第四章 實驗材料與方法
4.3 試驗方法
4.3.1 藻類毒性試驗
在本研究中，密閉式月芽藻之毒性數據取自過去實驗室已建立的毒性資料庫，
試驗方法為本研究室發展之「48小時BOD瓶藻類毒性試驗」，其方法介紹如下：
(一) 試驗藻種
本研究中，採用植物性浮游生物，在分類上屬於綠藻綱(Chlorophceae）的月 芽藻 (Pseudokirchneriella subcapitata) ，其特徵為單細胞、成群體但不糾結、不 能移動，一般細胞體積為 40-60 μm3，體型呈半月型。U.S. EPA、ISO、OECD 及 APHA 等單位之藻類毒性試驗，皆使用此藻種做為標準試驗物種之一。本實驗之 月芽藻種購自於University of Texas, Austin。
(二)
培養基配製
本研究使用之培養基質為參考 U.S. EPA 使用之營養基質組成，配製方法如下：
將下列 1 ~ 7 的貯備液 (Stock Solution) 各加 1 ml 至含 900 ml 去離子水 中，再稀釋至 l 公升。接著以 0.l N 當量濃度的 NaOH 或 HCl 將營養基質之 pH 值調至 7.50±0.10，用錫箔紙包覆後置於 4 ℃冰箱中保存。
1. 硝酸鈉貯備液：溶解 12.750g NaNO3 於 500 ml 去離子水。
2. 氯化鎂貯備液：溶解 6.082g MgC12．6H2O 於 500 ml 去離子水。
3. 氯化鈣貯備液：溶解 2.205g CaCl2．2H2O 於 500 ml 去離子水。
4. 硫酸鎂貯備液：溶解 7.350g MgSO4．7H2O 於 500 ml 去離子水中。
5. 磷酸氫二鉀貯備液：溶解 0.522g K2HPO4 於 500 ml 去離子水中。
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6. 碳酸氫鈉貯備液：溶解 7.5g NaHCO3 於 500 ml 去離子水中。
7. 微營養鹽貯備液：溶解下列所有藥品於 500 ml 去離子水中。
92.760 mg H3BO3 0.714 mg CoC12．6H2O 207.690 mg MnCl2．4H2O 3.630 mg Na2MoO4．2H2O 1.635 mg ZnC12 0.006 mg CuCl2．2H2O 79.880 mg FeC13．6H2O 150 mg Na2EDTA．2H2O
其中微營養鹽貯備液中，EDTA 分別有 100%、10%及 0%三種。100%是使用於 活化藻類時，而在連續式母槽中培養藻類時使用 10%，進行實驗時則使用不含 EDTA 之貯備液。最後配成之營養基質，其所含巨量及微量營養素濃度列於表 4.3.1及表 4.3.2。營養基質的滅菌是以 0.45 µm 的濾膜過濾，過濾滅菌後的營 養基質須保存在 4 ℃ 且置於陰暗無光線照射處，以避免產生光化學反應。
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(三) 實驗前準備工作
連續式藻類培養與保存
實驗物種 Pseudokirchneriella subcapitata 在進行實驗前必須經過 2~7 天的 預培養，使之平均細胞體積 (mean cell volume) 達到 39-46μm3，而藻類細胞數 量達到 1.9~2.0×106 cells/mL，在此條件下才取藻液進行實驗。在培養藻類最需 注意的步驟為微營養鹽貯備液的加入方法，一開始活化藻類加的是stock1 (100％
EDTA)，而在連續式母槽中培養藻類時使用的是stock2 (10％ EDTA)。此外液態 營養基質中之藻類可在 4 ℃下保存四個星期，於四個星期之後做移植以繼續培 養保存菌種。實驗條件依據 Lin[21, 34]所決定之適當的條件下進行，條件如下：
(1) 溫度：藻類之培養及毒性試驗皆在24 ± 1℃下進行。
(2) 光度：藻類之培養及毒性試驗皆在光度為 4300 ±10% Lux 下進 行，所使用之光源為連續白冷光。
(3) HCO3 濃度：15 mg/L。
(4) pH：初始 pH 為 7.50 ± 0.01。
(5) EDTA 含量： 100% 是使用於活化藻類時，而在連續式母槽中培 養藻類時使用 10% ，進行實驗時則使用不含EDTA 之貯備液。
(6) 試驗時間：48 hr。
(7) 藻類初始植種密度：1.5 × 104 cells / ml。
(8) 振盪頻率：100 rpm
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(四) 密閉式藻類毒性試驗方法及步驟
1. 實驗方法
在進行藻類毒性實驗前，先查尋過去是否有學者亦是以藻類進行毒性試驗，
並參考其實驗結果，接著以文獻中所記載之濃度，於實驗前進行配製。若查無以 藻類進行毒性試驗的資料時，則以文獻中的實驗數據與本實驗室過去實驗數據之 間的關連性，進行實驗毒物濃度的預測。每次所進行之藻類毒行試驗均包括無添 加毒物的控制組，以及添加七種不同濃度的處理組，進行三重覆的分析。最終分 別以溶氧、藻類顆粒數、以及生長率，做為觀測終點 (End point)，並利用Probit 模式計算出各種毒物對藻類所造成 50% 抑制時的濃度 (EC50)。
2.
實驗步驟
本藻類試驗屬於四十八小時的急毒性試驗，圖4.3.1為密閉式藻類毒性試驗 流程暨裝置示意圖。以下針對實驗進行之步驟1 ~ 8即為尋找EC50範圍的實驗程序
（range-finding test），而實驗步驟 9為確定試驗（definitive test）：
(1) 當確定連續式培養母槽穩定之後，即可以開始進行藻類毒性試驗。毒性試 驗之營養基質為參考 U.S. EPA 標準方法，而後修改濃度配製。
(2) 將自行設計之去離子水曝氣設備裝滿的去離子水，裝完後用 NaOH 調整 pH 值至 7.50± 0.01，氣體鋼瓶進行曝氣 15 分鐘 (如圖 4.3.2)。曝氣的目的是 為了降低營養基質中之溶氧值並增加其 CO2濃度。經過 5 ~ 6 分鐘的曝氣 後，溶氧值可接近 1.0 mg/L。迅速將下口瓶之蓋子蓋上。
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(7) 在量測完溶氧值後，量測每個 BOD 瓶的 pH 值以了解 pH 的變化。
(8) 緊接著用顆粒計數器量測每個 BOD 瓶的藻類細胞密度，由此計算藻類之 生長率，並使用 Probit model 求得以藻類細胞密度為試驗終點時之 EC50值。
同樣的利用淨溶氧變化值及毒性物質濃度即可由 Probit model 分析求得此
毒性物質以溶氧為試驗終點之 EC50值。
(9) 重複步驟(1)-(8)，只不過在步驟 3 的毒物濃度範圍隨著之前 Range finding 結果調整毒物濃度，以得到更精確的濃度-反應曲線及 EC50值。
圖 4.3.1：密閉式藻類毒性試驗流程暨裝置示意圖