-NMR Spectrometer (中國醫藥學院精密儀器 中心)及 Bruker Advance DPX-300 FT-NMR Spectrometer (國立成 功大學精密儀器中心)測定： 以δ(ppm)值表示其化學位移值，而以 TMS (tetramethylsilane) (δ= 0)為內部標準。偶合常數( J )以 Hz 為單位，並以 s 表單峰 - 50 -.
(51) (singlet)，d 表二重峰(doublet)，t 表三重峰(triplet)，q 表四重峰 (quartet)，m 表多峰(multiplet)，br 表寬峰(broad)，dd 表雙二重 峰(double doublet)，ddd 表參二重峰(double double doublet)。 (八)薄層色層分析(Thin-Layer Chromatography) 使用德國 E. Merck 公司出品之 pre-coated aluminium TLC sheets (sllica gel 60 F254, 20 × 20 cm, 0.2 mm layer thickness, Art.5554)。 (九)管柱色層分析(Column Chromatography) 以德國 E. Merck 公司出品之 Silica gel 60 (70 - 230 mesh)當充填 劑。. - 51 -.
(52) 第三節 各化合物之製備 (一) 3-(4-Methylphenyl)-1H-indazole (6)之合成 (a)秤取 1-(N-Morpholino)cyclohexene 33.4 克(0.2 莫耳)與 triethylamine 28 毫升溶於 100 毫升之氯仿置於 500 毫升之反應 瓶中，再秤取 4-methylbenzoyl chloride 26.42 毫升(0.2 莫耳)溶 於 40 毫升之氯仿，置於滴加管中，於 45 ℃下慢慢滴入前面之 溶液，繼續反應 3 小時；加入 20 %之鹽酸水溶液，加熱迴流 5 小時，將反應液冷卻，取氯仿層，以 50 毫升水洗 4 次，合併 氯仿層，以無水硫酸鎂脫水過濾後，減壓濃縮將氯仿去除，殘 餘溶液靜置冷卻後固體析出，收集固體並以石油醚清洗，乾 燥，可得 2-oxocyclohexyl 4-methylphenyl ketone (4)，21.2 克(產 率 49 %)，熔點：106.2-107.4 ℃。 (b)秤取化合物 4 13.01 克(0.06 莫耳)懸浮於 100 毫升之甲醇中，稍 微加熱直到溶解再降至室溫；取 4 毫 升 85 %之 hydrazine monohydrate (NH2 NH2.H2O)置於滴加管中慢慢滴入，反應 30 分 鐘，減壓濃縮至剩下約 35 毫升之溶劑，靜置冷卻後固體析出， 收集固體並以石油醚清洗，乾燥，可得 3-(4-methylphenyl)4,5,6,7-tetrahydro-1H-indazole (5)，12.39 克(產率 97 %)，熔點： 57.4-59.9 ℃。 (c)秤取化合物 5 12.3 克(0.058 莫耳)溶於 160 毫升之 transdecahydronaphthalene (trans-decalin)置於 500 毫升之反應瓶中， 再加入 2.7 克 10 %之 Pd/C，加熱迴流 24 小時，使用油浴鍋減 壓濃縮至剩下約 20 毫升之溶劑，趁熱加入 80 毫升之石油醚， 輕輕搖晃使溶劑與石油醚混合均勻，靜置冷卻固體析出，可得 3-(4-methylphenyl)-1H-indazole (6)，9.85 克(產率 82 %)。 化合物 6 的物理性質,光譜及數據如下: 熔點：63.1-65.2 ℃ MS (m/z)：208 (M+) IR (KBr) vmax：見圖 3-2 UV,λ max (CHCl3 ) nm (log e)：233.4(3.850) , 246.0(4.223), 311.6(4.251) 元素分析： 以 C14H12N2 計算 - 52 -.
(53) H% C% N% 計算值：5.81 80.74 13.45 實際值：5.75 80.70 13.40 1 H-NMR (d-chloroform, 200 MHz) d (ppm)： 2.47 (3H, s, 4'-CH3) 7.19-7.29 (2H, m, H-5, H-7) 7.34-7.38 (3H, m, H-6, H-3', 5') 7.93 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2', 6') 8.03 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-4) 13 C-NMR (d-chloroform, 50 MHz) d (ppm)： 21.33 (4'-CH3) 110.26 (C-7) 120.92 (C-3a) 121.17 (C-4、C-5) 126.70 (C-6) 127.60 (C-2', 6') 129.62 (C-3', 5') 130.65(C-1') 138.02 (C-4') 141.66 (C-7a) 145.68 (C-3). (二 ) 1-(4-Chlorobenzyl)-3-(4-methylphenyl)-1H-indazole (7)及 2-(4-chlorobenzyl)-3-(4-methylphenyl)-2H-indazole (8)之合成 秤取化合物 6 4.16 克(0.02 莫耳)溶於 30 毫升之無水乙醇，置於 反應瓶中，加入 0.92 克(0.04 莫耳)之乙醇鈉，在室溫下攪拌 1.5 小時；秤取 4-chlorobenzyl chloride 6.44 克(0.04 莫耳)置於滴加管 中慢慢滴入前面之溶液中，加熱迴流 1.5 小時，白色固體析出， 趁熱過濾並以氯仿多次清洗固體，取濾液減壓濃縮去除溶媒， 以管柱層析(矽膠)純化，以氯仿為沖提液，得化合物 7 (3.1 克， 產率 47 %)及化合物 8 (0.23 克，產率 3 %)。 化合物 7 的物理性質,光譜及數據如下: 熔點：79.9-82.3 ℃ MS (m/z)：332 (M+) IR (KBr) vmax：見圖 7-2 UV,λ max (CHCl3 ) nm (log e)：232.2(3.769), 244.6(4.079), 313.4(4.099) 元素分析： 以 C21H17N2Cl 計算 H% C% N% 計算值：5.15 75.78 8.42 實際值：5.13 75.74 8.41 1 H-NMR (d-chloroform, 200 MHz) d (ppm)： 2.35 (3H, s, 4'-CH3) 5.52 (2H, s, -CH2-) - 53 -.
(54) 7.06-7.28 (9H, m, aromatic-H) 7.79 (2H, d, J = 8.1 Hz, H-2', 6') 13 C-NMR (d-chloroform, 50 MHz) d (ppm)： 21.33 (4'-CH3) 52.26 (-CH2-) 109.34 (C-7) 121.08 (C-4) 121.59 (C-5) 122.13(C-3a) 126.48 (C-6) 127.38 128.48 128.85 129.52 130.61( C-1') 133.52 (C-4") 135.42 (C-1") 137.82 (C-4') 140.95 (C-7a) 144.52 (C-3) 化合物 8 的物理性質,光譜及數據如下: 熔點：107.4-109.5 ℃ MS (m/z)：332 (M+) IR (KBr) vmax：見圖 8-2 UV,λ max (CHCl3 ) nm (log e)：232.4(3.683), 244.8(3.996), 314.6(4.056) 元素分析： 以 C21H17N2Cl 計算 H % C% N% 計算值：5.15 75.78 8.42 實際值：5.10 75.69 8.38 1 H-NMR (d-chloroform, 200 MHz) d (ppm)： 2.45 (3H, s, 4'-CH3) 5.59 (2H, s, -CH2-) 7.01-7.32 (10H, m, aromatic-H) 7.57 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-4) 7.74 (1H, d, J = 8.7 Hz, H-7) 13 C-NMR (d-chloroform, 50 MHz) d (ppm)： 21.17 (4'-CH3) 53.38 (-CH2-) 117.13 (C-7) 120.23 (C-4) 121.09 (C-3a) 121.68 (C-5) 126.25 (C-1') 126.35 (C-6) 128.14 128.63 129.30 129.57 133.38 (C-4") 135.22 (C-1") 136.48 (C-3) 138.89 (C-4') 148.15 (C-7a). (三 ) 1-(3-Chlorobenzyl)-3-(4-methylphenyl)-1H-indazole (9)及 2-(3-chlorobenzyl)-3-(4-methylphenyl)-2H-indazole (10)之合成 秤取化合物 6 10.4 克 (0.05 莫耳 )、乙醇鈉 2.3 克 (0.1 莫耳 )、 3-chlorobenzyl chloride 16.1 克(0.1 莫耳)，比照化合物 7 之合成 方法，得化合物 9 (7.1 克，產率 43 %)及化合物 10 (0.76 克，產 - 54 -.
(55) 率 5 %)。 化合物 9 的物理性質,光譜及數據如下: 熔點：66.6-68 ℃ MS (m/z)：332 (M+) IR (KBr) vmax：見圖 9-2 UV,λ max (CHCl3 ) nm (log e)：233.2(3.797) , 245.4(4.09), 313.0(4.107) 元素分析： 以 C21H17N2Cl 計算 H % C% N% 計算值：5.15 75.78 8.42 實際值：5.09 75.68 8.39 1 H-NMR (d-chloroform, 200 MHz) d (ppm)： 2.32 (3H, s, 4'-CH3) 5.48 (2H, s, -CH2-) 6.98-6.99 (1H, m, H-4") 7.05-7.25 (8H, m, aromatic-H) 7.78 (2H, d, J = 8.1 Hz, H-2', 6') 7.92 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-4) 13 C-NMR (d-chloroform, 50 MHz) d (ppm)： 21.30 (4'-CH3) 52.24 (-CH2-) 109.27 (C-7) 121.09 (C-4) 121.56 (C-5) 122.09 (C-3a) 125.20 (C-4") 126.50 (C-6) 127.18 (C-6") 127.37 (C-2', 6') 127.87 (C-2") 129.49 (C-3', 5') 129.95 (C-5") 130.57 (C-1') 134.53 (C-3") 137.80 (C-4') 138.93 (C-1") 140.97 (C-7a) 144.56 (C-3) 化合物 10 的物理性質,光譜及數據如下: 熔點：98-100 ℃ MS (m/z)：332 (M+) IR (KBr) vmax：見圖 10-2 UV,λ max (CHCl3 ) nm (log e)：232.2(3.706), 244.2(4.007), 313.4(4.047) 元素分析： 以 C21H17N2Cl 計算 H % C% N% 計算值：5.15 75.78 8.42 實際值：5.13 75.72 8.41 1 H-NMR (d-chloroform, 200 MHz) d (ppm)： 2.37 (3H, s, 4'-CH3) - 55 -.
(56) 5.51 (2H, s, -CH2-) 6.86-7.29 (10H, m, aromatic-H) 7.50 (1H, dd, J = 8.4, 1.0 Hz, H-4) 7.67 (1H, dd, J = 8.7, 0.9 Hz, H-7) 13 C-NMR (d-chloroform, 50 MHz) d (ppm)： 21.36 (4'-CH3) 53.64 (-CH2-) 117.36 (C-7) 120.44 (C-4) 121.26 (C-3a) 121.91 (C-5) 125.08 (C-4") 126.39 (C-1') 126.58 (C-6) 127.10 (C-6") 127.95 (C-5") 129.51 (C-2', 6') 129.78 (C-3', 5') 129.96 (C-2") 134.59 (C-3") 136.79 (C-3) 138.84 (C-4') 139.13 (C-1") 148.37 (C-7a). (四 ) 1-(2-Chlorobenzyl)-3-(4-methylphenyl)-1H-indazole (11)及 2-(2-chlorobenzyl)-3-(4-methylphenyl)-2H-indazole (12)之合成 秤取化合物 6 10.4 克 (0.05 莫 耳 )、乙醇鈉 2.3 克 (0.1 莫 耳 )、 2-chlorobenzyl chloride 16.1 克(0.1 莫耳)，比照化合物 7 之合成 方法，得化合物 11 (7.3 克，產率 44 %)及化合物 12 (0.58 克，產 率 3 %)。 化合物 11 的物理性質,光譜及數據如下: 熔點：77.6-78.8 ℃ MS (m/z)：332 (M+) IR (KBr) vmax：見圖 11-2 UV,λ max (CHCl3 ) nm (log e)：232.4(3.659), 245.4(3.94), 312.6(3.995) 元素分析： 以 C21H17N2Cl 計算 H % C% N% 計算值：5.15 75.78 8.42 實際值：4.79 75.57 8.49 1 H-NMR (d-chloroform, 200 MHz) d (ppm)： 2.35 (3H, s, 4'-CH3) 5.69 (2H, s, -CH2-) 6.70-7.35 (9H, m, aromatic-H) 7.81 (2H, d, J = 8.1 Hz, H-2', 6') 7.96 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-4) 13 C-NMR (d-chloroform, 50 MHz) d (ppm)： 21.30 (4'-CH3) 50.00(-CH2-) 109.44 (C-7) - 56 -.
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